基于高通量測序的煙草根黑腐病根際土壤微生物群落結構分析

摘 要：煙草根黑腐病是一種由根串珠霉[ Thielaviopsis basicola "（Berk. et Br.） Ferr.]引起的真菌病害，當環境條件適宜時，殘留在土壤中的病原菌會侵染煙草植株根部導致病害的發生。本研究旨在調查煙草根黑腐病侵染煙草后土壤理化性質的差異，以及利用16S rRNA和ITS高通量測序結合來研究根際微生物群落的種類和結構的變化。結果表明，感病土壤的pH變化不顯著，SOC、TN、ALN、MBC和MBN顯著降低，AP和AK含量顯著升高，感病土壤的脲酶、過氧化氫酶和硝酸鹽還原酶含量顯著下降。在門水平上，健康植株和發病植株根際土壤微生物組成相似，但相對豐度存在顯著差異。其中發病后植株根際土壤中 Bacteroidota、Desulfobacterota、Firmicutes、RCP2-54、NB1-j、Latescibacterota、Patescibacteria和Verrucomicrobiota的豐度下降。在屬水平上，感病土壤中Sphingomonas、Gemmatimonas、SC-I-84、A21b、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、 Pseudarthrobacter、 Bacillus和MND1 的豐度下降。此外，感病土壤中代謝活動更加活躍。相關性分析表明細菌微生物中subgroup_2、Solibacter、Ellin6067和Bryobacter與感病土壤呈正相關。研究結果為探明煙草根黑腐病發生的微生態機制及，為病害的防控提供理論基礎。

關鍵詞： 煙草根黑腐病； 根際微生物； 理化性質； 高通量測序

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A 文章編號：0488-5368（2025）01-0096-08

Analysis of Black Root Rot Rhizosphere Microbial Community Structure in Tobacco Based on High-Throughput Sequencing

TAN Jiaqi， LONG Fei， YUAN Ye， LIU Lu， WU Lili， HAN Ying， DU Hongbo

（Nanzheng Branch of Hanzhong Tobacco Company， Hanzhong， Shaanxi 723100， China）

Abstract：" Tobacco black root rot is a fungal disease caused by Thielaviopsis basicola （Berk. et Br.） Ferr. Under favorable environmental conditions， residual pathogenic fungi in the soil can invade tobacco plant roots， leading to disease development. This study aimed to investigate the changes in soil physicochemical properties and the composition and structure of rhizosphere microbial communities after tobacco black root rot infection， using high-throughput sequencing of 16S rRNA and internal transcribed spacer （ITS）. The results showed that the pH of diseased soil remained stable， whereas Soil organic carbon （SOC）， total nitrogen （TN）， alkaline nitrogen （ALN）， microbial biomass carbon （MBC）， and microbial biomass nitrogen （MBN） decreased significantly. Additionally， AP and AK content increased significantly in diseased soil， while the levels of urease， hydrogen peroxidase， and nitrate reductase decreased significantly. At the phylum level， the composition of rhizosphere soil microbes in healthy and diseased plants was similar， however， the relative abundances differed substantially. Following disease onset， the rhizosphere soil exhibited reduced abundances of Bacteroidota， Desulfobacterota， Firmicutes， "RCP2-54， NB1-j， Latescibacterota， Patescibacteria， and Verrucomicrobiota. At the genus level， diseased soil showed a decline in the abundances of genera such as Sphingomonas， Gemmatimonas， SC-I-84， A21b， Bryobacter， Candidatus Solibacter， Pseudarthrobacter， Bacillus， and MND1. "Furthermore， metabolic activity was enhanced in diseased soil. Correlation analysis indicated a positive correlation between subgroup_2， Solibacter， Ellin6067， Bryobacter， and diseased soil. The results of this study contribute to understanding the microbial ecological mechanisms behind tobacco black root rot and provide a theoretical basis for disease prevention and control.

