斜帶石斑魚源的哈維氏弧菌分離與鑒定

摘要［目的］為鑒定造成湛江某養殖場斜帶石斑魚大量死亡的病原，對皮膚滋生白色隆起疥瘡的患病斜帶石斑魚進行解剖與細菌分離與純化。［方法］通過生化反應、16SrRNA基因克隆與測序，構建系統進化樹鑒定分離純化獲得的優勢菌S1。采用OD600和平板活菌計數繪制V.harveyiS1生長曲線，以R2判斷其生長曲線的相關性和可信度。［結果］鑒定結果顯示S1為哈維氏弧菌，同V.harveyihq-V149聚為一支。藥敏試驗結果顯示，斜帶石斑魚源的哈維氏弧菌S1對諾氟沙星、頭孢氨芐、左氧氟沙星、環丙沙星等12種抗生素敏感，對青霉素G、氨曲南、鏈霉素、頭孢唑林、頭孢哌酮等12種抗生素不敏感。［結論］哈維氏弧菌S1是造成湛江某養殖場斜帶石斑魚大量死亡的病原，其指數生長時間為5～12h，隨后進入平臺期。

關鍵詞哈維氏弧菌；16SrRNA；斜帶石斑魚；藥敏試驗；生長曲線

中圖分類號S94"文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2025）02-0071-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.02.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

IsolationandIdentificationofVibrioharveyifromEpinepheluscoioides

XULu-xi，GUHao-ming，XUXin-lanetal

（GuangdongOceanUniversity，Zhanjiang，Guangdong524000）

Abstract［Objective］ToidentifythepathogenthatcauseddeathsofEpinepheluscoioidesinafarminZhanjiang，conductedthedissectionofEpinepheluscoioideswithwhiteraisedscabiesonskin，andbacterialisolationandpurification.［Method］Thoughbiochemicalreactions，16SrRNAgenecloningandsequencing，aphylogenetictreewasconstructedtoidentifythedominantstrainS1.ThegrowthcurveofV.harveyiS1wasplottedbyOD600andplateviablecount.AccordingtoR2，itwoulddeterminethecorrelationandreliabilityofitsgrowthcurve.［Result］TheidentificationresultshowedthatS1isoneofVibrioharveyi，thesameasV.harveyihq-V149convergedintoonebranch.ThedrugsensitivitytestresultsshowedthatVibrioharveyiS1wassensitiveto12antibioticssuchasnorfloxacin，cephalexin，levofloxacinandciprofloxacin，butnotto12antibioticssuchaspenicillinG，amtreonam，streptomycin，cefazolinandcefoperazone.［Conclusion］VibrioharveyiS1isthepathogenwhichcauseddeathsofEpinepheluscoioidesinafarminZhanjiang.TheexponentialgrowthtimeofS1is5-12hours，andthenenterstheplateauperiod.

KeywordsVibrioharveyi;16SrRNA;Epinepheluscoioides;Drugsensitivitytest;Growthcurve

斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）又稱青斑，是鱸形目鮨科下石斑魚屬物種，作為海水養殖代表物種之一，同大黃魚、金槍魚等經濟物種一樣具有高經濟價值。人工養殖石斑魚已有20多年歷史^［1］ ，國內石斑魚養殖多集中在廣東、海南、福建。隨著養殖技術的提高和養殖規模的擴大，養殖產量穩步提升，2017年石斑魚養殖產量超過捕撈產量，其中廣東養殖規模最大，到2022年廣東地區石斑魚年產量達到93 024萬t，占全球養殖規模的45.57%。然而種質的退化、環境的污染以及超出環境容量的養殖密度導致石斑魚病害頻發，2021年廣東水產養殖中有約50%的經濟損失由病害造成^［2］。

石斑魚最主要的養殖模式是海水網箱養殖，其次是池塘養殖和工廠化養殖^{［ 3］}。高密度、高污染的養殖過程中出現的富營養化造成水體中細菌群落結構與功能的變化，在海洋中廣泛分布的弧菌已經成為海洋養殖的主要病原之一^［4］ 。部分病原性弧菌能跨物種感染，弧菌中的哈維氏弧菌正是能跨物種感染的病原弧菌之一^［5-9］。

