大鼠孕/哺乳期暴露于雷公藤甲素對雄性子鼠生殖系統的影響

中圖分類號 R965；R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）05-0558-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.05.09

摘要 目的 探討雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于雷公藤甲素（TP）對雄性子鼠生殖系統發育及功能的影響，為孕期和哺乳期的安全用藥提供參考。方法 將孕鼠隨機分為對照組（12 只，生理鹽水）和T1～T4 組[分別有12、13、14、17 只，給藥劑量分別為200、400、600、800 μg/（kg·d）]。每日灌胃相應藥物/生理鹽水1 次，直至子鼠出生并斷乳，灌胃體積均為2 mL/只。哺乳喂養60 d 后，稱定雄性子鼠生殖系統臟器質量，計算臟器系數，觀察其睪丸和附睪以及精子形態，測定其附睪組織中精子活力、精子數量以及血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）水平和精子中糖原合酶激酶3α（GSK3α）、磷酸化GSK3α（p-GSK3α）、蛋白磷酸酶1γ2（PP1γ2）蛋白的表達情況。結果 與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸質量、附睪質量和血清中GnRH、T水平以及精子中PP1γ2 蛋白的相對表達量，T2～T4 組子鼠的精囊腺質量、精囊腺系數、精子總數、精子濃度、精子活動力以及精子中GSKα、p-GSK3α蛋白的相對表達量，T3、T4 組子鼠的附睪系數，T4 組子鼠的睪丸系數、精子平均路徑速度、精子曲線速度均顯著降低或減小（P＜0.05）；T1～T4 組子鼠的畸形精子數、精子畸形率和血清中FSH、LH水平均顯著增多或升高（P＜0.05）；T1～T4 組子鼠的睪丸生精小管上皮細胞數量均減少，附睪組織內可見上皮細胞變性壞死、間質內伴少量炎癥細胞浸潤等現象。結論 雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP可導致雄性子鼠生殖器官發育異常、精子生成減少、精子活性降低、雄激素合成減少，從而對子鼠生殖系統發育產生負面影響；其機制可能與下調GSK3α、p-GSK3α和PP1γ2 蛋白表達有關。