Key words： Tobacco black root rot; Rhizosphere microbiota; Physicochemical properties; High-throughput sequencing

由根串珠霉[ Thielaviopsis basicola （Berk. et Br.） Ferr.]侵染煙草引起的煙草根黑腐病是我國煙草主要根部病害之一，也是世界性煙草病害^[1]。常與煙草黑脛病復合發生，使得該病具有易混淆、難防治、危害重等特點^[2]。近年來該病在我國局部地區發生頻率發病趨勢與為害程度呈上升趨勢，已成為煙草主要病害^[3]。煙草根黑腐病主要通過侵染煙草根部，破壞根系結構和代謝功能，導致根系發育不良和生長緩慢，最終影響煙草的產量和品質。一些研究表明，煙草根黑腐病發生的土壤中，病原菌的數量增加，而益生菌的數量減少，導致土壤微生物群落失衡，從而加重病原菌的侵染更加容易^[4]。目前防治煙草根黑腐病的方法包括化學防治、生物防治、土壤改良和煙草抗病品種選育等^[5]。越來越多的研究表明生物防治和土壤改良等綠色防控技術可有效預防煙草根黑腐病發生，并且可促進煙草的生長發育^[6，7]。

植物病害的發生與土壤系統中的微生物菌群及多樣性的變化具有一定的相關性^[8，9]。土壤微生物在土壤功能和健康方面發揮著重要作用，其中包括抵御植物病原體的能力^[10]。植株的健康狀況能夠靈敏地反映在根際微生物群落結構上，表現為其多樣性和均一性的差異^[11]。在抑病土壤中，一些根際微生物保護易感作物免受某些植物病原體的侵害，而有利于疾病發生的土壤則不能提供保護，并允許病原體的傳播^[12]。另有研究表明，病害的侵染能夠改變植物根際土壤微生物菌落的多樣性，從而利于自身的入侵并增強利用寄主營養的能力^[13]。

本研究利用高通量測序技術來研究煙草根黑腐病侵染的煙草根際土壤與健康煙株根際土壤細菌和真菌的多樣性差異。此外，還分析了土壤理化特性、酶活等指標。旨在從分子水平揭示煙草根黑腐病對煙草根際土壤微生物群落結構及多樣性、土壤酶活等方面的影響，為煙草根黑腐病的綠色防控提供更多的生物控制資源。

1 材料與方法

1.1 田間病害調查

發病率和病情指數計算公式如下：

發病率（%）=（發病株數/調查總株數）×100

病情指數=∑［（各級病株×該病級值）/（調查總株數×最高級值）］×100

1.2 取樣地概況

取樣地塊為陜西省漢中市南鄭區新集鎮二門村，土壤質地為黃壤土，常年連作當地主栽品種云煙97，煙草根黑腐病頻發頻感。采樣區域為同一片區煙田，土壤肥力均勻，地塊平整。

1.3 土壤取樣

選取3個小區，分別將健康煙株與感病煙株整株挖起，采用抖根法收集煙株根系表面土壤。健康、感病土壤樣品分別混勻后各分成兩份，一份用于土壤細菌及真菌高通量測序，一份用來測定土壤理化性質，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 土壤理化性質的測定

土壤pH值用電位法（FE28-Meter）測定的；土壤有機碳（SOC）和總氮（TN）分別用重鉻酸鉀氧化能力法（vario Macro cube）和硫酸-加速器煎煮法（KjeltecTM 8400）估算；采用半微量凱達爾擴散法來測量堿性水解氮（ALN）；土壤中的可利用鉀（AK）和磷（AP）分別采用醋酸銨浸出-火焰光度法（PinA Aciie 900F）和土壤快速磷含量法，即碳酸氫鈉浸出+鉬銻比色法（UV-2450）進行評估；土壤中的微生物生物量碳（MBC）和氮（MBN）采用氯仿熏蒸提取法（TOC-VCPH；MBC和Auto Analyzer 3-AA3；MBN）測定[14～16]。

1.5 土壤酶活性的測定

土壤酶的活性是用南京建城生物工程研究所的試劑盒進行測定的。具體是采用不同的比色法估計土壤中尿素酶（URE；苯酚鈉-次氯酸鈉法）、蔗糖酶（INV；3，5-二硝基水楊酸法）、酸性磷酸酶（ACP；苯磷酸鈉法）和硝酸鹽還原酶（NR；苯酚-二磺酸法）活性。同樣，過氧化氫酶（CAT）的活性采用紫外分光光度法測定^[17]。

