西羅莫司新類似物FIM-R140的分離和結構鑒定

摘要：目的 從西羅莫司產生菌吸水鏈霉菌FC904發酵液的粗提物中分離純化未知雜質FIM-R140，鑒定其化學結構。方法 采用硅膠柱層析和制備液相分離純化獲得FIM-R140，進行理化性質以及IR、UV、NMR和HRMS等波譜分析，鑒定該雜質的化學結構。用SRB測定化合物體外抗腫瘤活性，用沙氏液體培養基二倍稀釋法測定化合物的抗真菌活性。結果與結論 純化獲得HPLC純度為97.05%的FIM-R140，結構鑒定為31-差向雷帕霉素，為首次報道的西羅莫司同分異構體。FIM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司略低，對白念珠菌的抑菌作用弱于西羅莫司。

關鍵詞：西羅莫司；31-差向雷帕霉素；吸水鏈霉菌FC904；分離純化；結構鑒定

中圖分類號：R979.5 文獻標志碼：A

Isolation and identification of sirolimus analogue FIM-R140

Chen Xiaqin， Chen Xiaoming， Liu Ying， Ying Jiayin， Li Kualiang， Huang Jie， and Yang Guoxin

（Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350007）

Abstract Objective To isolate and identify FIM-R140， a metabolite from the broth of the sirolimus producing strain Streptomyces hygroscopicus FC904. Methods FIM-R140 was separated and purified by silica gel chromatography and preparative liquid chromatography. Its chemical structure was determined by physicochemical properties and spectral analysis including IR， UV， NMR， and HRMS. The anti-cancer activity of FIM-R140 was determined by the SRB method in vitro， and the antifungal activity was evaluated by the serial two-fold broth dilution method. Results and Conclusion FIM-R140 with HPLC of 97.05% was obtained， and it was identified as 31-epi-rapamycin， a sirolimus isomer， which was reported for the first time. The anti-cancer activity and anti-fungus activity of FIM-R140 were slightly weaker than those of sirolimus.

Key words Sirolimus; 31-epi-rapamycin; Streptomyces hygroscopicus FC904; Isolation and purification; Structure identification

西羅莫司（sirolimus），又名雷帕霉素（rapamycin），為大環三烯內酯類藥物（圖1），1975年首次報道的從智利復活節島土壤中分離出的吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）NRRL 5491產生的一種抗真菌代謝產物[1-2]，后續藥理學研究發現西羅莫司具有免疫抑制[3]、抗腫瘤[4]、神經保護[5]、抗衰老及延長壽命[6]等作用。西羅莫司產生菌吸水鏈霉菌FC904（Streptomyces hygroscopicus FC904）及其突變株在發酵過程中除產生西羅莫司外，還產生許多西羅莫司衍生物[7-12]。由于西羅莫司衍生物結構與西羅莫司類似，不易分離，成為了西羅莫司原料藥中雜質的主要來源。隨著人們對藥物安全性的日益關注，對藥物中雜質的控制已經成為藥品質量控制的重要環節，最大化地檢測并分離到未知雜質，逐步完善對雜質譜的認知，才能不斷提高對藥物的雜質控制水平。

在吸水鏈霉菌FC904發酵液的粗提物中存在HPLC保留時間與本實驗室已分離得到的西羅莫司衍生物不同的未知雜質，相對保留時間RRT=1.18，緊挨著西羅莫司異構體出峰（圖2），暫命名為FIM-R140。對其進行UV掃描，結果表明該雜質在266、277和288 nm有強吸收峰，與西羅莫司的紫外吸收行為一致，推測其也屬于西羅莫司類似物。本文報道FIM-R140的分離純化及結構鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

西羅莫司發酵液粗提物和西羅莫司對照品由福建科瑞藥業有限公司提供；人結直腸腺癌細胞HCT-15、人食管癌細胞ECA-109、人非小細胞肺癌細胞A549、人腺胃癌細胞SGC7901、人腎透明細胞腺癌細胞786-0、人乳腺癌細胞T47D購自中國科學院上海細胞庫。白念珠菌CPCC360003、白念珠菌CMCC（F）98001購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要儀器

LC-8A制備液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Bruker AM-500核磁共振儀（德國Bruker公司）；Agilent 6454 Q-TOF液質聯用系統（美國安捷倫公司）； AccuTOF-MS高分辨質譜分析儀（日本JEOL公司）；Spectrum Two紅外光譜儀（美國PerkinElmer公司）。

1.3 HPLC檢測條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 μm，

1.8 μm）；檢測波長：277 nm；柱溫：45℃；樣品架溫度：5℃；進樣量：5 μL；流速：1.5 mL/min；流動相A為0.1%甲酸；流動相B為甲醇-乙腈（50：50， V/V），采用梯度洗脫程序，0～5 min，36% A；5～17 min，36%～25% A；17～22 min，25%～10% A；22～24 min，10% A；24～