哈維氏弧菌能感染魚類^{［5，10-11］}、蝦類^［7，12］和貝類^［6］，甚至能感染海馬^［13］，患病動物源自天津、廣東、海南等多地。在石斑魚上，持續報道患病石斑魚體內分離出哈維氏弧菌^［14-16］。而在斜帶石斑魚上，早在2004年，便有從患病斜帶石斑魚肝臟分離出哈維氏弧菌的報道^［17］，2021年又有斜帶石斑魚源哈維氏弧菌分離報道^［18］。哈維氏弧菌跨物種感染能力之強，地理分布之廣，病害泛濫時間之久^［19］，都證明其作為病原對石斑魚養殖的負面影響之大。

近期，湛江某養殖場斜帶石斑魚發病，出現魚體體表發黑、潰爛現象，同時伴有白色隆起疥瘡滋生。為研究其病因，筆者對該養殖場發病斜帶石斑魚進行致病菌分離、純化，觀察其形態特征。后通過分子技術和生理生化反應進一步對該分離菌株進行鑒定，確認其中優勢株S1為哈維氏弧菌，并根據16SrRNA基因序列多序列比對結果以Neighbor-Joining法構建斜帶石斑魚源哈維氏弧菌S1的系統進化樹，確認哈維氏弧菌S1的進化地位。同時繪制哈維氏弧菌S1的生長曲線，檢測哈維氏弧菌S1的耐藥性。以期為后續對哈維氏弧菌S1的深入研究提供基礎，為探尋斜帶石斑魚養殖過程哈維氏弧菌防治提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

于湛江某養殖基地取樣3條（5.52±0.20）cm，患病斜帶石斑魚分別標記為Ec1、Ec2、Ec3。一次性涂布棒、16S通用引物、微量細菌生化反應管（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、藥敏紙片（購自杭州濱和微生物試劑有限公司）、TSA瓊脂培養基、LB瓊脂培養基、TCSB瓊脂培養基、LB培養基、TSB培養基。

1.2試驗方法

1.2.1魚病診斷。對Ec1、Ec2、Ec3進行目檢和剖檢，將檢查結果與健康斜帶石斑魚進行比較，記錄病變組織和組織結構上的病理變化。

根據檢查結果對病原進行初步判斷。

1.2.2細菌分離與純化。

對Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個出現病理變化的部位在TSA平板、LB平板、TCSB平板劃線接種，接種平板于28℃培養箱中培養18h，觀察平板上菌落的大小、顏色和形態并記錄，挑取固體培養基上不同區域一定數量的單菌落于LB液體培養基，37℃搖床振蕩培養12h。在菌液中添加等體積濃度為40%的滅菌甘油，于-80℃保存。

1.2.316SrRNA基因序列克隆與分析。

以1∶100的比例，將“1.2.2”中分離純化的菌液接種于400μLLB液體培養基，于37℃振蕩培養6h，通過細菌全基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA后對其16SrRNA進行基因克隆、測序與分析，對細菌進行鑒定，引物分別為：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR體系為20μL：1μL模板、1μL上游引物、1μL下游引物、7μLddH2O、10μL2×SanTaqPCRMix預混液［生工生物工程（上海）股份有限公司］，35個循環。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并于紫外光下確認產物大小符合預期，寄送至生工生物工程（廣州）股份有限公司進行雙向測序，并對測序結果進行分析。

1.2.4生化鑒定。

無菌條件下，取100μLS1菌液在TSA平板上劃線涂板，于28"℃下培養12h，取單菌落接種在微量生化反應管中，將微量生化反應管放置28℃培養18～24h，根據杭州濱和微生物試劑有限公司《細菌微量生化反應管說明書》確認S1細菌生化反應結果。通過《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌鑒定手冊》對S1生化特性進行鑒定。

1.2.5藥敏試驗。

在無菌條件下制備10個TSA 平板，每個平板均勻涂布100 μL菌液，等距平貼3張藥敏紙片。以3個不同角度測量每個抑菌環直徑，最后取3次測量的平均值，長度單位mm，記錄在冊，整理并以《NCCLS藥敏試驗標準》和杭州濱和微生物試劑有限公司《抗生素類藥敏紙片使用說明書》為標準判斷藥敏試驗結果^［12］。

1.2.6細菌生長曲線繪制。

在無菌條件下接種哈維氏弧菌至裝有5 mL TSB培養基的試管中，于28 ℃培養12 h；再以1∶100比例接種菌液于裝有100 mL TSB培養基的錐形瓶，于28 ℃培養；選擇不同時間點（0、0.5、1.5、2.5、3.0、5.0、6.5、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0 h），收集菌液，在無菌條件不同稀釋倍數下（×105、×107、×109和×10¹¹倍）涂布在TSA平板上，于28 ℃培養箱中培養12 h后計數，有效計數范圍為10～200。同時通過分光光度計在波長600 nm條件下測量該時間點的OD 600值，菌液濃度較高時，將菌液稀釋至OD600值在0.4～0.6區間再進行測量，測量結果乘稀釋倍數，記錄在冊。

