空間轉錄組學的發展及其應用進展

摘要：空間轉錄組學是一項顛覆性的生物學技術，融合了分子生物學和空間成像技術，旨在揭示組織或細胞中基因表達的空間分布。其通過對轉錄組數據進行分析，可以全面理解基因在組織或細胞水平上的空間表達規律，從而深入揭示生物系統中基因調控的時空特征及其在生物學過程中的功能和意義。該技術為發育生物學、免疫學、醫學以及農業等領域的研究提供了前所未有的幫助，為理解細胞分化、農作物發育等關鍵過程提供了支撐。詳細介紹了空間轉錄組技術的發展進程、數據分析及其在醫學以及農業領域中的主要應用，提出了該領域所存在的問題并對未來發展趨勢進行展望。

關鍵詞：空間轉錄組學；數據分析；研究進展；應用

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0609

中圖分類號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）11002309

空間轉錄組學（spatial transcriptomics，ST）可以在組織形態學下同時分析基因表達及其在組織中的空間位置，與傳統的轉錄組學相比，該技術不僅提供基因轉錄水平的全面信息，還可以揭示這些基因在組織切片中的具體空間分布，從而更細致入微地觀察細胞在組織結構中的位置及相互關系。它打破了傳統轉錄組學只能分析樣本平均表達水平的局限，允許科學家在單細胞或微區水平上解析基因表達的空間分布。這種精細的空間分辨率使得研究人員能夠更全面地了解生物體的復雜組織結構和功能動態。另外，傳統的轉錄組學技術（如RNA-Seq等）只能提供樣本中所有細胞基因表達的平均值，無法揭示細胞或組織中基因表達的空間異質性，而空間轉錄組學則可以深入挖掘組織內不同細胞類型之間、不同區域之間的基因表達差異，填補了傳統技術的空白，這對于揭示細胞異質性、理解發育過程、探索病理狀態具有革命性的意義。在腫瘤領域，通過空間轉錄組學能夠更全面地理解腫瘤微環境中各細胞類型的相互作用、腫瘤細胞的異質性以及潛在的治療靶點。在農業領域，空間轉錄組學可以觀測植物細胞生長和分化、植物細胞鑒定、抗逆應激以及微生物-植物相互作用等，從而為優化作物生長條件、培育抗逆品種、開發生物防治策略等提供新的方法和思路。

然而，隨著數據規模的急劇增加，對海量轉錄組數據的處理和解析成為嚴峻的挑戰。數據分析方法的創新尤為關鍵，需要結合生物信息學、計算機科學等多個領域的知識，以開發出能夠準確解析這些空間轉錄組數據的工具。這一領域的不斷演進將提供更深層次的生物學洞察力，推動基因表達研究走向更加立體和精細的境地。

本文系統歸納了空間轉錄組的發展歷程、數據分析方法及其在醫學和農業領域中的應用，旨在深入理解這一技術，并推動其在生命科學研究中的應用。

1 空間轉錄組的發展

空間轉錄組學是基于基因轉錄表達發展起來的新興技術。在2000年以前，科學家使用各種技術對基因表達進行分析，主要包括Northernblotting、實時PCR和基因表達微陣列等。這些技術側重于總體組織或細胞水平，通常無法提供有關基因在組織中的具體位置，因而對基因發揮功能的具體位置缺乏深入了解。

原位雜交（in situ hybridization，ISH）技術為檢測組織中特定基因的表達提供了一種手段。ISH技術通過將標記的探針與目標RNA結合，并利用顯微鏡觀測其在組織中的分布，使得特定基因在組織中的表達位置得以可視化。然而，傳統的ISH技術每次只能檢測1個基因，并且其分辨率受到探針質量和顯微成像技術的限制。盡管如此，ISH仍為組織內基因表達的研究奠定了基礎，揭示了基因表達的空間維度及其與生理功能的關系。