1.6 DNA提取、PCR擴增和Illumina MiSeq測序

使用E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒（Omega Bio-Tek， USA）從0.5 g土壤樣品中提取微生物總DNA，并進行純化。利用NanoDrop和瓊脂糖凝膠電泳測定進行提取出的DNA的質量和濃度進行測定。隨后將提取的DNA用無菌水稀釋到1 ng/L的濃度，并以此依此作為模板，用通用引物343F（5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'）和798R（5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）^[18]，采用Takara Ex Taq（Takara，中國）進行16S rRNA基因V3-V4可變區域的PCR擴增。16S擴增子的測序和分析由OE生物技術有限公司進行 （OE Biotech， Shanghai， China）。使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina， USA）來生成測序文庫。最后，在Illumina NovaSeq6000平臺上對該文庫進行測序，每個文庫有兩個250個堿基的雙端讀循環。

1.7 數據處理與分析

利用QIIME2（Quantitative Insights into Microbial Ecology version 2）系統對提交的原始數據進行過濾、修剪并去除檢測到的嵌合序列。首先，使用QIIME2平臺選擇每個擴增子序列變體（ASV）的代表性讀數^[19]。其次，使用q2-feature-classifier的默認配置對一組有代表性的讀數進行注釋并與Silva數據庫（https：//ftp.arb-silva.de）進行比對。最后，在云平臺（https：//cloud.oebiotech.cn/task/）上進行了分析操作，如α和β多樣性分析和微生物多變量統計分析。基于Bray-Curtis距離，利用主坐標分析（PCoA）來可視化微生物菌落構成的變化。使用 \"betadisper \"和 \"adonis \"函數，進行了多元方差分析（PERMANOVA）以比較各處理之間的差異。使用 LEfSe 軟件進行LEfSe 分析，默認設置 LDA Score 的篩選值為 4。使用PICRUSt2（Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）算法對細菌群落進行功能注釋和分析^[20]。

數據運用 Microsoft Excel 2017 和 SPSS 22.0 軟件進行分析，采用 Duncan方法進行顯著性差異檢驗（ P lt;0.05），并使用Origin 2017進行繪圖。

2 結果

2.1 根黑腐病對煙草土壤理化性質的影響

由表1可知，與健康土壤相比，感病土壤的pH變化不顯著，SOC、TN、ALN、MBC和MBN顯著降低。但是，在感病土壤中AP和AK含量顯著升高。說明病害影響了煙草根際土壤的理化性質，從而影響煙草根系對營養的吸收。

2.2 根黑腐病對煙草土壤酶活性的影響

由表2可知，根黑腐病對煙草根際土壤酶活性有不同程度的影響。與健康土壤相比，感病土壤的脲酶、過氧化氫酶和硝酸鹽還原酶含量顯著下降。蔗糖酶和酸性磷酸酶的含量變化不顯著。

2.3 根黑腐病對煙草根際土壤微生物多樣性的影響

在門水平Top15上，健康土壤與感病土壤的微生物群落組成存在較大差異。如圖1A所示，感病土壤中 Bacteroidota、Desulfobacterota、Firmicutes、RCP2-54、NB1-j、Latescibacterota、Patescibacteria和Verrucomicrobiota的豐度下降。在屬水平 Top15上，感病土壤中 Sphingomonas、Gemmatimonas、SC-I-84、A21b、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、Pseudarthrobacter、Bacillus和MND1 的豐度下降（圖1）。

土壤微生物α多樣性分析表明，感病土壤中細菌ACE數量升高，Chao1指數增加，Simpson指數和Shannon指數下降，但是均不表現顯著性（ P lt; 0.05）。相反，感病土壤中真菌ACE數量下降，Chao1指數下降，Simpson指數和Shannon指數上升，但是均不表現顯著性（ P lt; 0.05）。

采用Bray-Curtis相似性指數法考察ASV水平下細菌β多樣性的p值差異。結論中 p lt;0.05據有統計學意義。R2值表示亞組中樣本間差異的解釋程度。如圖2所示，主坐標分析（PCoA）顯示了土壤樣品的分離程度。多變量方差分析（PERMANOVA）的結果表明，根黑腐病侵染煙草顯著改變了土壤細菌群落（ P "lt; 0.01）。此外，ADONIS統計顯示，不同組間的R2值為0.17。

