基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗驗證探討槲皮素通過p53信號通路抗結(jié)直腸癌的作用機制

摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和體外實驗探討槲皮素通過p53信號通路抗結(jié)直腸癌的分子作用機制。借助TCMSP和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別獲取槲皮素的藥物靶點和結(jié)直腸癌的疾病靶點，并通過Venn圖映射出藥物靶點與疾病靶點的共同靶點;借助String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape_v3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，同時進行GO和KEGG富集分析、分子對接及核心靶點的表達量及生存分析；最后通過細胞實驗檢測細胞的增殖活性、細胞凋亡水平和細胞周期阻滯變化、用藥前后核心靶點及p53通路關(guān)鍵蛋白的表達變化。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示AKT1、TP53為槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點；GO和KEGG分析篩選出槲皮素主要參與PI3K/Akt、p53信號通路；分子對接表明槲皮素與核心靶點AKT1、TP53具有較強的結(jié)合活性，TP53既在結(jié)直腸癌組織中高表達，又可影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后；細胞實驗結(jié)果表明槲皮素能抑制HCT-116細胞的增殖，誘導(dǎo)HCT-116細胞發(fā)生G0/G1期阻滯，促進細胞凋亡。該機制可能調(diào)控TP53、AKT1等核心靶點，激活p53信號通路，參與HCT-116細胞的增殖與凋亡，進而起到抗結(jié)直腸癌的作用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

中圖分類號：R288""" 文獻標(biāo)志碼：A""" 文章編號：1002-4026（2025）01-0032-12

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240052【藥理與毒理】

收稿日期：2024-04-04

基金項目：上海申康醫(yī)院發(fā)展中心臨床三年行動計劃資助項目（SHDC2020CR4049）；上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（2021LPTD-010）；第五批全國中醫(yī)臨床優(yōu)秀人才研修項目資助（國中醫(yī)藥人教函〔2022〕1號）

作者簡介：韓惠杰（1981—），男，主治醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合診治消化道腫瘤。E-mail：hanhuijie601@163.com

*通信作者，王松坡（1971—），男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療消化道疾病及腫瘤。E-mail：13386259791@163.com

A study based on network pharmacology and experimental verification exploring

the mechanism of quercetin against colorectal cancer

through the p53 signaling pathway

HAN Huijiea， LIU Huia，ZHAO Yongbob， WANG Songpoa*

（a.Department of TCM； b.Department of Neurology， Shanghai General Hospital， Shanghai 200080， China）

Abstract∶Based on network pharmacology， molecular docking， and in vitro experiments， this study explores the molecular mechanism of quercetin against colorectal cancer through the p53 signaling pathway. The drug targets quercetin， and the disease targets colorectal cancer， which was obtained via the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform and Gene Cards database， respectively. The common drug and disease targets were mapped using a Venn diagram， and the protein-protein interaction network map was constructed with the help of the String database and Cytoscape_v3.7.2 software. At the same time， GO and KEGG enrichment analysis， molecular docking， core target expression， and survival analysis were also performed. Finally， cell proliferation activity， level of apoptosis， cell cycle arrest， and changes in the expression of core targets and key proteins of the p53 pathway were detected through cellular experiments. Network pharmacology suggests that AKT1 and TP53 are the core targets of quercetin against colorectal cancer， GO and KEGG analysis demonstrate that quercetin is mainly involved in the PI3K/Akt and p53 signaling pathways， molecular docking demonstrates that quercetin exhibits strong binding activity with the core targets AKT1 and TP53， and TP53 is found to be both highly expressed in colorectal cancerand also affect the survival and prognosis of patients with colorectal cancer. The results of cellular experiments show that quercetin can inhibit the proliferation of HCT-116 cells， induce G0/G1 cell-cycle arrest in HCT-116 cells， and promote apoptosis. This mechanism may regulate core targets such as TP53 and AKT1， activate the p53 signaling pathway， participate in the proliferation and apoptosis of HCT-116 cells， and thus function to resist colorectal cancer.

