半夏瀉心湯含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞增殖影響的時(shí)效及量效關(guān)系研究

摘要：采用中藥血清藥理學(xué)方法，觀察半夏瀉心湯（Banxiaxiexin Decoction，BXD）含藥血清對(duì)不同胃癌細(xì)胞體外增殖的影響，并探討用于胃癌細(xì)胞藥效觀察的BXD含藥血清制備條件。將BXD高、中、低灌胃后30、60、90、120、150 min采血，制備含藥血清。根據(jù)灌胃劑量和采血時(shí)間對(duì)MGC803、MKN45、AGS和HGC27細(xì)胞分別設(shè)5%～50%含藥血清組，采用CCK8檢測(cè)不同灌胃劑量、不同采血時(shí)間、不同體積分?jǐn)?shù)的BXD含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞抑制增殖的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與其他時(shí)間點(diǎn)相比， BXD含藥血清均在采血時(shí)間120 min時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制增殖作用最強(qiáng)；與BXD低劑量組相比，BXD中劑量組對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制增殖作用強(qiáng)，且與BXD高劑量組無(wú)顯著性差異。BXD中劑量組灌胃120 min后采血的含藥血清按照5%～50%的10個(gè)濃度梯度，分析對(duì)不同胃癌細(xì)胞的抑制作用其IC50值均為20%。不同灌胃劑量、不同采血時(shí)間和不同體積分?jǐn)?shù)的含藥血清對(duì)不同胃癌細(xì)胞的抑制作用，均顯示BXD中劑量組，采血時(shí)間120 min和20%的體積分?jǐn)?shù)對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。由此，BXD中劑量組灌胃，采血時(shí)間120 min，體積分?jǐn)?shù)為20%的含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞的藥效作用最好。

關(guān)鍵詞：半夏瀉心湯含藥血清；胃癌；細(xì)胞增殖；中藥血清藥理學(xué)；時(shí)效；量效

中圖分類號(hào)：R285""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：1002-4026（2025）01-0009-14

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240035【藥理與毒理】

收稿日期：2024-03-07

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016CYJS08A01-6）；山東中醫(yī)藥大學(xué)首批科研創(chuàng)新優(yōu)秀團(tuán)隊(duì)（220316）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)基礎(chǔ)理論學(xué)科；山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥經(jīng)典理論教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

作者簡(jiǎn)介：祖國(guó)秀（1994—），女，方劑學(xué)博士。研究方向?yàn)閺?fù)方作用機(jī)理與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel： 13553165270，E-mail：13553165270@163.com

*通信作者，韓濤（1962—），男，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉絼┡R床應(yīng)用與療效客觀化研究，復(fù)方作用機(jī)理與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel：13605318664，E-mail： ht60012002@163.com

Time-effect and dose-effect relationship study on the effect of Banxiaxiexin

Decoction-containing serum on the proliferation of gastric cancer cells

ZU Guoxiu1， LIU Xijian1， ZU Xiuli2， TANG Jiqin3， HUANG Hailiang3， HAN Tao1*

（1.Department of Traditional Chinese Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China;

2.Department of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan， 250355， China;

3. Department of Rehabilitation Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355，China）

Abstract∶The pharmacological method of traditional Chinese medicine serum was used to explore the effect of Banxiaxiexin Decoction （BXD） on the proliferation of different gastric cancer cells in vitro. Additionally，the preparation conditions of BXD drug-containing serums were examined toobserve the pharmacodynamics of gastric cancer cells. Blood was collected at intervals of 30， 60， 90， 120， and 150 minutes after high， medium， and low intragastric gavage of BXD to prepare drug-containing serums. Based on the selected gavage doses and blood collection times， MGC803， MKN45， AGS， and HGC27 cells were exposed to 5%～50% concentrations of drug-containing serum， and CCK8 assay was employed to detect the inhibitory effects of different gavage doses， blood collection times， and volume fractions of BXD drug-containing serum on the proliferation of gastric cancer cells. The test results showed that compared with other time points， all BXD drug-containing serums had the strongest inhibitory effect on gastric cancer cells at the blood collection time of 120 minutes. Compared with the low-dose BXD group， the medium-dose BXD group had a strong inhibitory effect on gastric cancer cells， and there was no significant difference between the medium-dose and high-dose BXD groups. Based on the analysis of the inhibitory effects of 10 concentrations ranging from 5% to 50% on different gastric cancer cells， the IC50 values of all drug-containing serums collected 120 minutes after gavage in the medium-dose BXD group were 20%. Analysis of the inhibitory effects of different gavage doses， blood collection times， and volume fractions on different gastric cancer cells revealed that a medium dose of BXD， blood collection time of 120 minutes，and a volume fraction of 20% had the strongest inhibitory effect on gastric cancer cells. Therefore， the medicated serum with a blood collection time of 120 minutes and a volume fraction of 20% in the medium-dose BXD group had the best pharmacodynamic effect on gastric cancer cells.