2.4 根際土壤微生物多樣性的差異分析

采用Wilcoxon算法計算感病煙草根際土壤微生物差異的統計學意義，默認篩選標準為 P ＜0.05。結果表明，在前10個微生物屬中，有益屬的相對豐度，如SC-I-84、RCP2-54、Dongia、Luedemannella、KF-JG30-C25和Reyranella在感病系統中比在對照系統中顯著下調（ p "lt; 0.05）（圖3）。為了揭示土壤微生物群落中差異性物種的組成，采用線性判別分析（LEfSe）得到支系圖，并計算差異性代表ASVs的線性判別分析（LDA）得分，以確定貢獻大小，默認的LDA閾值被設定為3.0（ P lt; 0.01）（圖4）。結果顯示，在感病土壤系統中，Oxalobacteraceae、Massile、Thermoleophilia、Gaiellales和KF-JG30-C25是代表性最高的微生物群。相反，SC-I-84、Dongiales、RCP2-54、KF-JG30-B3和Reyranellales是對照系統中最豐富的微生物群。這些結果共同表明，土壤細菌群落組成的變化與病原菌侵染有關。

2.5 根際土壤微生物菌落的相關性分析

對相對豐度前 30 位的細菌屬相對豐度進行斯皮爾曼遜（Spearman）相關性分析（圖5）。結果表明， Gemmatimonas與Sphingomonas、Flavisolibacter高度正相關，Nitrospira與Haliangium、Anaeromyxobacter，Bacillus與MND1、Subgroup_22、Dongia高度正相關，MND1與Bacillus、RCP2-54、Dongia 高度正相關等。

2.6 土壤微生物群的功能預測分析

為了確定微生物群落的預測代謝功能，使用PICRUSt工具，根據16S rRNA基因序列對已確定的ASVs進行KEGG功能預測。結果如圖6A所示，KEGG差異代謝通路在感病樣本中顯著上調表達，比如代謝通路、次級代謝合成、多種環境微生物代謝、氨基酸代謝和碳代謝（ P lt;0.05），表明代謝活動更加活躍。COG注釋分析結果表明，多個通路在感病樣本中顯著上調表達，比如核糖核酸酶HIII、DNA結合反應調節因子、核苷-二磷酸-糖環合酶、阿拉伯糖外流滲透酶、Pimeloyl-ACP甲酯羧酸酯酶、NAD（P）依賴性脫氫酶（圖6B）。

2.7 不同土壤類型種植模式下土壤理化性質和細菌群落之間的相互關系

冗余分析（RDA）描述了細菌組成、土壤理化指標和土壤樣品之間的相關性，揭示了環境變量對土壤細菌群落的影響為86.3%，第一軸和第二軸的數據變化分別為74%和12.3%（圖7A）。環境變量對土壤真菌群落的影響為86.7%，第一軸和第二軸的數據變化分別為74%和12.7%（圖7B）。此外，感病煙草與AK，AP和INV因子相關，其他的土壤因子與健康土壤相關。細菌微生物中subgroup_2，Solibacter，Ellin6067和Bryobacter與感病土壤呈正相關，SC-I-84，Sphingomonas和Koribacter與健康土壤呈正相關。

3 討論

根際最接近根，是植物與土壤生物相互作用的動態區域，該區域內高水平的營養物質、水和根際分泌物可以吸引多種不同的微生物，其中大量的微生物也參與了土壤與植物之間的相互作用，與植物的生長、健康和生產力有關[21，22]。在根際，微生物群落是多樣化的，這意味著不同類型的微生物種群具有不同的作用^[23]。土壤中富含各種真菌和細菌，它們作為有益微生物或病原體，在植物的適合度和作物性能中發揮重要作