Key words∶quercetin; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking

據(jù)報道，2020年新發(fā)結(jié)直腸癌占新發(fā)惡性腫瘤的10%左右，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位居第三位，死亡率躍居第二位，是臨床上常見的惡性消化道腫瘤之一［1］。結(jié)直腸癌具有高隱匿性，早期常無癥狀，而一旦出現(xiàn)便血、腹痛等典型癥狀，病程或已到中晚期，甚則出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2］，并且結(jié)直腸癌還逐漸呈現(xiàn)出年輕化趨勢，已嚴重威脅社會發(fā)展及人民健康。結(jié)直腸癌的治療常采用手術(shù)、放化療、免疫或靶向等常規(guī)手段，但仍不能改變其高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特征［3］，并具有嚴重的毒副作用［4］，因此臨床尋找低毒高效的新型藥物成為防治結(jié)直腸癌及其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移研究的重中之重。

臨床和臨床前研究提示，植物化學(xué)物質(zhì)可通過抑制有絲分裂、誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮抗癌活性［5］，因此，使用植物化學(xué)物質(zhì)進行抗腫瘤可以改善疾病的預(yù)后，并可能成為治療結(jié)直腸癌的新方法［6］。槲皮素是一種具有抗腫瘤作用的天然黃酮類化合物，其大多存在于多種水果、蔬菜、堅果、花朵以及樹葉中［7］，在抗腫瘤方面具有顯著的作用。研究顯示［8-9］，槲皮素具有抑制結(jié)直腸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和促進凋亡的作用，但其具體作用機制以及發(fā)揮關(guān)鍵作用的通路尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將網(wǎng)絡(luò)分析與系統(tǒng)藥理完美結(jié)合，通過檢索數(shù)據(jù)庫、分析高通量數(shù)據(jù)、模擬計算機等多種手段，構(gòu)建復(fù)雜的“藥物-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進而分析藥物與靶點、通路、疾病之間相互作用的關(guān)系。分子對接技術(shù)是利用計算機的高精度對接模擬功能來評估蛋白與配體結(jié)合的潛在能力，使得發(fā)現(xiàn)和確認藥物靶點更快捷、更有效［10］。

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在靶點和信號通路，并使用分子對接技術(shù)評估槲皮素和核心靶點的結(jié)合活性，最后通過體外細胞實驗進行驗證，以期為槲皮素抗結(jié)直腸癌的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料

1.1" 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），Swiss Target數(shù)據(jù)庫（https：//www.sib.swiss/），Swiss Target Prediction模塊（http：//www.swisstargetprediction.ch/），Uniprot數(shù)據(jù)庫http：//www.uniprot.org/），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），Cytoscape_v3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/），Bioconductor的R包（https：//www.r-project.org/），Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/），GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn /index.html），TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。

1.2" 細胞實驗

HCT-116細胞株購于中科院細胞庫，存儲于-180 ℃液氮罐中。

1.3" 實驗材料與試劑

槲皮素購于上海源葉科技有限公司（批號B20527），胎牛血清購于美國Gibco公司（批號16000-044），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司（批號556420），RNAiso Plus、PrimeScriptTM RTMaster購于日本TAKARA公司（批號9109、RR036A），PVDF膜購于美國Millipore公司（批號IPVH00010），Bax抗體購于美國Proteintech公司（批號50599-2-Ig），Bcl-2抗體購于美國Abclonal公司（批號A19693），p53抗體購于武漢博士德生物工程有限公司（批號PB0076），Goat anti-rabbit IgG （H+L） -HRP二抗購于美國Jackson Immuno Research公司（批號111-035-003）。

1.4" 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號MK3），流式細胞儀（美國BD公司，型號FACSCalibur），轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司，型號VE186）。

2" 方法

2.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1" 槲皮素靶點收集

以“quercetin”為關(guān)鍵詞在TCMSP系統(tǒng)中檢索槲皮素對應(yīng)的蛋白作用靶點進行匯總；從Pubmed數(shù)據(jù)庫下載槲皮素的分子結(jié)構(gòu)，再導(dǎo)入SwissTarget數(shù)據(jù)庫的Swiss Target Prediction模塊預(yù)測相關(guān)靶點；使用Uniprot數(shù)據(jù)庫去除重復(fù)靶點并添加基因縮寫。

