潮州市售米粉轉基因成分的檢測與分析

摘要為進一步了解潮州市售米粉轉基因成分的情況，隨機購買潮州城區(qū)主要市場售賣的米粉進行檢測與分析。通過十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取所購買的米粉樣品的DNA成分，采用常規(guī)聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光PCR等技術對外源基因CaMV35S、tNOS進行檢測。結果表明，有接近50%的檢測米粉樣品含有轉基因成分，且均沒有任何轉基因食品標識。因此，為了促進米粉等大米制品的生產和銷售的規(guī)范化，必須高度重視轉基因食品標識制度的落實，建立起有效的轉基因大米制品的監(jiān)管體系。

關鍵詞米粉；轉基因成分；外源基因；內源基因

中圖分類號TS212.7"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2025）02-0206-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.041

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

DetectionandAnalysisofGeneticallyModifiedIngredientsinRiceNoodlesinChaozhouCity

WANGMao-xian，SHENLin-xin，FURuo-sietal

（SchoolofLifeScienceandFoodEngineering，HanshanNormalUniversity，Chaozhou，Guangdong521041）

AbstractTofurtherunderstandthepresenceofgeneticallymodifiedingredientsinricenoodlesinChaozhouCity，werandomlypurchasedricenoodlesinmajormarketsinChaozhoufortestingandanalysis.TheDNAcomponentsofthericefloursampleswereextractedbythecetyltrimethylammoniumbromide（CTAB）method，andtheexogenousgenesCaMV35SandtNOSweredetectedbyconventionalpolymerasechainreaction（PCR）andreal-timefluorescencePCR.Theresultsshowedthatnearly50%ofthedetectedricenoodlessamplescontainedgeneticallymodifiedingredients，andnoneofthemhadanygeneticallymodifiedfoodlabel.Therefore，inordertopromotethestandardizationoftheproductionandsaleofriceproducts，suchasricenoodles，itisnecessarytoattachgreatimportancetotheimplementationofalabelingsystemforgeneticallymodified（GM）foodproductsandestablishaneffectivesupervisionsystemforGMriceproducts.

KeywordsRicenoodle;Geneticallymodifiedingredient;Exogenousgenes;Endogenousgenes

隨著科學技術尤其轉基因技術的不斷地發(fā)展，1996年轉基因作物開始商業(yè)化生產，轉基因農作物種植規(guī)模迅速擴大。轉基因食品也在不斷地出現并深入到公眾日常生活的方方面面^［1］。由于轉基因食品還沒有在科學界和公眾之間達成統(tǒng)一的共識，轉基因食品的安全問題已經成為公眾持續(xù)關注的焦點。米粉，這里是指以大米為原料，經浸泡、蒸煮、壓條等工序制成條狀、絲狀的米制品，而不是詞義上理解的以大米為原料研磨制成的粉狀物料。米粉是我國的傳統(tǒng)食品，結構柔韌，富有彈性，水煮不糊湯，干炒不易斷，配以各種菜碼或湯料進行湯煮或干炒，爽滑入味，深受廣大消費者的喜愛^［2］。對于其食用方法，有研究發(fā)現濕米粉品質受大米淀粉凝膠效果的影響^［3］，其中，不僅涉及糊化程度，更關乎老化效果。

近年來，由于米粉的利潤具有很大優(yōu)勢，大量流入我國市場，又因為其種類繁多，人們幾乎可以隨意給米粉命名，導致其類別混亂^［4］。米粉主要的銷售對象為個人或者餐飲企業(yè)，為了進一步降低成本，或在原料方面把關不合格，部分售賣者購買轉基因米粉進行售賣，導致轉基因產品大量流入市場^［5］。深圳海關在監(jiān)管過程中發(fā)現，出口大米成品中檢測出轉基因成分，說明我國某些地區(qū)在非法銷售未經國家批準的轉基因水稻種子并有水稻的種植行為，部分轉基因水稻及其大米已經流入市場^［6］。在各種品牌米粉中不斷地被檢測出含有未經批準的轉基因成分，人們不禁對自己日常生活中所吃米粉的食品安全問題感到擔憂。在轉基因檢測中，常需要檢測CaMV35S和tNOS基因。在檢測大米制品的轉基因成分時，除了檢測外源基因，還需要檢測內源基因SPS的存在情況，以確保檢測結果的準確性與可靠性。此外，轉基因大米制品的檢測需要先進行高質量DNA提取，對后續(xù)研究至關重要。提取方法的靈敏度和特異性也會直接影響后續(xù)試驗的成功^［7-8］。由于大米及大米加工品中存在的大量淀粉、蛋白及其他形式的多糖，有可能對PCR產生抑制作用^［9］。為了解潮州市售米粉的轉基因情況，該研究對潮州市售米粉進行抽樣檢驗，采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取米粉基因組DNA，并利用常規(guī)聚合酶鏈式反應（PCR）、實時熒光PCR對米粉樣品中的內源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進行雙重檢測，為相關的研究機構提供一定科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品。