25 min，10%～36% A；25～30 min，36% A。

1.4 分離純化

稱取200～300目硅膠裝填玻璃層析柱，將西羅莫司的發酵液粗提物用適量丙酮溶解后上樣，樣品吸附后，以丙酮-石油醚（1：4， V/V）混合溶劑洗脫，分瓶收集，用高效液相色譜儀跟蹤檢測，將分離得到的含FIM-R140的洗脫液減壓濃縮，除去溶劑，得到淺黃色泡沫狀固體，得到FIM-R140的粗品。

將淺黃色泡沫狀固體溶解于少量甲醇中，通過制備液相色譜儀分離。制備色譜分離條件：色譜柱為UniSil 10-100 C18 （21 mm×250 mm，10 μm）；流動相為甲醇-水溶液（80：20， V/V）；檢測波長為 277 nm；柱溫為室溫；流速為8 mL/min。分段收集，HPLC跟蹤檢測。將分離得到的組分減壓濃縮去除甲醇后用等體積的二氯甲烷分別萃取兩次，合并二氯甲烷層，減壓濃縮除去二氯甲烷獲得FIM-R140較純產物。將較純FIM-R140產物再進行一次制備液相色譜儀分離，合并純度為95%以上的部分。重復上述步驟，獲得FIM-R140純品。

1.5 FIM-R140的初步生物學活性

1.5.1 FIM-R140體外抗腫瘤活性測定

取細胞以1×104 個/mL的細胞密度接種于96孔培養板中，每孔100 μL，置37 ℃ 5% CO2及飽和濕度的條件下培養24 h。待其貼壁后，分別加入西羅莫司（對照）和FIM-R140，其終濃度達到0.0006、0.0024、0.0098、0.039 、0.156、0.625、2.5和10 μmol/L，每組4個復孔， 每孔終體積為200 μL。置上述條件下培養72 h。培養結束后，每孔加入50 μL 4 ℃預冷的TCA溶液 （50%，W/V），放置于4℃中固定細胞1 h后，用去離子水沖洗3～5遍，室溫晾干。每孔加入0.4%

（W/V ）的SRB染液100 μL，染色15 min后倒掉，用1% （V/V）乙酸沖洗3～5遍，室溫晾干。用100 μL Tris-base堿液（10 mmol/L，pH 10.5）溶解染料，水平搖床上振蕩20 min，采用酶標儀540 nm處測定光吸收值。本實驗均重復3次。FIM-R140體外抗腫瘤活性的IC50使用Graphpad prism軟件從抑制率換算得到的。

1.5.2 FIM-R140對白念珠菌的抑制作用

待測菌懸液的制備：將白念珠菌接種于沙保羅瓊脂培養基上，置28 ℃培養48 h后，取1接種環培養物混懸于2 mL無菌生理鹽水中震蕩使之懸浮均勻后，用沙保羅液體培養基稀釋菌懸液至1×105～

5×105 CFU/mL。待測樣品溶液配制：乙醇溶解配成200 μg/mL溶液。應用二倍稀釋法測抗菌活性。本實驗均重復3次。

2 結果

2.1 分離純化

西羅莫司發酵液粗提物通過正相硅膠柱層析方法富集FIM-R140粗品（圖3），再利用制備液相色譜儀分離獲得FIM-R140，HPLC分析結果表明其純度為97.05%（圖4）。

2.2 理化性質

質譜數據表明FIM-R140的分子式為C51H79NO13，與西羅莫司的分子式一致；紫外吸收行為、紅外光譜主要特征峰、溶解度與西羅莫司類似（表1）。

2.3 結構解析

FIM-R140的13C NMR圖譜及DEPT中，大多數的譜線是成對出現且一強一弱，1H NMR譜中強弱信號比例約為2.5：1，提示該化合物在DMSO中存在構象異構，與西羅莫司相似，可能是由于酰胺鍵旋轉受阻引起的[13]。

FIM-R140的質譜數據顯示該化合物含51個碳原子，結合其主要構象體的13C NMR和DEPT譜，可推斷出該化合物的分子結構中含10個甲基，13個亞甲基，20個次甲基，3個季碳及5個羰基碳，與西羅莫司一致。13C NMR圖譜中碳的范圍（160～220 ppm）有5個信號，結合HSQC譜，它們應為酮羰基。烯碳范圍內（110～160 ppm）有8個信號，一個半縮酮碳（99.03 ppm）。FIM-R140的13C NMR譜與西羅莫司對比發現，化學位移值為13.35 ppm的碳信號消失，在HSQC譜中相關聯的氫信號δH 0.83也消失，該信號為西羅莫司C-51位的甲基信號；而在δH 0.95出現新的甲基信號；在HMBC譜中可觀察到該甲基上的氫與C-30（δC 212.59）的羰基碳、C-31（δC 40.51）和C-32（δC 38.65）都有相關信號；在HSQC譜中找到與C-31、C-32分別直接相連的氫H-31（δH 2.68）和H-32（δH 1.21、1.45）。在ROESY譜中觀察到H-51和H-32的有相關信號，再結合COSY和TOCSY譜可推測出該未知雜質與西羅莫司結構上的不同點在于C-31與C-51甲基連接的構型發生變化，從R-型轉化為S-型，同時引起附近的碳位移變化。圖5為FIM-R140部分二維核磁相關信號示意圖，表2列出FIM-R140與西羅莫司主要構型的13C NMR 和1H NMR化學位移歸屬。