2.1.2" 疾病靶點的收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索疾病關(guān)鍵詞“colorectal cancer”，收集“結(jié)直腸癌”的疾病靶點。

2.1.3" 共有靶點獲取

將藥物靶點和疾病靶點通過VennDiagram軟件包映射出交集靶點，即槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在作用靶點，并輸出Venn圖。

2.1.4" PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建共有靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用NetworkAnalyzer工具對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，將degree值大于等于2倍中位數(shù)節(jié)度值的靶點蛋白根據(jù)Node degree distribution值進行可視化。

2.1.5" GO生物功能富集分析和KEGG通路富集

借助Bioconductor中的R包Clusterprofile對潛在作用靶點進行以Plt;0.05為閾值的GO和KEGG富集分析，其結(jié)果以可視化的氣泡圖形式展示。

2.1.6" 槲皮素與核心靶點的分子對接

將槲皮素與PPI網(wǎng)絡(luò)degree值前2位的靶點進行分子對接驗證，通過Pubchem和PDB數(shù)據(jù)庫分別下載核心活性化合物小分子配體及相應(yīng)靶點蛋白受體的2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件［11-12］。基于AutoDock軟件準(zhǔn)備PDBQT文件和確定活性口袋，一般認為小分子配體和靶點的結(jié)合能≤-7.0 kJ/mol則視為兩者具有強烈的對接活性［13］，最終利用Vina軟件及pymol軟件完成槲皮素與核心靶點的分子對接驗證。

2.2" 體外細胞實驗

2.2.1" 細胞培養(yǎng)及分組給藥

在37 ℃、5%CO2和95%空氣的無菌培養(yǎng)箱中，在細胞培養(yǎng)皿中加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)HCT-116細胞，并用細胞完全培養(yǎng)基傳代。

實驗共分為兩組，正常對照組（HCT-116細胞，不加藥物干預(yù)）和槲皮素組（槲皮素濃度為296.5 μmol/L）。

2.2.2" CCK8法檢測細胞增殖活性

將密度為1×104 mL-1且處于對數(shù)生長期的HCT-116細胞接種到96孔板中，并設(shè)置空白對照組和槲皮素組（5、20、80、320、640 μmol/L）。藥物處理24 h后，將96孔板取出，拍照，吸盡后丟棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL工作液（90 μL培養(yǎng)基+10 μL CCK8原液），在細胞培養(yǎng)箱孵育0.5～1 h后，用酶標(biāo)儀測定OD值并算出IC50值。

2.2.3" 流式細胞術(shù)檢測細胞周期阻滯和凋亡

六孔板中，每孔約接種3×105 mL-1處于對數(shù)生長期的HCT-116細胞，在細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜；吸棄培養(yǎng)基后，加入槲皮素濃度為296.5 μmol/L的液體作為試驗組，未加入槲皮素的作為對照組，處理24 h后，胰蛋白酶消化并收集細胞。將20 μL的PI加入重懸離心的PBS中，并使用錫箔紙包住避光染色30 min，使用流式細胞術(shù)，檢測細胞周期比例變化。細胞收集、處理及洗滌方式同前，先后加入Annexin V-FITC及PI染色液，避光孵育20 min后置于冰浴中，重懸細胞2～3次改善染色效果后，上流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率：細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。

2.2.4" RT-qPCR檢測核心靶點AKT1、TP53 mRNA表達水平

槲皮素干預(yù)24 h后各孔加入適量Trizol裂解細胞后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行PCR擴增，檢測AKT1、TP53 mRNA相對表達量，采用2－△△CT法進行相對定量分析，引物序列見表1。