Key words∶Banxiaxiexin Decoction-containing serum; gastric cancer; cell proliferation; Chinese medicine serum pharmacology; time-effect;dose-effect

以血清藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)的體外實(shí)驗(yàn)是研究中藥藥效機(jī)制最常見的研究方法，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作對(duì)中藥的含藥血清濃度篩選是最關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分組數(shù)量和藥效機(jī)制具有重要作用。影響中藥最佳含藥血清體積分?jǐn)?shù)主要有中藥灌胃劑量、采血時(shí)間和血清濃度梯度3個(gè)方面，本研究基于中藥灌胃劑量、采血時(shí)間和含藥血清體積分?jǐn)?shù)3個(gè)方面進(jìn)行血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，以期為臨床前中藥藥效機(jī)理研究提供指導(dǎo)方向。

既往臨床研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯（Banxiaxiexin decoction，BXD）能夠有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變發(fā)展［1-2］，促進(jìn)胃癌患者術(shù)后康復(fù)［3-4］，增強(qiáng)胃癌化療敏感性，減輕化療不良反應(yīng)［5-6］等作用，為進(jìn)一步探討B(tài)XD在胃癌中的作用機(jī)制其防治，摸索該方在體外研究中含藥血清抑制胃癌細(xì)胞增殖的最佳時(shí)效和量效關(guān)系。本研究將不同劑量的BXD藥液灌胃Wistar大鼠，不同時(shí)間點(diǎn)采集大鼠血清，按不同體積分?jǐn)?shù)添加至胃癌細(xì)胞中，以探討B(tài)XD含藥血清對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖影響的時(shí)效和量效關(guān)系，旨在為該方的進(jìn)一步血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1" 實(shí)驗(yàn)材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

6周齡SPF級(jí)Wistar大鼠50只，體質(zhì)量（180～220 g），由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（京）2021-0006。于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（26±2）℃、濕度 （50±10）%，光照明/暗周期12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)了山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)：SDUTCM20230828016）。

人胃癌細(xì)胞HGC27、MKN45和 AGS 購(gòu)自于上海安為生物科技有限公司。人胃癌MGC803細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心，于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)條件為HGC27：89% DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素；MKN45和MGC803：89%1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素；AGS：89% F12K培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1%青鏈霉素。4種培養(yǎng)基均置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2" 實(shí)驗(yàn)藥物

清半夏（批號(hào)：2301002）34.5 g，黃芩（批號(hào)：230402）41.4 g，干姜（批號(hào)：230401）41.4 g，人參（批號(hào)：2305004）41.4 g，炒甘草（批號(hào)：230303）41.4 g，黃連（批號(hào)：230401）13.8 g，大棗（批號(hào)：230301）36 g。上述藥材均購(gòu)自安國(guó)市安興中藥飲片有限公司，所有藥材均通過(guò)國(guó)家有關(guān)部門質(zhì)檢。

1.3" 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)： 11875093）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：11965118）、F12K培養(yǎng)基（批號(hào)：21127030）、青-鏈霉素溶液（批號(hào)：15140122）、0.25%胰酶（批號(hào)：25200056）均購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清（批號(hào)：13011-8611）購(gòu)自杭州四季青生物有限公司，CCK8試劑盒（批號(hào)：C0038）購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.4" 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光倒置顯微鏡（型號(hào)：BX43）購(gòu)自O(shè)LYMPUS，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：8000水套式）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)：LabsystemsMultiskan MS352）購(gòu)自芬蘭，高速離心機(jī)（型號(hào)：Icen-24R）購(gòu)自杭州奧盛，超凈工作臺(tái)（型號(hào)：SW-CJ-1D）購(gòu)自蘇州凈化。