2結果與分析

2.1魚病診斷結果

對Ec1、Ec2、Ec33條患病斜帶石斑魚進行目檢，發現其均體表變黑，嚴重潰爛并出現不規則的白色隆起疥瘡。Ec1背鰭相對完好，尾鰭開始潰爛，胸部和尾部有充血。Ec2頭部和胸部有白色疥瘡，尾鰭有潰爛，嘴部充血。Ec3體表出現大量不規則白色疥瘡，還出現了淡黃色結節，尾鰭和背鰭完全潰爛。

對Ec1、Ec2、Ec33條患病斜帶石斑魚進行剖檢，發現其體內肝臟充血（圖1～3）。Ec1肝臟充血腫大，脾臟糜爛消解不見，腸道內部呈黃色，有積水和脹氣。Ec2鰓部糜爛呈灰色，肝臟充血，脾臟充血呈熔解態，腸道內部呈黃色。Ec3鰓部糜爛，肝臟充血，脾臟充血，腸道發紅，有脹氣。

根據目檢結果和剖檢結果，初步判斷，患病斜帶石斑魚是受到細菌感染所致。

2.2細菌分離純化

對Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個出現病理變化的部位在TSA平板、LB平板、TCSB平板劃線接種。其中，LB平板上菌落數量相較TSA平板和TCBS平板上菌落數量明顯減少，證明分離出的細菌更需要高營養培養基。TSA培養基對細菌沒有篩選作用，且營養豐富，菌落生長數量最高，但形態并無較大差異。劃線培養后TCBS瓊脂培養基對細菌具有篩選作用，Ec1、Ec2、Ec3體表病灶（Sk）、肝臟（Li）、脾臟（Sp）3個出現病理變化的部位劃線接種于TCBS平板上培養后均出現黃色且大小、形態一致的菌落。

挑選其中優勢菌落，單菌落接種于400μLLB液體培養基（表1），37℃振蕩培養12h后在菌液中添加等體積濃度為40%的滅菌甘油，于-80℃保存。

2.316SrRNA序列分析

將測序結果進行拼接通過Blast進行分析，并通過MEGA7.0進行多序列比對和同源建樹，以Neighbor-Joining法構建系統發育進化樹。分析顯示，S116SrRNA基因序列為1191bp，Blast結果顯示該菌株同哈維氏弧菌其他菌株差異較大，與2018年被報道的V.harveyihq-V149聚為一支（圖4）。

2.4細菌生化特性

哈維氏弧菌S1的生理生化反應結果顯示（表2），阿拉伯糖、鳥氨酸脫羧酶葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、甘露醇、蕈糖等反應為陽性，蛋白胨水、精氨酸雙水解酶、核糖、肌醇、硫化氫等反應為陰性。同《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌鑒定手冊》上哈維氏弧菌的生化特征吻合。

2.5藥敏試驗結果

由表3可知，藥敏試驗結果顯示，斜帶石斑魚源哈維氏弧菌對環丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、頭孢氨芐（CN）、左氧氟沙星（LVX）、米諾環素（MI）、萬古霉素（VAN）、慶大霉素（GEN）、氟苯尼考（FFC）、多西環素（DO）、四環素（TET）、阿米卡星（AMK）、亞胺培南（IPM）敏感，對青霉素G（PEN）、氨曲南（AZI）、頭孢唑林（CZ）、頭孢哌酮（CPZ）、鏈霉素（S）、氨芐西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、頭孢呋辛（CXM）、頭孢他啶（CAZ）、克林霉素（CC）、紅霉素（E）、多黏菌素B（PB）不敏感。

2.6細菌生長曲線

根據不同時間點分光光度計檢測結果和活菌計數結果繪制哈維氏弧菌S1的生長曲線（圖5、6），結果顯示，哈維氏弧菌S1指數生長時間為5～12h，在該階段中，哈維氏弧菌S1快速增殖，在12h出現峰值，隨后OD600下降后趨于平穩，活菌計數結果與OD600的變化趨勢基本吻合。