關鍵詞 雷公藤甲素；孕期；哺乳期；雄性子鼠；生殖毒性

現代醫學中，孕期和哺乳期的藥物安全性一直是臨床關注的重點。隨著藥物種類的增多和使用范圍的擴展，藥物暴露對生殖系統及子代健康的潛在影響引起了廣泛關注。盡管許多藥物已完成針對孕期和哺乳期的毒理學評估，明確其對胎兒及新生兒的毒性作用，但仍有大量常用藥物缺乏充分的毒理學研究。已有證據表明，妊娠期使用某些藥物可能增加子代的出生缺陷及其他健康風險[1―2]。因此，評估孕期和哺乳期用藥對子代生長發育的影響具有重要臨床意義。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是一種從雷公藤中提取的環氧二萜內酯化合物，具有抗白血病、調節免疫、抗炎、抗腫瘤等多重生物活性[3]，常被當作免疫抑制劑用于類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腎病綜合征、強直性脊柱炎等自身免疫性疾病的治療[4]。此外，大量研究證明，TP還對多種惡性腫瘤（如白血病、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等）具有良好的抗腫瘤活性[5―7]。但相關研究指出，TP對心臟、肝臟、腎臟等臟器以及生殖系統均有一定的毒性作用，尤其對雄性生殖系統影響較大[4，8―9]。目前關于TP 在母體孕期及哺乳期暴露對雄性子代生殖系統的發育是否有影響仍不明確，相關研究較為缺乏。因此，本研究旨在通過動物實驗模型，觀察雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 對雄性子鼠生殖系統的影響，為這一特殊時期的安全用藥提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括SpectraMAX Plus384型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]、HH-6 型恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）、UV752N型分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、BA210Digital型數碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）、JT-12S 型自動組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司）、H2050R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）、5200 Multi 型熒光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TP原料藥（批號C14852118，純度98%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；血清促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、睪酮（testosterone，T）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（ 批號分別為ZC-36486、ZC036477、ZC-36719、ZC-36635）均購自上海茁彩生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0009）購自上海碧云天生物技術股份有限公司；鼠源β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號分別為T0023、S0001）均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔源糖原合酶激酶3α（glycogen synthase kinase 3α，GSK3α）單克隆抗體、兔源磷酸化GSK3α（p-GSK3α）單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 二抗（批號分別為A19060、AP0582、AS003）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔源蛋白磷酸酶1γ2（protein phosphatase1γ2，PP1γ2）單克隆抗體（批號ab134947）購自英國Abcam 公司；巴氏染色試劑盒（批號G1614）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級SD 大鼠，6 月齡，體重300～450 g，共100 只（雄性25 只、雌性75 只），購自成都達碩實驗動物有限公司，動物使用許可證號為SYXK（川）2021-246。購入后，所有大鼠均飼養于屏障環境中，飼養環境溫度為（23±3） ℃ ，相對濕度為（50±10）%，12 h 日/12 h 夜光照循環，通風良好。實驗期間大鼠均采用普通飼料喂養，自由攝食、飲水。本動物實驗已通過蘭州大學第二醫院實驗動物福利倫理委員會審批（受理編號為D2022-261）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將雌、雄大鼠分籠適應性喂養1 周，然后按照雌雄3∶1 的比例在每日22：00 合籠，次日若肉眼觀察到陰栓或雌性大鼠陰道涂片發現精子則視為受孕[10]，記為孕期的第0 天。受孕10 d 左右觀察大鼠腹部是否有明顯隆起，若沒有則視為假孕而剔除。經檢查，共有68 只雌鼠成功受孕。采用隨機數字表法將孕鼠分為對照組（12只，灌胃生理鹽水）和T1～T4 組[分別有12、13、14、17只，給藥劑量分別為200、400、600、800 μg/（kg·d）][4，11]。各組大鼠每日灌胃給藥/生理鹽水1 次，直至子鼠出生并斷乳，平均給藥時間約為41 d，灌胃體積均為2 mL/只。實驗期間，對照組孕鼠無死亡和流產；TP 各組孕鼠共死亡11 只、流產13 只，最終32 只完成妊娠。每組隨機選取3 只孕鼠進行哺乳。子鼠出生后通過測量其肛門生殖器距離（anogenital distance，AGD）判斷雌雄——雄性AGD明顯更長，雌性更短[12]。將雌、雄子鼠分籠飼養。每組選取3 只雄性子鼠接受母乳喂養，母乳喂養期間母鼠仍然用TP 干預，斷乳后以普通飼料喂養，用于后續實驗。自子鼠出生起共喂養60 d，并每日稱定其體重。

2.2 樣本取材及處理

喂養60 d 后，取雄性子鼠進行腹主動脈采血，將血樣靜置1 h，然后以3 000 r/min 離心10 min，收集血清并置于－80 ℃冰箱中保存備用。采血后用50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉子鼠后處死，取睪丸、附睪、精囊腺并稱定質量，然后將睪丸和附睪置于4% 多聚甲醛中固定24 h。

2.3 子鼠睪丸和附睪臟器系數計算

根據子鼠體重（處死前稱定）和生殖系統各臟器質量計算臟器系數：臟器系數＝臟器質量（g）/體重（g）×100%。

2.4 子鼠睪丸和附睪形態學觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察。將4% 多聚甲醛固定的睪丸和附睪依次進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片（厚度3 μm）處理，隨后進行HE染色和中性樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察各組雄性子鼠睪丸和附睪的形態與結構。

2.5 子鼠附睪組織中精子形態觀察

采用巴氏染色法觀察。取雄性子鼠的左側附睪，剪斷球狀部位，將斷面涂于滴有生理鹽水的潔凈玻片上，拉薄涂片，置于室溫下空氣干燥后按照試劑盒說明書方法操作，在巴氏染色、封片后鏡檢。每個切片隨機選取3個不同視野進行觀察，每只子鼠共觀察200 個精子，計算各組子鼠的精子畸形率。精子畸形率＝畸形精子數/精子總數×100%。