2" 實(shí)驗(yàn)方法

2.1" 實(shí)驗(yàn)藥物制備

將半夏瀉心湯中七味中藥飲片加水2 000 mL，煮取1 200 mL，去藥渣，再濃縮至600 mL，生藥量3.57 g/kg，按照人與大鼠體表?yè)Q算后BXD低、中、高劑量組分別按照11.25、22.50、45.00 g/kg劑量灌胃，每日2次，連續(xù)3 d。

2.2" 含藥血清制備

將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組（20只），BXD低劑量組（10只），BXD中劑量組（10只），BXD高劑量組（10只），經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算大鼠的BXD低、中、高給藥量分別是11.25、22.50、45.00 g/kg，每次2 mL，每日2次，空白組給予等量的蒸餾水，連續(xù)3 d。各組大鼠再隨機(jī)分為5組，每組2只，分別于末次給藥后的30、60、90、120、150 min，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，4 ℃冰箱靜置2 h后3 500 r/min15 min取上清，同組混合，對(duì)血清進(jìn)行56 ℃水浴，30 min滅活，經(jīng)0.22 μm針頭微孔濾器過(guò)濾除菌，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3" BXD含藥血清不同灌胃劑量對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

采用CCK8法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄舊培養(yǎng)基，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的同一時(shí)間點(diǎn)的不同灌胃劑量（低、中、高劑量組）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL每孔，孵育24 h后，每孔加入

10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度（optical density，OD）值。細(xì)胞增殖率公式如下所示：

細(xì)胞增殖率=［（實(shí)驗(yàn)組OD值-溶劑對(duì)照組OD值）／（空白組OD值-溶劑對(duì)照組OD值）］×100%。

最佳中藥含藥血清濃度篩選通過(guò)設(shè)置多組不同中藥劑量進(jìn)行動(dòng)物灌胃，同一時(shí)間采血，每組中藥血清濃度相同干預(yù)細(xì)胞，將動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、BXD低劑量組、BXD中劑量組、BXD高劑量組。3組中藥組分別給予人動(dòng)物等效劑量的0.5倍、1倍、2倍灌胃，連續(xù)3 d后采血，離心取血清后于胃癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)流程圖見圖1。

2.4" BXD含藥血清不同采血時(shí)間對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

采用CCK8法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，24 h后更換為含藥血清的培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的同一灌胃劑量的不同采血時(shí)間（30、60、90、120、150 min）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，孵育24 h后，其余部分同2.3。

口服中藥在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程包括吸收、分布、代謝和排泄等方面，大部分藥物在動(dòng)物體內(nèi)是按照藥物動(dòng)力學(xué)消除，因此在動(dòng)物灌胃后，體內(nèi)血藥濃度隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)［7］，最理想的采血時(shí)間是血藥濃度達(dá)峰值時(shí)采血，由于受動(dòng)物品種、藥物及給藥次數(shù)等影響，采血時(shí)間亦不同，因此實(shí)驗(yàn)選用相同中藥劑量給藥后，動(dòng)物體內(nèi)在不同時(shí)間段含有不同的含藥濃度進(jìn)行采血，從而篩選出最佳采血時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)將制備BXD含藥血清的動(dòng)物隨機(jī)分為BXD組和空白組，中藥組分灌胃后的30、60、90、120、150 min采血，將含藥血清和空白血清以相同的體積分?jǐn)?shù)干預(yù)胃癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)流程圖見圖2。

2.5" BXD含藥血清不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖的影響

以不同灌胃劑量和不同采血時(shí)間的BXD含藥血清分別干預(yù)胃癌細(xì)胞后篩選其最佳的灌胃濃度和采血時(shí)間，隨后根據(jù)選定的BXD灌胃劑量和采血時(shí)間進(jìn)行BXD含藥血清半抑制濃度梯度篩選。設(shè)空白血清組、溶劑對(duì)照組、BXD給藥組，每組5復(fù)孔，重復(fù)3次。BXD組設(shè)置10個(gè)濃度梯度，分別是體積分?jǐn)?shù)5%BXD＋45%空白血清，10%BXD＋40%空白血清，15%BXD＋35%空白血清，……，45%BXD＋5%空白血清，50%BXD；空白組加入50%空白血清。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入相應(yīng)的不同體積分?jǐn)?shù)的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，分別孵育24 h、48 h和72 h后，其余部分同2.3。