此次試驗所采集的樣品來自潮州城區(qū)的楓春市場、南門市場、北門市場、西門市場、民福市場、上東平市場、臥石社光美食城、臥石綜合市場、西新市場共9個主要市場市售的米粉。米粉待檢樣品來源情況如表1所示。

1.1.2試劑和試劑盒。

Dzup柱式深加工產品基因組DNA抽提試劑盒，SGExcelFastSYBRqPCR預混液，TaqPCRMix預混液（2×，含DNA染料），核糖核酸酶A溶液，ProteinaseK，DNA分子量標準Marker（25～500bp、100～10000bp），50×TAE緩沖液，4SGreen核酸染色劑，3對上下游引物（SPSr/f、CaMV35Sr/f、tNOSr/f），瓊脂糖，以上均購自生工生物（上海）工程股份有限公司。

1.1.3儀器與設備。實時熒光PCR儀器LightCycler96（瑞士Hoffmann-LaRoche有限責任公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-RadLaboratories，Inc.）；水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；B-500型超微量紫外可見分光光度計（上海元析儀器公司）；臺式高速冷凍離心機（濟南福的機械有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇科析儀器有限公司）；常溫冰箱（青島Haier公司）。

1.2試驗方法

1.2.1米粉基因組DNA提取。

1.2.1.1

樣品預處理。采用濕的、細的米粉，對于干的米粉可采用試驗前冷水浸泡30～60min，浸泡的水同樣也倒進離心管中進行提取。取足量的米粉切碎并稱取200mg的食品粉末至2mL離心管中，每次切完一個樣品后，需對刀片進行清洗并用干凈的紙巾擦干。

1.2.1.2

樣品基因組DNA抽提。采用Dzup柱式深加工產品基因組DNA抽提試劑盒，具體步驟詳見試劑盒說明書。抽提所得到的DNA溶液置于-20℃保存或者直接用于后續(xù)試驗。

1.2.2米粉基因組DNA純度和濃度的測定。

用核酸蛋白分析儀測量OD值，在波長為260和280nm處對DNA樣品的吸光度進行測量。純度高的DNA樣品OD260nm/280nm在1.8左右，當OD260nm/280nm大于1.8時，說明樣品中還有部分RNA殘留；若OD260nm/280nm小于1.7，則表明樣品中受到酚或蛋白質的污染。倘若OD260nm/280nm為1.8～2.0，DNA質量濃度達到5～80ng/μL，則基本能夠進行后續(xù)的PCR檢測。為了后續(xù)試驗順利進行，通過基因組DNA凝膠電泳，檢測所提取的基因組DNA的質量是否可用于后續(xù)的PCR檢測。

1.2.3常規(guī)PCR檢測和瓊脂糖凝膠電泳分析。

將已提取到的米粉基因組DNA進行常規(guī)PCR檢測。分別對內源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進行擴增。常規(guī)PCR擴增體系（25μL）：上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、基因組10.5μL、TaqPCRMix預混液12.5μL。引物序列和反應循環(huán)參數如表2所示。