用^[24]。不同的植物物種可以通過植物—土壤反饋改變土壤微生物群落的組成，這些反饋可以塑造植物根際群落組成和生態系統功能[25，26]。

根際土壤微生物與土傳疾病的發生密切相關，病原菌的入侵可以改變植物土壤和內生菌微生物群落的組成^[27]。本研究利用Illumina NovaSeq6000測序平臺對健康煙草植株和根黑腐病侵染的煙草植株的根際土壤細菌和真菌菌落進行測序。結果表明，在煙草根黑腐病原菌侵染后，部分真菌的相對豐度發生了顯著變化，其中真菌群落多樣性低于健康煙草植株。這一結果與西洋參的研究相似，即發生根黑腐病時，根際土壤真菌的種類和多樣性指數均明顯下降^[28]。但是，細菌的相對豐度顯著增加，推測這些細菌可能與病原體建立了互惠互利的關系，并參與了病原體的入侵過程。有趣的是，在黃連和黃精相關的研究中，發現患病植株根際土壤細菌和真菌豐富度及多樣性都要高于健康植株，因此，病原菌對于土壤微生物多樣性的影響仍然會因植物種類的不同而有所差別[29，30]。此外，在感病土壤中，有益菌屬 Sphingomonas、Gemmatimonas、SC-I-84、A21b、Bryobacter、Candidatus_Solibacter、Pseudarthrobacter、Bacillus和MND1 的豐度下降。尤其是Bacillus，被認為是一類重要的根際有益菌，容易在土壤中定殖和繁殖，在土壤的物質和能量循環中發揮重要作用，其代謝產物不僅能夠有效抑制病害而且能促進植物的生長發育^[31]。因此，表明在煙草根黑腐病原菌侵染的土壤中有益菌的減少，病原菌的增加，會導致土壤致病性增強，打破了根際土壤微生物的平衡，繼而導致煙草患病加重。

土壤理化性質直接影響著土傳病害的發生，作為土壤微生物的主要生境，土壤主要環境因子的變化對土傳病害的發生與嚴重程度密切相關^[32]。煙草根黑腐病是典型的土傳病害，主要以厚垣孢子和內生分生孢子在土壤、病殘體中越冬。研究表明，根黑腐病田間發病最適宜溫度在17～23℃，土壤濕度大易發病，土壤pH ≤ 5.6時極少發病。pH、NO-N的降低，以及NH-N的增加會在土壤中產生對根黑腐病具有的抑制效應的因素，并主要作用于煙草根部環境，能有效減少根黑腐病的發生^[33]。本研究發現，與健康土壤相比，感病土壤SOC、TN、ALN、MBC和MBN顯著降低，AP和AK含量顯著升高。此外，感病煙草與AK，AP和INV因子正相關，細菌微生物中subgroup_2，Solibacter，Ellin6067和Bryobacter與感病土壤呈正相關。

為了更好地了解煙草根際微生物群落變化的內部原因，本研究利用PICRUSt功能預測，分析了煙草根際真菌在不同階段微生物功能的差異。通過對根黑腐病侵染的煙草根際土壤微生物的代謝通路注釋結果表明，在感病樣本中代謝活動更加活躍，核糖核酸酶HIII、DNA結合反應調節因子、核苷-二磷酸-糖環合酶、阿拉伯糖外流滲透酶等多個通路在感病樣本中顯著上調表達。這說明感病樣本中代謝更加活躍，有益于病原真菌的定植。

4 結論

本研究結果表明，煙草根黑腐病侵染后煙株根系土壤理化性質發生改變，土壤的酶活性也隨之變化，為病原菌的入侵與傳播創造了有利條件。侵染后，土壤原有的細菌群落結構和多樣性被破壞，有益菌屬的相對豐度有所下降。同時，根際土壤中有利于病原菌生長的代謝更加旺盛。這說明多樣化、穩定的煙草根際微生物群落結構，對于維持煙株根際微生態抗性、抵御病原菌侵染至關重要。因此，通過對比分析根黑腐病侵染的煙草根際土壤與健康煙株根際土壤細菌和真菌的菌落結構及多樣性差異，分析優勢菌群與病原菌及其他有益微生物之間的內在聯系，開展病原菌拮抗微生物的篩選、鑒定及拮抗機理研究，對于利用煙草根際微生態調控等手段綠色防控煙草根黑腐病具有重要的理論支撐價值。

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收稿日期：2024-01-29 修回日期：2024-03-09

基金項目：陜西省煙草公司漢中市公司科技項目烤煙病蟲害流行模式分析和病蟲害預測預報系統構建（HZYC-KJXM-2021-02）。

第一作者簡介：譚嘉琦（1994-），男，初級農藝師，主要從事煙草病蟲害綠色防控工作。

通信作者：杜鴻波。