最佳中藥含藥血清濃度篩選方法通過(guò)只設(shè)置1組中藥劑量進(jìn)行動(dòng)物灌胃，取得的含藥血清稀釋成不同體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行干預(yù)細(xì)胞，將制備的BXD含藥血清分為溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組及體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%和50%含藥血清溶液共10組，每組5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，干預(yù)一定時(shí)間后進(jìn)行CCK8法進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞活率，計(jì)算最佳半抑制濃度IC50，以此篩選出最佳含藥血清濃度。具體流程見圖3。

2.6" BXD不同灌胃劑量、采血時(shí)間和體積分?jǐn)?shù)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803、AGS、MKN45、HGC27細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄去舊培養(yǎng)液，按照分組設(shè)置，加入不同灌胃劑量（BXD高、中、低劑量組），不同采血時(shí)間（30、60、90、120、150 min），不同體積分?jǐn)?shù)（10%和20%）的BXD含藥血清培養(yǎng)基100 μL/孔，孵育48 h后，其余部分同2.3。

最佳中藥含藥血清濃度的篩選方法通過(guò)設(shè)置多組不同中藥劑量進(jìn)行動(dòng)物灌胃，再不同時(shí)間采血，每組中藥血清按照不同體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行干預(yù)細(xì)胞，將制備的BXD含藥血清的動(dòng)物隨機(jī)分成空白組、BXD低劑量組、BXD中劑量組、BXD高劑量組。3組BXD組又分成給藥后30、60、90、120、150 min采血，按照10%和20%的給藥血清進(jìn)行分組，具體分組信息為10%給藥組：10%含藥血清＋10%空白血清；20%給藥組：20%含藥血清＋0%空白血清；20%空白血清組： 0%含藥血清＋20%空白血清，干預(yù)細(xì)胞48 h后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。實(shí)驗(yàn)流程見圖4。

2.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的協(xié)方差分析，并利用GraphPad Prism8.0進(jìn)行IC50繪制及計(jì)算。

3" 結(jié)果

3.1" 不同灌胃劑量、相同采血時(shí)間和體積分?jǐn)?shù)

3.1.1" BXD不同灌胃劑量組對(duì) MGC803細(xì)胞的抑制作用

圖5結(jié)果顯示，10%體積分?jǐn)?shù)的BXD低劑量組在采血時(shí)間30 min時(shí)對(duì)MGC803細(xì)胞具有促生長(zhǎng)作用，而在90、120、150 min中抑制細(xì)胞增殖（Plt;0.01），BXD中劑量組和高劑量組在60、90、120、150 min中均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），20%（體積分?jǐn)?shù)）的細(xì)胞增殖率均低于10%的BXD含藥血清，且以BXD中劑量組的細(xì)胞抑制率最顯著，且BXD高劑量組超出人體正常用量，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用BXD中劑量組進(jìn)行研究。

3.1.2" BXD不同灌胃劑量組對(duì)AGS細(xì)胞的抑制作用

圖6結(jié)果顯示，不管10%還是20%的BXD中劑量組在采血時(shí)間60、120、150 min中均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），而BXD低劑量組僅在20%，采血時(shí)間為90 min時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），BXD高劑量組在60 min和120 min采血時(shí)間上具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。由此， BXD中劑量組對(duì)AGS細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，后續(xù)將采用BXD中劑量組進(jìn)行研究。

3.1.3" BXD不同灌胃劑量組對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制作用

圖7結(jié)果顯示，10%的BXD低劑量組對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45具有促生長(zhǎng)作用，采血時(shí)間為60、90、120 min時(shí)BXD高、中、低劑量組均對(duì)MKN45細(xì)胞具有抑制增殖作用（Plt;0.01），且BXD中劑量組和高劑量組之間無(wú)顯著性差異，由于BXD高劑量組超出人體正常用量，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用BXD中劑量組進(jìn)行研究。