空間轉錄組學（ST）的概念首次由St?hl等于2016年提出，該方法實現了在組織切片上同時整合空間位置信息和轉錄組信息。ST技術通過將組織切片粘附在包含數萬個獨特條形碼的玻片上，利用這些條形碼捕獲RNA，隨后進行高通量測序，能夠生成每個位置的轉錄組譜，使得研究人員能夠對基因表達進行精細的空間分析，為空間轉錄組學研究奠定基礎。

隨著對空間轉錄組學需求的增長，各種新的技術不斷涌現。例如，原位測序（in situ sequencing，ISS）技術結合了高通量測序與組織切片內的空間定位，通過在組織切片中直接對RNA進行逆轉錄和擴增，并在位點上測序，極大地提升了空間分辨率和檢測效率，使得多基因檢測成為可能；空間條形碼技術結合單細胞測序技術（scRNA-seq withspatial barcoding）實現了單細胞水平上空間基因表達譜的繪制；Slide-seq等技術通過微珠編碼策略，進一步提高了空間分辨率，使得研究者能夠在單細胞甚至亞細胞水平上研究基因表達的空間異質性。這些技術的發展使得空間分辨率和數據復雜性有了顯著提升。

近年來，研究者們意識到將空間轉錄組學數據與其他模態的數據整合的重要性。空間轉錄組學與蛋白質組學、表觀遺傳學、代謝組學以及高分辨成像數據的結合為揭示生物系統的多層次調控機制提供了全新視角。這些整合技術通過提供多層次、多維度的數據，幫助科學家們更全面地理解生物系統的復雜性和動態變化，為精準醫學和個性化治療奠定了堅實的基礎。

2 空間轉錄組學常用技術

空間轉錄組學采用多種技術，旨在同時獲取基因表達和空間信息，從而深入了解生物體內基因在組織或細胞中的空間分布。這些技術的選擇取決于研究問題、樣本類型和試驗設計，研究人員通常會根據需要綜合運用多種技術以獲取更全面的空間轉錄組數據。一些主要的空間轉錄組學技術及其特性如表1所示。

3 空間轉錄組學數據分析

空間轉錄組學主要是通過數據分析將基因表達信息與空間位置聯系在一起從而挖掘有用的生物信息，通常包括數據預處理和下游數據分析兩步。

3. 1 空間轉錄組數據預處理

空間轉錄組數據的預處理主要涉及測序結果與組織圖像的處理和整合，通常可分為3個步驟：組織圖像處理、基因表達處理及二者的相互結合，其流程如圖1所示。

3.1.1 基于圖像數據的預處理 組織圖像處理需要進行圖像配準，然后將整個組織區域劃分為不同的點，生成與每個點區域相對應的位置索引矩陣。空間轉錄組圖像預處理通常包括圖像配準、轉錄點識別和細胞分割[1]。由于圖像的背景亮度和光斑質量存在差異，準確、高通量的信號檢測和定位是當前圖像數據分析方法的主要目標。相關的軟件主要有BarDensr[2]、DeepBlink[3]以及graph-ISS[4]等。它們能識別圖像中 RNA 的位置、類型和表達，并生成相關的位置索引矩陣和基因表達矩陣。最后，需要對圖像進行分割，將檢測到的RNA 分成單個細胞，從而生成空間單細胞數據，常用的工具有Spage2vec[5]、JSTA[6]以及SSAM[7]等。

3.1.2 基于序列數據的預處理 在基因表達處理方面，與常規的測序方法一樣，首先將測序片段與參考基因組進行比對，生成基因表達矩陣；隨后對2個矩陣的編碼信息進行匹配，將基因表達信息與相應的空間位置進行結合[8]。