瓊脂糖凝膠電泳分析：完成PCR擴增后，使用1×TAE電泳緩沖液和瓊脂糖制備3%的瓊脂糖凝膠（等凝膠融化后冷卻到約60℃左右時，加入4SGreen核酸染色劑）。將10μLPCR擴增產物分別加入對應的凝膠孔中，再同時于凝膠孔中加入2.5μLDNA分子量標準Marker（25～500bp），凝膠電泳的電壓為90V，時間為45min。用凝膠成像分析系統(tǒng)進行觀察分析并記錄結果。其中SPS目的基因片段為104bp，CaMV35S目的基因片段為82bp，tNOS目的基因片段為165bp。

1.2.4實時熒光PCR檢測。

將提取到的米粉基因組DNA進行實時熒光PCR反應。首先分別對內源基因SPS和外源基因CaMV35S、tNOS進行擴增。實時熒光PCR反應體系（20μL）：基因組6μL、上游引物1μL、下游引物1μL、SGExcelFastSYBRqPCR預混液10μL，最后再用ddH2O根據DNA模板量變化補至20μL。空白對照以超純水代替模板DNA。

1.3數據處理

試驗數據以實測有效數值來表示，且均采用相關分析儀器進行記錄處理，對不同樣本的實測有效數值進行歸一化處理后進行分析。

2結果與分析

2.1米粉基因組DNA的OD260nm/280nm及其濃度的測定

此次試驗的檢測樣品來自市場及其周邊的店鋪，由于米粉有粗有細，有干有濕，以及米粉屬于加工產品，在制作過程中（研磨、蒸煮等方式）對于樣品的處理可能已經使得部分基因斷裂。前期試驗中對于提取米粉中DNA的方法多次進行嘗試探索，例如，將米粉樣品于65℃水浴加熱10min后用研缽研磨，然而得出的核酸濃度為負值；提前一晚浸泡米粉，浸泡時間過長，抽提的核酸濃度也較低。

經過不斷改良摸索得出以下的操作注意事項：首先，在試驗前處理樣品要盡量用刀切碎，而不用加熱、研磨等方法處理，防止基因進一步斷裂；其次，使用較為濕潤的米粉樣品進行提取且米粉樣品要切得盡量碎，而且試驗結果也表明細的米粉提取出來的DNA濃度較高。而干米粉以及較粗的米粉基因組DNA可能在加工過程中耗損較大，因此在提取過程可以適當延長水浴時間，由原本的0.5h延長至1.0h左右較為適宜。同時，在整個過程中一定要嚴格遵循試驗方法中提高DNA得率的措施。

由表3可知，樣品中基因組DNA均已成功提取，OD260nm/280nm為1.7～2.0，說明樣品中還有RNA沒有除盡，依舊有RNA殘留，但影響較小可忽略不計，且DNA質量濃度為5～80ng/μL，基本能夠進行后續(xù)的PCR檢測。

2.2米粉樣品中提取的基因組DNA電泳結果

將提取到的米粉基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。由圖1可見，均可看到條帶出現，而MF14～MF17米粉中提取的DNA條帶不明顯，亮度很弱，可能因為核酸濃度不高，表明樣品的DNA存在降解，這也說明了商家制作米粉的方法可能會造成米粉部分DNA斷裂。

2.3常規(guī)PCR檢測結果分析

共檢測潮州市售米粉17份，經常規(guī)PCR轉基因檢測，結果如表4所示。為了得到更加明顯的電泳結果圖，多次嘗試不同電泳時間與不同電壓的結合，最終獲得較為適宜的電泳條件。PCR擴增完成后，采用90V的電壓對其進行45min電泳，便能得到較為清晰的條帶，所得米粉外源基因常規(guī)PCR擴增結果如圖2所示。常規(guī)PCR檢測是常見的轉基因產品檢測方法，通過觀察凝膠成像分析系統(tǒng)，判斷是否存在特異性條帶，從而判斷樣品中是否存在轉基因成分。

根據常規(guī)PCR結果（圖2）可知，所有的米粉樣品均可擴增出SPS基因104bp的片段，其擴增條帶清晰明亮。在17份米粉樣品中，檢測出外源基因CaMV35S的米粉樣品數量為7份，檢測出外源基因tNOS的米粉樣品數量為0份，因此此次所檢測的米粉樣品轉基因比例為41.20％。