3.1.4" BXD不同灌胃劑量組對(duì)HGC27細(xì)胞的抑制作用

圖8結(jié)果顯示，低劑量BXD組具有促胃癌細(xì)胞HGC27生長(zhǎng)的作用，BXD高劑量組對(duì)維阿細(xì)胞的抑制作用無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而20%的BXD中劑量組對(duì)在采血時(shí)間120 min時(shí)具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用BXD中劑量組進(jìn)行研究。

3.2" 不同采血時(shí)間，相同灌胃劑量和體積分?jǐn)?shù)

3.2.1" BXD不同采血時(shí)間對(duì)MGC803細(xì)胞抑制作用

圖9結(jié)果顯示，與同組其它采血時(shí)間比較，MGC803細(xì)胞中60、90、120和150 minBXD含藥血清組的OD值與空白血清組均有顯著性差異 （Plt;0.01），且以120 min的OD值變化最大。因此，以下實(shí)驗(yàn)將采血時(shí)間點(diǎn)定于末次灌胃后120 min。

3.2.2" BXD不同采血時(shí)間對(duì)AGS細(xì)胞抑制作用

圖10結(jié)果顯示，與同組其它采血時(shí)間比較，AGS細(xì)胞中中劑量和高劑量灌胃的120 min BXD含藥血清組的OD值與空白血清組比有顯著性差異 （Plt;0.01）。因此，以下實(shí)驗(yàn)將采血時(shí)間點(diǎn)定于末次灌胃后120 min。

3.2.3" BXD不同采血時(shí)間對(duì)MKN45細(xì)胞抑制作用

圖11結(jié)果顯示，與同組其它采血時(shí)間比較，MKN45細(xì)胞中高、中、低劑量組的90和120 min BXD含藥血清組的OD值與空白血清組比有顯著性差異 （Plt;0.01），且以120 min的BXD含藥血清抑制細(xì)胞增殖的變化顯著。因此， 以下實(shí)驗(yàn)將采血時(shí)間點(diǎn)定于末次灌胃后120 min。

3.2.4" BXD不同采血時(shí)間對(duì)HGC27細(xì)胞抑制作用

圖12結(jié)果顯示，與同組其它采血時(shí)間比較，HGC27細(xì)胞對(duì)BXD含藥血清的敏感性較弱，僅在中劑量灌胃的120 min BXD含藥血清組與空白血清組比較有顯著性差異 （Plt;0.01）。因此， 以下實(shí)驗(yàn)將采血時(shí)間點(diǎn)定于末次灌胃后120 min。

3.3" 不同體積分?jǐn)?shù)，相同灌胃劑量和采血時(shí)間

3.3.1" BXD不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)MGC803細(xì)胞的干預(yù)作用

圖5顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖9提示BXD含藥血清最佳的取血時(shí)間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制MGC803細(xì)胞增殖的最佳體積分?jǐn)?shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進(jìn)行研究。經(jīng)CCK8檢測(cè)不同處理后的OD值和細(xì)胞活率變化見表1，應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細(xì)胞MGC803 24 h的IC50為23.09%，48 h的IC50為22.38%，72 h的IC50為21.46%，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IC50的平均值為22.31%，因此，20%的含藥血清用于后續(xù)胃癌細(xì)胞MGC803的實(shí)驗(yàn)。

3.3.2" BXD不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)AGS細(xì)胞的干預(yù)作用

圖6顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖10提示BXD含藥血清最佳的取血時(shí)間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制AGS細(xì)胞增殖的最佳濃度以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進(jìn)行研究。經(jīng)CCK8檢測(cè)不同處理后的OD值和細(xì)胞活率變化見表2。應(yīng)用GraphPad Prism 8分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細(xì)胞AGS的24 h的IC50為25.79%，48 h的IC50為20.30%，72 h的IC50為20.58%，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IC50的平均值為22.22%，因此，20%的半夏瀉心湯含藥血清濃度用于后續(xù)胃癌細(xì)胞AGS的實(shí)驗(yàn)。

3.3.3" BXD不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)MKN45細(xì)胞的干預(yù)作用