2.2.5" Western blot檢測Bcl-2、Bax、p53蛋白的表達

將處于對數(shù)生長期且密度為3×105 mL-1的HCT-116細胞接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后加入濃度為296.5 μmol/L的槲皮素處理細胞，給藥結(jié)束后，用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，隨后進行蛋白電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST清洗3次后分別加入相應(yīng)一抗（Bax抗體：1：1 000（稀釋比例，下同）；Bcl-2抗體：1：1 000；p53抗體：1：1 000；GAPDH抗體：1：10 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜；TBST漂洗3次后加入二抗（1：5 000）孵育2 h；PBST清洗5次后進行化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值，分析和計算出Bcl-2、Bax、p53蛋白的表達：各蛋白的相對表達水平=各蛋白灰度值/GAPDH內(nèi)參灰度值。

2.3" 統(tǒng)計學(xué)方法

繪圖采用GraphPad Prism 5軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0，試驗重復(fù)進行3次，以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示計量資料，組間比較采用t檢驗，以Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3" 結(jié)果

3.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

3.1.1" 槲皮素靶點收集

將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的154個作用靶點和通過Swiss Target Prediction模塊預(yù)測和篩選到100個對應(yīng)靶點進行匯總并刪除重復(fù)后，最終獲得槲皮素作用靶點共230個。

3.1.2" 疾病靶點的收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“colorectal cancer”為疾病關(guān)鍵詞，收集到“結(jié)直腸癌”的疾病相關(guān)靶點共12 983個。

3.1.3" 共有靶點獲取

將藥物靶點和疾病靶點利用R Studio的VennDiagram包進行映射，得到槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在作用靶點共214個，進一步輸出Venn圖（如圖1）。

3.1.4" PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape_v3.7.2軟件構(gòu)建共有靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)，并進行拓撲學(xué)分析，共有靶點網(wǎng)絡(luò)中共有214個節(jié)點（即靶點），共有4 449條邊（即靶點之間的相互作用關(guān)系），中位數(shù)節(jié)度值為41.6。我們選取degree值≥2倍中位數(shù)節(jié)度值的靶點蛋白并根據(jù)node degree distribution值進行可視化，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（如圖2），在本PPI網(wǎng)絡(luò)中，degree值≥2倍中位數(shù)節(jié)度值，且排名前2的靶點分別是AKT1（degree值=147）、TP53（degree值=140），提示這兩個靶點是槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點，可能在網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

3.1.5" GO分子功能富集結(jié)果

GO富集到5 415個條目，其中生物過程（BP）條目占比82.53%（4 469）個，細胞組成（CC）條目占比6.65%（360）個，分子功能（MF）條目占比10.82%（586）個，詮釋候選靶標(biāo)的抗腫瘤生物過程。本研究利用R語言，以Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出GO富集結(jié)果中BP、CC、MF各項排名前10位的條目，共30條，繪制成可視化的氣泡圖予以展示（如圖3）。結(jié)果提示，槲皮素抗結(jié)直腸癌主要涉及：transcription coregulator binding等。

3.1.6" KEGG通路富集結(jié)果

KEGG富集到233條信號通路。本研究利用R語言，以Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果中排名前30位的信號通路，繪制成可視化的氣泡圖予以展示（如圖4）。

結(jié)果提示，槲皮素抗結(jié)直腸癌主要集中于在細胞增殖、凋亡方面起重要作用的通路，如PI3K-Akt信號通路、p53信號通路等。

3.1.7" 藥物與靶點的分子對接驗證

通過AutodockVina軟件將槲皮素和核心靶點進行分子對接驗證，獲得小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的自由能，同時得到槲皮素和核心靶點蛋白的分子對接模式（如圖5）。結(jié)果顯示，槲皮素與排名前2的靶點AKT1、TP53的結(jié)合能分別為-7.67 kJ/mol、-7.85 kJ/mol，故槲皮素與結(jié)直腸癌的核心靶點具有強烈的結(jié)合作用。

