N-乙酰神經(jīng)氨酸中通過(guò)抑制Nrf2軸促進(jìn)缺氧/復(fù)氧損傷的H9C2心肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡

摘要：目的 基于鐵死亡探討N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）加劇H9C2大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷（H/RI）的影響及作用機(jī)制。方法 以大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞作為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為Control組、H/R 0 h組、H/R 3 h組、H/R 6 h組、H/R 9 h組、H/R 12 h組和H/R 15 h組，在缺氧缺糖8 h，分別復(fù)氧復(fù)糖0、3、6、9、12、15 h建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型模擬心肌缺血再灌注損傷，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇最佳復(fù)氧時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)最佳復(fù)氧時(shí)間，復(fù)氧時(shí)給予不同Neu5Ac濃度的完全培養(yǎng)基作為復(fù)氧液，將細(xì)胞分為Control、0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L組，通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇最佳藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前述最佳復(fù)氧時(shí)間和最佳給藥濃度探討Neu5Ac對(duì)H9C2心肌細(xì)胞加劇損傷的機(jī)制，將H9C2心肌細(xì)胞分為5組：Control組、H/R組、H/R+Neu5Ac組、H/R+Fer-1（鐵死亡抑制劑）組、H/R+Neu5Ac+Fer-1組。通過(guò)檢測(cè)5組細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，判斷各組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平；使用FerroOrange 熒光探針和C11 BODIPY 581/591 熒光探針?lè)謩e檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+和脂質(zhì)過(guò)氧化物（Lipid ROS）水平；此外，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)Neu5Ac 在H9C2 心肌細(xì)胞H/RI 中對(duì)核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）、胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（xCT）蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 H9C2 心肌細(xì)胞缺氧缺糖8 h 后，H/R 6 h 組和除H/R 9 h 組之外的其他組相比，Nrf2、GPX4、HO-1、FSP1 蛋白表達(dá)最少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.001）。與Control組相比，不同濃度藥物的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力均明顯降低（Plt;0.0001），且隨藥物濃度逐漸增大，細(xì)胞活力逐漸減小，并測(cè)得該藥物的半抑制濃度IC50=30.07 mmol/L。選擇心肌細(xì)胞未發(fā)生明顯鐵死亡的時(shí)間，即缺氧缺糖8 h合并復(fù)氧復(fù)糖3 h，且復(fù)氧復(fù)糖時(shí)Neu5Ac濃度為30 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，Neu5Ac可以提高SOD活性，增加Fe2+和Lipid ROS水平，降低Nrf2、GPX4、xCT、HO-1、FSP1等5種蛋白的表達(dá)（Plt;0.05）。在Neu5Ac的基……