圖7顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖11提示BXD含藥血清最佳的取血時(shí)間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制MKN45細(xì)胞增殖的最佳體積分?jǐn)?shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進(jìn)行研究。經(jīng)CCK8檢測(cè)不同處理后的OD值和細(xì)胞活率變化見表3。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細(xì)胞MKN45的24 h的IC50為22.47%，48 h的IC50為23.02%，72 h的IC50為21.43%，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IC50的平均值為22.30%，因此，20%的半夏瀉心湯含藥血清體積分?jǐn)?shù)用于后續(xù)胃癌細(xì)胞MKN45的實(shí)驗(yàn)。

3.3.4" BXD不同體積分?jǐn)?shù)對(duì)HGC27細(xì)胞的干預(yù)作用

圖8顯示BXD的最佳灌胃劑量是中劑量組，圖12提示BXD含藥血清最佳的取血時(shí)間是灌胃后2 h，故含藥血清抑制HGC27細(xì)胞增殖的體積分?jǐn)?shù)以BXD中劑量灌胃120 min后所取血清進(jìn)行研究，經(jīng)CCK8檢測(cè)不同處理后的OD值和細(xì)胞活率變化見表4。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.3分析發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用于胃癌細(xì)胞AGS的24 h的IC50為20.56%，48 h的IC50為23. 49%，72 h的IC50為23.45%，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IC50的平均值為22.5%，綜上，20%的半夏瀉心湯含藥血清體積分?jǐn)?shù)用于后續(xù)胃癌細(xì)胞HGC27的實(shí)驗(yàn)。

3.4" 不同灌胃劑量、采血時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)

3.4.1" BXD不同灌胃劑量、采血時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)含藥血清對(duì)MGC803細(xì)胞的抑制作用

如表5所示，BXD低、中、高灌胃劑量在不同取血時(shí)間及體積分?jǐn)?shù)抑制胃癌細(xì)胞MGC803均于20%時(shí)達(dá)到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制MGC803增殖的作用。不同取血時(shí)間比較，120 min值均低于其他4個(gè)取血時(shí)間（Plt;0.05），且與空白血清組具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。不同體積分?jǐn)?shù)比較，體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞的抑制作用最佳。

3.4.2" BXD不同灌胃劑量、采血時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞的抑制作用

如表6所示，BXD低、中、高灌胃劑量和不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清抑制胃癌細(xì)胞AGS時(shí)均在BXD中劑量組20%體積分?jǐn)?shù)時(shí)達(dá)到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制AGS增殖的作用。不同取血時(shí)間比較，120 min值均低于其他4個(gè)取血時(shí)間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。不同體積分?jǐn)?shù)比較，體積分?jǐn)?shù)20%

的含藥20%血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的抑制作用最佳。

3.4.3" BXD不同灌胃劑量、采血時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)的含藥血清對(duì)MKN45細(xì)胞的抑制作用

如表7所示，BXD低、中、高灌胃劑量和不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清抑制胃癌細(xì)胞MKN45時(shí)均在BXD中劑量組20%體積分?jǐn)?shù)時(shí)達(dá)到峰值，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制MKN45增殖的作用。不同取血時(shí)間比較，120 min值均低于其他4個(gè)取血時(shí)間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），不同體積分?jǐn)?shù)比較，體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清所得的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分?jǐn)?shù)20%的劑量對(duì)胃癌MKN45細(xì)胞的抑制作用最佳。

3.4.4" BXD不同灌胃劑量、采血時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)含藥血清對(duì)HGC27細(xì)胞的抑制作用

如表8所示，BXD低、中、高灌胃劑量含藥血清抑制HGC27細(xì)胞時(shí)均在BXD中劑量組時(shí)抑制作用最強(qiáng)，10%和20%體積分?jǐn)?shù)含藥血清干預(yù)時(shí)，20%的體積分?jǐn)?shù)對(duì)HGC27的抑制作用較強(qiáng)，表明高濃度復(fù)方含藥血清具有抑制HGC27增殖的作用。不同取血時(shí)間比較，120 min值均低于其他4個(gè)取血時(shí)間（Plt;0.05），且與空白血清組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。不同體積分?jǐn)?shù)比較，

體積分?jǐn)?shù)20%的含藥血清的OD值低于10%的OD值，因此BXD中劑量灌胃，120 min采血，體積分?jǐn)?shù)20%的劑量對(duì)胃癌MKN45細(xì)胞的抑制作用最佳。