經過以上的數據預處理將會產生準備充分的基因表達矩陣和位置索引矩陣，從而為轉錄組數據的下游分析做準備。

3.2 數據分析工具包

轉錄組數據的下游分析包括以下幾個部分：批次效應校正、降維和（空間）聚類、空間細胞類型注釋、空間可變基因、基因模式、空間區域、細胞-細胞相互作用、基因-基因相互作用、空間軌跡和三維模型等，用于空間轉錄組數據下游分析的新方法和新工具層出不窮。Seurat是廣泛使用的R語言包，主要用于單細胞RNA測序數據的分析，也可應用于空間轉錄組學數據，特別適合整合和比較多種測序數據[9]。Harmony是數據集成工具，通過矯正批次效應來整合不同試驗條件下的數據集，適用于大規模數據分析[10]。stLearn專為空間轉錄組學而設計，結合深度學習和統計分析方法，有效處理空間信息和基因表達數據。cell2location基于貝葉斯模型推斷單細胞RNA測序數據中細胞類型的空間分布，適用于高分辨率的空間轉錄組學數據[11]。Scanorama 利用嵌入空間匹配方法整合多個單細胞RNA測序數據集，減少批次效應偏差[12]。scHOT專注于高階轉錄組數據的單細胞層面時間序列分析，適用于探索細胞狀態在時間上的動態變化[13]。STUtility是用于空間轉錄組數據分析和可視化的 R 包，提供了一系列工具用于數據預處理、分析和可視化[14]。這些工具包在不同的研究背景下均有廣泛應用，可根據研究的具體需求、數據類型以及分析目標來選擇最合適的工具（表2）。

3.3 空間轉錄組學分析相關數據庫空間轉錄組學分析常用的數據庫包括SpatialDB[15] （http：//spatialomics. org/SpatialDB/）、STOmicsDB[16]（https：//db. cngb. org/stomics/）以及Human Cell Atlas[17]（https：//data. humancellatlas.org/）等。SpatialDB 是專門的空間轉錄組學數據庫，整合了來自多個物種和多種組織的空間轉錄組數據。它收集并整理了高通量測序技術生成的空間轉錄組數據集，包括數據處理、空間位置的標注以及相關的元數據。STOmicsDB是由中國國家基因庫（China National GeneBank，CNGB）維護的數據庫，專門收錄空間組學的數據和資源。它包括從單細胞水平到多細胞組織的空間轉錄組數據，以及與空間組學研究相關的工具和分析方法。Human Cell Atlas（HCA）是全球合作的項目，旨在構建全面的單細胞水平的人體細胞圖譜。雖然 HCA 主要專注于單細胞 RNA 測序（scRNAseq），但它也包含了大量的空間轉錄組數據集，這些數據對于理解不同組織中細胞的空間組織和基因表達具有重要意義。

4 空間轉錄組學在醫學和農業領域的應用進展

空間轉錄組學使研究者能夠在組織和細胞水平上更全面、深入地了解基因表達，提供高度的時空分辨率，以及了解基因調控在細胞和組織中特定環境中的作用，從而更好地理解生物學過程，該技術在各個研究領域中取得了廣泛應用，本文重點介紹其在醫學和農業領域的應用進展。

4.1 空間轉錄組學在醫學領域中應用

4.1.1 發育生物學 空間轉錄組學主要是通過同時捕獲和解析組織或細胞中數千個基因的表達，揭示它們在時空上的分布和調控，該技術為理解發育過程中的細胞命運決定、組織形成和基因調控提供了獨特的洞察力。Shah等[18]在小鼠海馬區域的單細胞水平上，采用空間轉錄組學技術，通過在組織切片中直接測序RNA，以捕捉和識別每個單個細胞中的基因表達，結合高空間分辨率的光學顯微鏡來確保他們能夠將基因表達與每個細胞的準確位置關聯起來。通過該方法，研究者不僅能夠了解不同細胞類型的基因表達差異，還能夠觀察到細胞在組織中的分布和相互作用。這種全面的細胞水平信息有助于深入理解海馬區域內神經元和其他細胞群體之間關系，揭示發育和功能中的時空動態。在胚胎發育過程中，組織特異性轉錄因子和染色質重塑因子共同發揮作用，確保多系逐漸協調分化，視網膜色素上皮（retinalpigment epithelium，RPE）是對鄰近視網膜的發育、功能和維持至關重要的神經上胚層。Ovadia等[19]通過Geo-seq獲得發育中小鼠RPE和鄰近眼間質的高分辨率空間轉錄組圖譜，該圖譜涵蓋了年輕和更成熟的眼原基。這些轉錄組數據揭示了RPE和眼間質分化過程中的關鍵轉錄因子及其基因調控網絡。這些發現揭示了SWI/SNF 復合物在控制 RPE 和神經細胞命運之間的交叉以及細胞周期退出和分化耦合方面的作用。總體而言，空間轉錄組學與高分辨率成像技術相結合，為研究者提供了一種以細胞為單位深入了解生物組織內基因表達的方法，在發育生物學領域中發揮著重要作用。