2.6 子鼠附睪組織中精子活力測定

取雄性子鼠的右側附睪，用針刺破，置于37 ℃生理鹽水中浸泡10 min，使精子游出。將精子懸浮液在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌2 次，然后在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，收集精子沉淀并重懸于含有1% 苯甲基磺酰氟的80 mL RIPA緩沖液中，超聲處理（超聲功率200W，間斷超聲3 次，每次10 s、間隔10 s）。隨后，將精子懸浮液在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，棄上清。取精子沉淀，加入RIPA 裂解液[精子沉淀與裂解液配比為1∶10（m/m）]，于碎冰上裂解10 min；收集裂解液，在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。取20 μL上清液涂于載玻片上，蓋上蓋玻片，用計算機輔助精子分析系統檢測精子活力。精子活力參數包括精子濃度、精子前向運動率（progressive motility rate，PR）、精子非前向運動率（non-progressive motility rate，NP）、精子活動力（用PR+NP 表示）、精子平均路徑速度（average pathvelocity，VAP）、精子直線速度（straight-line velocity，VSL）、精子曲線速度（curvilinear velocity，VCL）。剩余上清液置于－80 ℃冰箱中保存，用于Western blot實驗。

2.7 子鼠附睪組織中精子數量測定

取“2.6”項下精子懸浮液0.1 mL，加PBS 稀釋10 倍后用細胞計數板計數懸浮液中的精子數。精子總數以單側附睪組織中懸浮液精子數×10（稀釋倍數）表示[13]。

2.8 子鼠血清中性激素水平測定

采用ELISA 法檢測。將子鼠血清從－80 ℃冰箱中取出，室溫下解凍，用酶標儀在450 nm波長下測定血清中GnRH、LH、FSH、T水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.9 子鼠精子中GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2 蛋白表達測定

采用Western blot 法測定。取“2.6”項下－80 ℃保存的精子上清液適量，采用BCA 法檢測上清液中總蛋白濃度，并通過高溫（95 ℃、15 min）裂解變性。取變性蛋白進行電泳（先在80 V電壓下電泳約25 min，然后在120 V電壓下電泳約1.5 h）分離、轉膜（恒流200 mA下轉膜1～2 h），然后用5% 脫脂牛奶常溫下封閉2 h；加入β-tubulin、GSK3α、p-GSK3α、PP1γ2 一抗（稀釋比例分別為1∶50 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），4 ℃搖床孵育過夜；洗膜3 次，加入相應二抗（稀釋比例1∶5 000），室溫下孵育2 h；洗膜后采用ECL法染色，然后將膜放入凝膠圖像分析儀中曝光成像。采用Image J 圖像分析軟件進行定量分析，以目的蛋白與內參蛋白（β-tubulin）條帶的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.10 統計學方法

使用GraphPad Prism 9.5 軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析。實驗數據均符合正態分布，均以x±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnett檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 TP對雄性子鼠生殖器官質量及臟器系數的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸質量、附睪質量，T2～T4 組子鼠的精囊腺質量、精囊腺系數，T3、T4 組子鼠的附睪系數及T4 組子鼠的睪丸系數均顯著降低或減小（P＜0.05）。結果見表1。

3.2 TP對雄性子鼠睪丸、附睪組織形態學的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠的睪丸生精小管上皮細胞數量均減少，且隨著TP 暴露劑量的增大上述病理變化越明顯；T1～T4 組子鼠的附睪組織內可見上皮細胞變性壞死、細胞質溶解、精子不同程度壞死、精子數量減少、間質內伴少量炎癥細胞浸潤，且隨著TP暴露劑量的增大上述病理改變有加重趨勢。結果見圖1、圖2。

3.3 TP對雄性子鼠精子形態的影響

T1～T4 組子鼠均出現精子形態異常的情況，主要表現為折疊、無鉤、香蕉型、無定型、胖頭、雙頭和雙尾。對照組和T1～T4 組子鼠的畸形精子數分別為3、21、31、44、60 個，精子畸形率分別為（0.50±0.00）%、（3.50±1.32）% 、（5.17±0.29）% 、（7.33±0.76）% 、（10.00±2.00）%；與對照組比較，T1～T4 組子鼠畸形精子數和精子畸形率均顯著升高（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴性趨勢。結果見圖3。