4" 討論

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是目前醫(yī)學(xué)研究中常見的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被用于輔助疾病診斷、探究疾病發(fā)生發(fā)展及藥物防治的療效性和分子機(jī)制等。隨著中醫(yī)藥領(lǐng)域體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，中藥干預(yù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)由最初的中藥粗提物直接添加，逐步發(fā)展成為基于血清藥理學(xué)的含藥血清添加方式［8］，即中藥血清藥理學(xué)，它是指將中藥或復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液、分離血清，以含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中，從而研究其藥理作用的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法［9］。中藥血清藥理學(xué)可以利用生物體對(duì)中藥復(fù)雜成分的選擇作用，反映中藥在體內(nèi)的消化、吸收、代謝、排泄過(guò)程，由于含藥血清在加入到體外培養(yǎng)體系中時(shí)其有效成分將被稀釋，無(wú)法做到體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度一致［10］，因此含藥血清并不是體積分?jǐn)?shù)越大越好［11］；且由于細(xì)胞增殖抑制作用，高濃度的血清或高濃度的藥效成分均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞永久性損傷甚至死亡，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展［12］，不同細(xì)胞對(duì)含藥血清的耐受性和敏感性亦不相同。因此，基于中藥血清藥理學(xué)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，篩選中藥含藥血清的最佳濃度是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要的步驟，同時(shí)可以減少后續(xù)研究的中藥干預(yù)組數(shù)，降低因?qū)嶒?yàn)步驟過(guò)多出現(xiàn)的操作失誤，縮短檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省經(jīng)費(fèi)。

4.1" 含藥血清的量效關(guān)系研究

含藥血清中藥量的多少取決于動(dòng)物灌胃劑量和培養(yǎng)體系中含藥血清的體積分?jǐn)?shù)占比，在一定條件范圍內(nèi)，動(dòng)物灌胃劑量愈多，則進(jìn)入血液循環(huán)的藥物愈多，血藥濃度愈高，故所取含藥血清的體外藥理效應(yīng)愈強(qiáng)；此外細(xì)胞培養(yǎng)體系中含藥血清體積分?jǐn)?shù)與藥效成正比，在一定范圍內(nèi)，藥理效應(yīng)隨含藥血清濃度增加而增強(qiáng)，血清濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，在研究含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖作用時(shí)，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此，篩選相對(duì)固定含藥血清濃度和適宜的灌胃劑量是研究藥物含藥血清量效關(guān)系的主要方法。

血清是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，血清濃度低導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢，而血清濃度太高會(huì)加速細(xì)胞分化，造成細(xì)胞老化，因此血清含量高低與藥物藥效作用強(qiáng)弱密切相關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物血清中含多種活性物質(zhì)，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需嚴(yán)格設(shè)置空白血清組，以此來(lái)避免血清中所含干擾性物質(zhì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)影響［12］。本實(shí)驗(yàn)中的含藥血清體積分?jǐn)?shù)占比分組是利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋配置，確保每組的反應(yīng)體系中只存在動(dòng)物血清，且總血清體積分?jǐn)?shù)為50%，如5%含藥血清由5 μL含藥血清加45 μL空白血清配制而成；10%含藥血清由10 μL含藥血清加40 μL空白血清配制而成，空白血清組只需設(shè)置1組50%空白血清組，該方法可以減少空白血清組數(shù)的設(shè)置，減少實(shí)驗(yàn)操作上的偏倚。