4.1.2 神經科學 空間轉錄組學可以揭示不同類型的神經元、突觸和神經回路中基因表達的特異性。Weitz等[20]利用空間轉錄圖譜揭示基因表達的變化，并對神經周圍侵犯期間胰腺導管腺癌神經微環境中的神經支持細胞類型進行了功能分析，發現胰腺導管腺癌中肥大的腫瘤相關神經表達神經損傷的轉錄組信號，包括程序性細胞死亡、許旺細胞（Schwann cells）增殖信號通路以及巨噬細胞通過吞噬作用清除凋亡細胞碎片。這項研究揭示了實體瘤誘導的局部神經損傷的共同基因表達模式，為了解胰腺導管腺癌以及其他胃腸道癌癥期間腫瘤?神經微環境的病理生物學提供了新的視角。小鼠大腦的神經解剖區的識別和勾勒極具挑戰性，一般需要人工標注。Partel等[4]使用空間基因表達數據可根據分子標記對小鼠大腦空間分區進行無監督、無偏見的注釋，無需根據組織和細胞形態或匹配參考圖譜進行主觀的人工注釋。

4.1.3 癌癥研究 空間轉錄組學在癌癥研究中的應用比較廣泛，為研究腫瘤內部異質性提供了支撐。Fatemi 等[21]通過整合單細胞組織學和轉錄組學數據推斷結直腸癌患者整張切片圖像中的空間mRNA表達模式，在單細胞水平上共同映射組織學和轉錄組信息。Figiel等[22]通過虛擬前列腺活檢的空間轉錄組分析揭示了組織異質性對基因組特征的混雜效應。Feng等[23]利用空間轉錄組學數據分析揭示肉芽腫性松弛皮膚腫瘤微環境中巨噬細胞的異質性等。此外，使用人工智能的方法對空間轉錄組學進行分析可以鑒定腫瘤細胞類型[14， 2425]。在腫瘤組織的藥物反應和耐藥性研究中，通過分析藥物治療前后腫瘤組織的空間轉錄組數據，可以識別潛在治療靶點[26-29]。空間轉錄組數據還可以揭示不同區域和細胞類型中基因表達的差異，有助于理解腫瘤微環境的復雜性[30- 31]，這對于研究腫瘤細胞與其周圍細胞的相互作用非常重要，為個性化治療和開發新的治療策略提供思路。

4.2 空間轉錄組學在農業領域中的應用

在農業領域中，由于植物細胞壁水解和細胞內轉錄本擴散到陣列表面的難度較大，空間轉錄學技術在植物研究中尚未被廣泛應用。盡管如此，Giacomello等[32]利用空間轉錄組學方法生成了擬南芥花序分生組織、歐洲白楊發育和休眠葉芽以及挪威云杉雌球果的全轉錄組空間基因表達譜。

4.2.1 植物生長發育研究 空間轉錄組學可以揭示植物根、莖、葉等不同組織和器官中特定基因的表達模式，從而深入了解植物生長發育的分子調控機制。Yang 等[33]利用空間轉錄組學技術在石松類植物根中檢測了97個與根相關的基因，揭示了與種子植物相似的基因表達模式，證實根的發育調控機制具有高度收斂的特點，還發現了石松類植物根的地面組織調節與真葉植物相似，但根冠形成可能受到不同的調控，結果表明，WOX 基因在石松類植物根冠形成中發揮重要作用，為理解植物根的發育和進化提供了一種新的方法和視角。Fu等[34]利用空間轉錄組學技術對灌漿階段的玉米籽粒進行了顯微切片和分析，可視化所有基因的表達模式，最終成功鑒定了11個細胞群體和332個分子標記基因。該研究系統地闡明了玉米籽粒中3種主要物質（淀粉、蛋白質和油）的空間儲存機制，為控制玉米籽粒農藝性狀的功能基因提供了寶貴的見解。此外，Moreno-Villena等[35]利用激光顯微切割技術分離了馬齒莧葉細胞，并將它們與空間轉錄組相結合，揭示了葉肉和葉鞘細胞中C4 和景天酸代謝途徑（crassulacean acidmetabolism，CAM）途徑的差異空間基因表達。這些發現為C4植物的光合途徑研究提供了全新的視角。總的來說，這些研究表明空間轉錄組技術可以對植物組織結構進行精確分析，其將在未來的植物發育生物學研究中發揮重要作用。