3.4 TP對雄性子鼠精子數量和活力的影響

與對照組比較，T2～T4 組子鼠的精子總數、精子濃度、精子活動力以及T4 組子鼠的VAP、VCL均顯著減少或降低（P＜0.05）。結果見表2。

3.5 TP對雄性子鼠性激素水平的影響

與對照組比較，T1～T4 組子鼠血清中GnRH、T 水平均顯著降低（P＜0.05），LH、FSH水平均顯著升高（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴性趨勢。結果見表3。

3.6 TP對雄性子鼠精子中GSKα、p-GSK3α、PP1γ2 蛋白表達的影響

與對照組比較，T2～T4 組子鼠精子中GSKα、p-GSK3α蛋白的相對表達量以及T1～T4 組子鼠精子中PP1γ2 蛋白的相對表達量均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖4、表4。

4 討論

本研究通過動物實驗模型探討了雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP對雄性子鼠生殖健康的影響。結果顯示，TP 暴露后會導致雄性子鼠生殖器官質量減輕、臟器系數降低、睪丸和附睪組織形態學異常，提示TP可能對雄性子鼠的生殖細胞產生損傷；此外，TP 暴露還顯著影響了雄性子鼠的精子質量，包括導致精子形態異常、畸形率升高、活力下降。根據相關文獻可知，這可能與TP破壞了睪丸間質細胞活性并誘導其發生了凋亡等有關[14―15]。本研究結果還顯示，雌性大鼠孕期200 μg/（kg·d）的TP 暴露量對雄性子鼠生殖器官形態學的影響較輕，而600、800 μg/（kg·d）的TP暴露量的影響較大。

在雄性子鼠生殖系統發育過程中，下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG）發揮了關鍵作用。下丘腦通過分泌GnRH刺激垂體釋放LH和FSH，進而作用于性腺，調節睪酮分泌和精子生成。本研究發現，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可引起雄性子鼠血清中T 水平降低，LH、FSH 水平升高，而LH、FSH 水平升高又可抑制下丘腦分泌GnRH，且這一效應具有一定的劑量依賴性趨勢。這提示TP可能通過干擾HPG功能，影響性激素的合成和分泌。此外，TP對精子功能相關蛋白也產生了重要影響。GSK3α與p-GSK3α在精子成熟及活動中起著至關重要的作用[16]；PP1γ2 則廣泛存在于哺乳動物睪丸和精子中，是精子生成和雄性生育能力維持不可或缺的物質[17]。本研究發現，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可引起雄性子鼠精子中GSK3α、p-GSK3α和PP1γ2 蛋白表達下調。這表明TP可能通過抑制精子功能相關蛋白的表達，從而導致精子活力下降和生殖功能受損。

綜上所述，雌性大鼠孕期及哺乳期暴露于TP 可導致雄性子鼠生殖器官發育異常、精子生成減少、精子活性降低、雄激素合成減少，從而對子鼠生殖系統發育產生負面影響；其機制可能與下調GSK3α、p-GSK3α 和PP1γ2 蛋白表達有關。但本研究僅基于動物模型展開，未測定孕鼠乳汁、胎盤中TP 含量以及雄性子鼠體內的TP 血藥濃度，且樣本量相對較小，后續還需開展更多實驗進一步證實本研究結論。

參考文獻

[ 1 ] SARECKA-HUJAR B， SZULC-MUSIO? B. Herbalmedicines-are they effective and safe during pregnancy？[J]. Pharmaceutics，2022，14（1）：171.

[ 2 ] BENEVENT J，ARAUJO M，HURAULT-DELARUE C，et al. Pharmacoepidemiology in pregnancy[J]. Therapie，2019，74（2）：289-300.

[ 3 ] GAO J，ZHANG Y F，LIU X H，et al. Triptolide：pharmacologicalspectrum，biosynthesis，chemical synthesis andderivatives[J]. Theranostics，2021，11（15）：7199-7221.