哈維氏弧菌S1的OD600與培養時間的關系表達式為：

Y1=0.0298200+0.0205400X+0.0247900X2-0.0007134X3（R2=0.9977）

哈維氏弧菌S1的菌落形成數量與培養時間的關系表達式為：

Y2=1387675+387588433X-306607341X2+65425698X3（R2=0.5418）

上述公式R2均大于0.4，表明哈維氏弧菌S1的OD600、菌落形成數量與培養時間具有相關性，但公式中哈維氏弧菌S1的菌落形成數量與培養時間的關系表達式R2lt;0.99，不足以作為直接計算公式預測哈維氏弧菌S1菌落形成數量數值，而哈維氏弧菌S1的OD600與培養時間的關系表達式R2gt;0.99，具有預測意義。

3結論與討論

對暴發病害的湛江斜帶石斑魚養殖場樣品Ec 1、Ec 2、Ec 3進行目檢時，其皮膚表面的白色隆起疥瘡是最顯著特征，因此初步懷疑是諾卡氏菌感染導致魚體皮膚、肌肉和內臟滋生白色結節^［20-24］。但在隨后的解剖檢查中發現，Ec 1、Ec 2、Ec 3肌肉與內臟均無白色結節，證明并不是諾卡氏菌感染。但Ec 1、Ec 2、Ec 3皮膚病變同常見石斑魚感染哈維氏弧菌后的癥狀，如大面積潰爛、暴露肌肉組織^［25］，都有明顯差異。此外Ec 1、Ec 2、Ec 3肝臟都有充血現象，這同半滑舌鰨感染哈維氏弧菌8 - 0635癥狀一致^［26］。肝臟細菌分離純化后鑒定結果同2021年SBY-G的分離純化后鑒定結果相同，證明哈維氏弧菌S1感染魚體體內組織，具有致病力。但脾臟糜爛的癥狀較少在哈維氏弧菌感染的魚類身上出現，不排除與感染程度有關，也可能還有其他細菌共感染導致這一癥狀。

16SrRNA是細菌高度保守的基因，是對細菌進行分類與鑒定的重要參考標準之一，選擇這一基因對哈維氏弧菌S1進行分類鑒定。哈維氏弧菌S1的16SrRNA的鑒定結果同2018年被報道的V.harveyihq-V149明確地聚為一支，同其他主要流行的哈維氏弧菌分類地位較遠，說明哈維氏弧菌S1感染途徑更易追蹤，并且對海水養殖中的哈維氏弧菌傳播途徑的相關研究具有更深意義。

16S rRNA鑒定結果與藥敏結果結合，讓它的藥敏試驗更具研究意義^［27-28］。與其他哈維氏弧菌藥敏試驗結果進行比較，其他石斑魚源哈維氏弧菌毒株敏感的氯霉素，哈維氏弧菌S1對其變成了中度敏感，而其他石斑魚源哈維氏弧菌毒株不敏感的抗生素，如鏈霉素，哈維氏弧菌S1依舊不敏感。當然也有其他石斑魚源哈維氏毒株不敏感的四環素，哈維氏弧菌S1卻對其敏感，而從患病泥蚶上分離出的哈維氏弧菌J14等同樣對四環素敏感，卻與哈維氏弧菌S1同源性并不高。哈維氏弧菌S1在藥敏試驗中同其他毒株有差異的結果進一步體現了它在傳播途徑和進化地位上與較多報道的致病哈維氏弧菌的差異性，證明其研究價值。這對研究不同毒株哈維氏弧菌毒力因子差異以及造成的病理現象差異有一定參考價值，而對不同毒株的哈維氏弧菌感染后是否會造成轉錄水平和蛋白水平的差異化表達的研究^［29-30］，也是未來需要哈維氏弧菌S1的分離與鑒定作為研究基礎的研究之一。

為后續對斜帶石斑魚源的哈維氏弧菌S1研究試驗準備，對哈維氏弧菌S1的生長曲線進行繪制，發現哈維氏弧菌S1在5h時OD600進入0.4～0.6范圍，隨后快速增長，因此哈維氏弧菌S1在5h時進入對數增長期。而在12h后進入平臺期，但活菌計數結果顯示，16h是菌落形成數量結果最高的時間點。而在16h之后，菌落形成數量有明顯下降，但OD600數值穩定，證明此時哈維氏弧菌S1進入衰亡期，TSB液體培養基中總菌數沒有明顯變化，但活菌數快速減少。哈維氏弧菌S1OD600和菌落形成數量的生長曲線證明，OD600和菌落形成數量并不成線性關系，無法通過時間或者OD600檢測結果直接預測菌落形成數量，但時間和OD600檢測結果同菌落形成數量仍存在相關性。根據生長曲線繪制結果，可以判斷，5～16h是哈維氏弧菌S1的對數生長期，活性強，適宜使用這期間的菌液進行試驗。

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