4.2.2 植物細胞與病原細菌的相互作用 空間轉錄組學可用于分析病原菌在寄主植物中的基因表達模式和相互作用。在大豆與根瘤菌相互作用的研究中，Liu等[36]利用單細胞RNA 測序和立體測序相結合的方法，構建了大豆結節和根的空間轉錄組圖譜，并基于感染細胞和未感染細胞中特異表達基因的空間表達模式，鑒定出在大豆?根瘤菌相互作用中發揮關鍵作用的功能基因，為深入了解大豆與根瘤菌之間的相互作用機制及共生關系奠定了基礎。此外，Saarenp??等[37]開發了一種空間元轉錄組學技術，即SmT，可以捕獲真菌、細菌和宿主信號，并保持它們的空間結構，可以用于調查宿主和微生物組基因表達網絡。

4.2.3 細胞間的相互作用 細胞間相互作用是調節多細胞生物活動，并確保其有序、高效運作的主要途徑。這種相互作用可以通過相鄰細胞之間的直接接觸實現，也可以通過信號分子傳遞（如受體配體的結合）來實現。空間轉錄組技術可以捕獲單個細胞的完整形態，檢查細胞微環境，并理解單個細胞之間的相互作用[38-39]。此外，可以通過使用空間轉錄組數據對具有相鄰關系的細胞進行篩選，分析細胞間的相互作用，從而挖掘關鍵的細胞間通信并揭示潛在的相互關系[40-41]。

5 結語

空間轉錄組學的迅速發展標志著生物學研究進入了一個新的階段。該技術通過捕捉組織內基因表達的空間分布，為深入理解生物體內部復雜結構和相互作用提供了窗口。在數據分析方面，高度復雜的數據分析需要創新性的算法和工具，以揭示細胞類型、基因表達差異等關鍵信息。在醫學領域，空間轉錄組學的應用為腫瘤生物學研究提供了更細致入微的視角，有助于解析腫瘤異質性、藥物反應機制和免疫微環境，這一技術的廣泛應用也為個體化治療和精準醫學奠定了基礎，為未來發展開辟了新的研究方向。在農業領域，該技術有助于解決作物生長發育、逆境應對、品種改良、害蟲病原體防控、農產品質量安全等問題，為農業生產提供新的科學支持和技術手段。

然而，空間轉錄組學也面臨一些局限性：首先，數據處理和分析的復雜性較高，目前的算法和工具在處理海量、高維數據時仍存在挑戰；其次，高分辨率成像所帶來的數據量激增，給數據存儲和處理帶來了巨大壓力；此外，空間轉錄組學技術的成本較高，技術門檻限制了其在研究和應用中的普及。

因此，未來的發展應著重于以下幾個方面：一是推動算法和工具的創新，特別是針對高維數據的處理；二是促進跨領域合作，提高技術的應用廣度；三是建立數據標準化和共享平臺，提高結果的可比性；四是開發更經濟實用的技術方案，降低成本，使更多實驗室能夠使用；五是拓展應用領域，探索空間轉錄組學在新興領域的潛力。這些措施將有助于克服現有局限，推動空間轉錄組學技術的進一步發展和應用。

綜上，隨著空間轉錄組學方法和分析工具的不斷創新，對生物體內空間基因表達的理解也將更加全面，從而推動醫學和生物學領域取得更深層次的突破。

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