[ 4 ] NI B，JIANG Z Z，HUANG X，et al. Male reproductivetoxicity and toxicokinetics of triptolide in rats[J]. Arzneimittelforschung，2008，58（12）：673-680.

[ 5 ] LI H，LI L P，MEI H F，et al. Antitumor properties of triptolide：phenotype regulation of macrophage differentiation[J]. Cancer Biol Ther，2020，21（2）：178-188.

[ 6 ] XIONG J，SU T F，QU Z L，et al. Triptolide has anticancerand chemosensitization effects by down-regulating Aktactivation through the MDM2/REST pathway in humanbreast cancer[J]. Oncotarget，2016，7（17）：23933-23946.

[ 7 ] 李佳鑫，石金鳳，吳億晗，等. 雷公藤甲素抗乳腺癌的機制及應用進展[J].中國中藥雜志，2021，46（13）：3249-3256.

LI J X，SHI J F，WU Y H，et al. Mechanisms and applicationof triptolide against breast cancer[J]. China J ChinMater Med，2021，46（13）：3249-3256.

[ 8 ] 嚴銀銀，張振強，曾華輝，等. 雷公藤甲素的不良反應及減毒研究進展[J]. 中華中醫藥學刊，2021，39（11）：139-143.

YAN Y Y，ZHANG Z Q，ZENG H H，et al. Researchprogress on toxicity and attenuation of triptolide[J]. ChinArch Tradit Chin Med，2021，39（11）：139-143.

[ 9 ] FAN Y F，SU X H，XU Y，et al. Effect of triptolide on reproductivetoxicity in female rats with Ⅱ type collagen inducedarthritis[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2024，49（11）：3061-3069.

[10] AJAYI A F，AKHIGBE R E. Staging of the estrous cycleand induction of estrus in experimental rodents：an update[J]. Fertil Res Pract，2020，6：5.

[11] SINGLA N，CHALLANA S. Reproductive toxicity of triptolidein male house rat，Rattus rattus[J]. Sci World J，2014，2014：879405.

[12] THANKAMONY A，ONG K K，DUNGER D B，et al.Anogenital distance from birth to 2 years：a populationstudy[J]. Environ Health Perspect，2009，117（11）：1786-1790.

[13] DE G KEMPINAS W，SUAREZ J D，ROBERTS N L，et al. Rat epididymal sperm quantity，quality，and transittime after guanethidine-induced sympathectomy[J]. BiolReprod，1998，59（4）：890-896.

[14] 王昊，陳亮，葉小云. 雷公藤甲素對TM4 細胞氧化應激及PI3K/AKT 通路的影響[J]. 北京大學學報（醫學版），2018，50（4）：607-612.

WANG H，CHEN L，YE X Y. Triptolide induces oxidativestress and apoptosis and activates PIK3/Akt signalingpathway in TM4 cells[J]. J Peking Univ Health Sci，2018，50（4）：607-612.

[15] 葉小云，陳亮. 雷公藤甲素介導AMPK/Akt/mTOR通路對小鼠TM3 睪丸間質細胞活性的影響[J]. 中華男科學雜志，2019，25（9）：787-791.

YE X Y，CHEN L. Effects of triptolide on the activity ofTM3 Leydig cells and AMPK/Akt/mTOR pathway[J].Natl J Androl，2019，25（9）：787-791.

[16] PARK S H，KIM Y P，LEE J M，et al. Regulation of phosphorylationof glycogen synthase kinase 3α and the correlationwith sperm motility in human[J]. World J MensHealth，2024，42（2）：373-383.

[17] DUDIKI T，JOUDEH N，SINHA N，et al. The proteinphosphatase isoform PP1γ1 substitutes for PP1γ2 to supportspermatogenesis but not normal sperm function andfertility[J]. Biol Reprod，2019，100（3）：721-736.

（收稿日期：2024-10-30 修回日期：2025-02-17）

（編輯：林靜）

基金項目甘肅省自然科學基金（青年科技基金）項目（No.22JR-5RA1015）；蘭州大學學生創新創業行動計劃立項（No.20240050002）