2.4實時熒光PCR檢測結果分析

共檢測潮州市售米粉17份，通過實時熒光PCR進行轉基因成分檢測，結果如表4所示。米粉外源基因的實時熒光PCR結果如圖3所示，此方法可以較好地克服基因組由于食品加工導致結構破碎、成分含量低，造成假陰性結果，進而使得試驗結果的準確性更高。試驗體系嚴格按照國家有關標準^［10］執(zhí)行，設置陰性對照，用于判斷系統(tǒng)是否存在著污染。

在陰性對照組沒有出現非特異性擴增現象的前提下，通過用外源基因CaMV35S和tNOS的上下游引物來擴增全部樣品，進而檢測與分析。所檢測的17份樣品中，其中有5份樣品檢測到含有外源基因CaMV35S，5份樣品檢測到含有外源基因tNOS，綜合分析可知，所檢測的17份樣品中共有8份樣品含有轉基因成分，即此次隨機檢測的米粉的轉基因成分比率為47.06%，這與常規(guī)PCR所檢測出的樣品轉基因成分比率（41.20%）以及所檢測出來的陽性樣品有一定的出入。成曉維等^［6］研究表明，在抽檢出口樣品中檢出含轉基因成分的有9份，陽性率為5%，其中，含大米轉基因成分的樣品有6份，占總陽性樣品的67%。楊冬燕等^［11］研究發(fā)現，2011—2015年深圳市場的大米及大米制品所檢測出來的轉基因比率為0.74%，說明確實存在轉基因大米違規(guī)進入大米制品生產與加工等環(huán)節(jié)的現象，且這種現象正在呈現上升的趨勢。

3結論與討論

此次試驗對17份潮州市售米粉樣品進行檢測后發(fā)現，樣品米粉中轉基因成分陽性比率大于40％，可見轉基因米粉占比偏高。此次試驗樣品均選自潮州市具有代表性的大型市場，但所有米粉均無是否含轉基因成分的食品標識。我國政府對轉基因食品的安全法規(guī)非常重視，已經初步建立了以行政法規(guī)和部門規(guī)章為主的較為嚴格的轉基因食品管制制度^［12］。我國是世界上最大的稻米生產國和消費國，轉基因水稻相比傳統(tǒng)水稻而言，產量高、價格低，導致一些地方違規(guī)種植轉基因水稻，在市場上存在轉基因稻米^［6］。由于人們普遍對轉基因食品安全性持有懷疑態(tài)度，很多人拒絕使用轉基因食品就是理所當然的。在利益的驅動下，有些米粉制造商無視國家禁止轉基因稻米生產和流通等規(guī)定，違規(guī)采用轉基因大米作為米粉生產原料，也沒有轉基因標識，這也嚴重侵犯消費者的知情權和選擇權。

隨著人民群眾生活水平和食品安全意識的提高，轉基因水稻及其制品的食品安全問題愈發(fā)引起人們重視。如何尊重消費者對轉基因食品的知情權與選擇權，這是轉基因食品監(jiān)管工作所要面對的現實問題^［13］。國家應加大對轉基因食品的市場監(jiān)管力度，完善市場監(jiān)管機制，同時加大對廣大消費者的教育和培訓。此外，由于此次研究采用的試驗樣品為米粉，屬于加工食品，在試驗過程中也需考慮樣品的基質效應及食品加工過程中帶來的DNA斷裂、降解等產生的不確定度^［14］。在后續(xù)的研究中，將考慮進行基因特異性檢測，合成引物檢測轉基因水稻中除CaMV35S啟動子、tNOS終止子之外，還有可能普遍存在的β-葡萄糖苷酸酶基因GUS、潮霉素磷酸轉移酶基因Hpt、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）產生的毒蛋白基因BtCry1Ab等外源基因^［15］。與現有的檢測方法相比，超快速PCR方法是一種使用試劑量少、經濟環(huán)保的方法，檢測時間短，為常規(guī)PCR檢測時間的18%，為實時熒光PCR檢測時間的23%^［16］。因此，還可以通過構建特異性檢測和轉化體特異性等，對轉基因成分進行更為全面和有效的檢測。同時，隨著PCR技術的不斷改進和優(yōu)化等因素，轉基因成分檢測采取快速高效的PCR技術也是勢在必行的趨勢。

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