3.1.8" 核心靶點基因的表達量及生存分析

將排名前2名的核心靶點基因帶入GEPIA數(shù)據(jù)庫進行評估，同時通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌的數(shù)據(jù)（479個結(jié)直腸癌組織、42個癌旁組織）并做差異表達。結(jié)果顯示，2個核心靶點基因中，只有TP53既在結(jié)直腸癌組織中顯著表達（如圖6（a），Plt;0.001），又能影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后（如圖6（b），Plt;0.05）。

3.2" 體外實驗研究結(jié)果

3.2.1" 槲皮素對HCT-116細胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果提示，槲皮素可以抑制HCT-116細胞的增殖，且成劑量依賴性（如圖7）。不同濃度槲皮素作用于HCT-116細胞24 h后，5、20、80、320、640 μmol/L組的細胞活力逐漸降低，且20、80、320、640 μmol/L組相較于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.01、Plt;0.001、Plt;0.000 1），并計算得出槲皮素作用于HCT-116細胞24 h的IC50值為296.5 μmol/L。

3.2.2" 槲皮素對HCT-116細胞凋亡的影響

流式檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，加入槲皮素培養(yǎng)24 h后，HCT-116細胞的凋亡水平極顯著升高（Plt;0.01），表明槲皮素對HCT-116細胞的凋亡具有促進作用（如圖8）。

3.2.3" 槲皮素對HCT-116細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測兩組HCT-116細胞周期比例變化，結(jié)果顯示，相較于對照組，槲皮素作用于HCT-116細胞24 h后，槲皮素組HCT-116細胞的G0/G1期細胞比例由（19.737±3.359）%上升至（43.433±1.497）%（Plt;0.01）；G2/M期細胞比例由（36.033±0.435）%下降至（19.347±2.164）%（Plt;0.01）；而S期細胞比例無明顯變化（Pgt;0.05）。結(jié)果表明，槲皮素可抑制細胞G1期向G2/M期的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯（如圖9、圖10）。

3.2.4" 槲皮素對HCT-116細胞核心靶點AKT1、TP53 mRNA表達水平的影響

RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，槲皮素組HCT-116細胞中AKT1mRNA的表達量顯著降低（Plt;0.05）；而TP53 mRNA的表達量極顯著升高（Plt;0.01），見圖11。

3.2.5" 槲皮素對HCT-116細胞Bcl-2、Bax、p53蛋白表達的影響

Western Blot的實驗結(jié)果表明，與對照組相比，槲皮素組Bax、p53蛋白表達水平明顯升高（Plt;0.01、Plt;0.05）；槲皮素組Bcl-2/Bax的比值較對照組明顯降低（Plt;0.05）；而兩組Bcl-2蛋白表達水平無明顯變化（Pgt;0.05），見圖12。

4" 討論

結(jié)直腸癌是由多種因素導(dǎo)致的以臟腑功能失調(diào)為本，痰濕毒瘀積聚為標(biāo)的一種臨床常見腫瘤，但其具有的高發(fā)病率和高死亡率，使人類的健康受了到嚴重威脅。近年來，具有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用的中藥在輔助治療CRC方面取得了良好的療效。植物來源的天然化合物具有潛在的抗癌作用，而天然黃酮類化合物槲皮素在抗炎、抗病毒、抗氧化應(yīng)激和降糖等方面具有強大的優(yōu)勢，對結(jié)直腸癌具有一定的防治功效［14-15］。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測槲皮素抗結(jié)直腸癌的作用靶點和分子機制顯得十分有必要。