4.2" 含藥血清時(shí)效關(guān)系研究

在時(shí)效方面，血清藥理學(xué)一般是參照中藥的半衰期，認(rèn)為5～7個(gè)半衰期，即可達(dá)到穩(wěn)態(tài)血

藥濃度。有研究通過(guò)對(duì)大量重要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析后得出一種普遍且使用的給藥時(shí)間，認(rèn)為每日2次，早晚各一次，連續(xù)3 d，末次給藥后30～120 min內(nèi)采血的方式稱之為“通法”［13-14］，而給藥時(shí)間和采血時(shí)間的確定是由血藥濃度確定的，多數(shù)藥物在體內(nèi)按照一級(jí)動(dòng)力學(xué)消除，藥物經(jīng)過(guò)4～5個(gè)半衰期（t1/2）達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度，即藥物的半衰期長(zhǎng)短決定給藥時(shí)間的長(zhǎng)短。藥物在體內(nèi)經(jīng)吸收、分布、代謝及排泄過(guò)程，給藥后體內(nèi)的血藥濃度隨時(shí)間推移先升高后降低［7］，理想狀態(tài)下的采血時(shí)間是血藥濃度達(dá)峰值的時(shí)刻，但由于給藥劑量、給藥次數(shù)等多種因素影響，采血時(shí)間峰值亦不盡相同，因此，在研究血清藥理學(xué)之前，進(jìn)行時(shí)效關(guān)系的研究是必要的，以此確定給藥后采血的最佳時(shí)間點(diǎn)，避免因藥效物質(zhì)被代謝減少或尚未吸收造成的假陰性結(jié)果［15］。本實(shí)驗(yàn)采用每日給藥2次，連續(xù)3 d的給藥方式，末次給藥后分別在給藥后30、60、90、120、150 min采血，以尋找更準(zhǔn)確的采血時(shí)間。

中藥含藥血清藥理學(xué)研究的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化依賴于其方法學(xué)研究的不斷發(fā)展。近年來(lái)，在中藥含藥血清研究方法方面進(jìn)行系統(tǒng)化的研究，而其中藥物血清的時(shí)效量效關(guān)系是研究的重要部分。通過(guò)對(duì)時(shí)效（不同采血時(shí)間的含藥血清藥效）和量效（不同灌胃劑量和不同體積分?jǐn)?shù)的含藥血清藥效）關(guān)系進(jìn)行研究，以此來(lái)確定合適的動(dòng)物給藥劑量、采血時(shí)間、含藥血清體積分?jǐn)?shù)等。本實(shí)驗(yàn)在時(shí)效關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，最佳采血時(shí)間與給藥劑量無(wú)關(guān)，但與血藥達(dá)峰濃度密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)采用每日2次，連續(xù)3 d的給藥方式制備BXD含藥血清，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)理論，以固定給藥時(shí)間間隔、相同劑量多次重復(fù)給藥使藥物在體內(nèi)蓄積，血藥濃度已近乎坪值，給藥間隔時(shí)間影響坪值的波動(dòng)范圍，對(duì)坪值的平均高度無(wú)影響。

半夏瀉心湯是由清半夏、人參、炒甘草、干姜、大棗、黃芩、黃連7味藥組成，具有消痞散結(jié)，平調(diào)寒熱功效，主治虛實(shí)并見、寒熱錯(cuò)雜之痞證，臨床多用于治療消化道相關(guān)病證，亦常用于腫瘤及并發(fā)癥和放化療后的不良反應(yīng)，在以往的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，BXD對(duì)胃癌細(xì)胞具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察低、中、高灌胃劑量及30、60、90、120、150 min不同取血時(shí)間所得的BXD含藥血清對(duì)OD值的影響，以確定其最佳的灌胃劑量及取血時(shí)間，并在此基礎(chǔ)上探討5%～50%之間10個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清抑制胃癌細(xì)胞增殖的最佳體積分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，在量效關(guān)系研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以中劑量組的20%時(shí)抑制胃癌細(xì)胞增殖最為明顯，添加體積分?jǐn)?shù)高于20%后會(huì)造成細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)抑制，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)，這一結(jié)果與既往中藥藥理研究結(jié)果相吻合。在時(shí)效關(guān)系研究中，BXD高、中、低劑量組均于末次給藥后的120 min對(duì)胃癌細(xì)胞增殖影響最明顯。本研究基于血清藥理學(xué)方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析BXD含藥血清對(duì)人胃癌細(xì)胞具有抑制細(xì)胞增殖的作用，提示我們使用中藥治療胃癌具有廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)首次確定了半夏瀉心湯含藥血清制備的最佳灌胃劑量、最佳采血時(shí)間和添加到體系反應(yīng)中的最佳體積分?jǐn)?shù)，為今后引用血清藥理學(xué)的方法研究半夏瀉心湯的分子藥理作用機(jī)制提供了依據(jù)。

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