細胞凋亡是細胞對外源性或內(nèi)源性刺激做出的防御性反應(yīng)，是基因調(diào)控下細胞程序性死亡的一種形式，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要機制［16-17］。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，他們分別可以通過抑制和促進線粒體中Cytc的釋放而起到抑制細胞凋亡和誘導(dǎo)細胞凋亡［18］。有研究表明p53蛋白能夠特異的促進Bax的表達，降低Bcl-2的表達，促進腫瘤細胞凋亡［19］；且Bcl-2/Bax比率的變化可啟動半胱天冬酶信號傳導(dǎo)，激活caspase-3，引起凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞凋亡［20］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提示槲皮素可能通過214個靶點發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用，而對靶點蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，AKT1、TP53可能是槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點。AKT異?；罨瘯?dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［21］，AKT1被磷酸化激活后參與腫瘤細胞的增殖、凋亡，且具有促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力［22］，因此，在結(jié)直腸癌組織中，AKT1常高表達，而腫瘤浸潤深度、臨床分期及有無淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移則是影響AKT1是否高表達的重要因素［23］；TP53是一種編碼p53的抑癌基因，可誘導(dǎo)靶基因表達，參與細胞增殖、凋亡的調(diào)控，同時發(fā)揮基因監(jiān)視功能［24］，而喪失抑癌功能的野生型TP53可誘導(dǎo)正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)病［25］，且結(jié)直腸癌患者TP53基因突變的發(fā)生率為60%［26］，這使得其監(jiān)視作用喪失，失去抑制腫瘤細胞增殖和分化的功能。GO功能富集和KEGG通路富集相互聯(lián)系，相互補充，從不同側(cè)面揭示槲皮素可能參與了細胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程及調(diào)節(jié)PI3K/Akt signaling pathway、p53 signaling pathway等信號通路，起到調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。PI3K/Akt信號通路及p53信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡方面有著重要的作用［27-28］，Yu等［29］的研究表明，抑制PI3K/AKT磷酸化可誘導(dǎo)大腸癌細胞增殖抑制和細胞凋亡，Huang等［30］研究證實槲皮素可通過下調(diào)PI3K和AKT的表達調(diào)控PI3K/AKT信號通路，進而抑制HCT-116細胞的增殖、促進細胞的凋亡；而p53信號通路的相關(guān)蛋白上調(diào)可使血管生成受到抑制、細胞凋亡加速而起到抗腫瘤作用［31］。

分子對接結(jié)果表明，槲皮素與關(guān)鍵靶點AKT1、TP53的結(jié)合能均小于-7.0 kJ/mol，提示槲皮素與其蛋白受體相互結(jié)合的能力極強，發(fā)生相互作用的可能性最大；但兩個關(guān)鍵靶點中只有TP53既在結(jié)直腸癌組織中高表達，又可影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后，因此推測槲皮素可能通過這一關(guān)鍵靶點介導(dǎo)p53信號通路，發(fā)揮復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能，進而起到抗結(jié)直腸癌的作用。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析的基礎(chǔ)上，我們進行了體外細胞實驗，CCK-8結(jié)果提示，槲皮素對HCT-116細胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示，槲皮素具有促進HCT-116細胞凋亡的作用，且槲皮素可將HCT-116細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞周期，從而使增殖活性降低，加速凋亡；RT-qPCR實驗顯示，HCT-116細胞經(jīng)過槲皮素干預(yù)后，關(guān)鍵靶點AKT1 mRNA的表達顯著降低（Plt;0.05），TP53 mRNA的表達顯著升高（Plt;0.01）；Western blot檢測顯示，p53、Bax蛋白表達明顯升高（Plt;0.01、Plt;0.05），Bcl-2/Bax的比值明顯降低（Plt;0.05），HCT-116細胞的凋亡率極顯著增加（Plt;0.01），提示槲皮素可能通過上調(diào)p53蛋白的表達，提升Bax的分泌，調(diào)整Bcl-2/Bax比值，加速HCT-116細胞凋亡，進而起到抗結(jié)直腸癌的作用，這與我們網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的預(yù)測結(jié)論相符。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對槲皮素抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點、重要通路方面做了初步分析，并通過體外細胞實驗進行驗證，結(jié)果表明，槲皮素可能通過調(diào)控TP53、AKT1等核心靶點，激活p53信號通路，調(diào)控HCT-116細胞的增殖與凋亡，進而起到抗結(jié)直腸癌的作用，為槲皮素的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。然而，本研究并未研究在動物體內(nèi)的藥效及作用機制，使結(jié)論具有一定局限性。因此，槲皮素如何在體內(nèi)調(diào)控上述信號通路起到抗結(jié)直腸癌的作用將成為課題組后續(xù)研究重點。

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