2.4 FIM-R140體外生物學活性

2.4.1 FIM-R140對腫瘤細胞增殖的抑制作用

FIM-R140對受試的腫瘤細胞株的IC50值略大于西羅莫司（表3），說明FIM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司低。

2.4.2 FIM-R140對白念珠菌的抑制作用

FIM-R140的抗菌活性檢測結果（表4）表明，FIM-R140對白念珠菌CMCC（F）98001及白念珠菌CPCC360003的MIC均為1.250 μg/mL，說明FIM-R140對白念珠菌CMCC（F）98001及白念珠菌CPCC360003均有抑制作用，但弱于西羅莫司。

3 結論與討論

未知雜質FIM-R140在西羅莫司發酵液粗提物中含量低，首先通過正相硅膠柱層析方法富集到FIM-R140粗品；再利用柱效高、分離效果好的制備液相色譜儀進行最后的純化，獲得了純度為97.05%的未知雜質FIM-R140。結合多種結構鑒別分析，包括紅外光譜、紫外光譜、質譜和核磁共振譜等波譜分析，表明未知雜質FIM-R140為31-差向雷帕霉素（圖6），屬于西羅莫司的同分異構體，這是首次報道的西羅莫司同分異構體。本研究表明，FIM-R140的抗腫瘤活性較西羅莫司略低；對白念珠菌CPCC360003和白念珠菌CMCC（F）98001具有較強的抑制作用，但活性弱于西羅莫司。西羅莫司是mTOR變構抑制劑，在體內先與FK506結合蛋白（FKBP12）結合后的復合物再與西羅莫司靶蛋白（mannian target of mTOR）的FRB結合域結合，形成FKBP-西羅莫司-mTOR三元復合物并抑制mTOR活性[14-15]。FIM-R140與西羅莫司結構上的不同點在于C-31與C-51甲基連接的構型發生變化，可能會引起FRB結構域與西羅莫司的相互作用發生變化，造成FIM-R140的抗腫瘤活性和抗真菌活性均低于西羅莫司。因此對未知有關雜質的分離和結構鑒定，有助于原料藥的雜質譜分析研究，有利于藥物質量控制及生產工藝的改進，以便進一步提高藥品質量。

參 考 文 獻

Sehgal S N， Baker H， Vézina C. Rapamycin （AY-22，989）， a new antifungal antibiotic.Ⅱ. Fermentation， isolation and characterization[J]. J. Antibiot， 1975， 28（10）： 727-732.

Vézina C， Kudelski A， Sehgal S N. Rapamycin （AY-22，989）， a new antifungal antibiotic.Ⅰ. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle[J]. J Antibiot， 1975， 28（10）： 721-726.

Boutouja F， Stiehm C M， Platta H W. mTOR： A cellular regulator interface in health and disease[J]. Cells， 2019， 8（1）： 18-18.

Hua H， Kong Q， Zhang H， et al. Targeting mTOR for cancer therapy[J]. J Hematol Oncol， 2019， 12（1）： 1-19.

LiCausi F， Hartman N W. Role of mTOR complexes in neurogenesis[J]. Int J Mol Sci， 2018， 19（5）： 1544-1544.

Cai Y， Song W， Li J， et al. The landscape of aging[J]. Sci China Life Sci， 2022， 65（12）： 2354-2454.

楊國新， 江丹云， 黃捷， 等. 西羅莫司同分異構體Rap-D1的分離與鑒定[J]. 中國抗生素雜志， 2008， 33（2）： 80-83.

楊國新， 黃捷， 余輝， 等. 強效免疫抑制劑西羅莫司類似物FIM-Rap-02的分離與鑒定[J]. 海峽藥學， 2008， 20（3）： 72-74.

陳夏琴， 楊國新， 黃捷， 等. 雷帕霉素產生菌突變株FC904-107發酵產生7-O-ethyl-rapamycin[J]. 中國抗生素雜志， 2012， 37（11）： 827-829.

陳夏琴， 楊國新， 余輝， 等. 西羅莫司類似物7-O-去甲基雷帕霉素的分離和結構鑒定[J]. 中國抗生素雜志， 2016， 41（4）： 267-270.

楊國新， 陳夏琴， 余輝， 等. 雷帕霉素二醛的分離和結構鑒定[J]. 中國抗生素雜志， 2018， 43（4）： 450-456.

楊國新， 陳夏琴， 余輝， 等. 吸水鏈霉菌FC-904發酵代謝產物29-O-去甲基雷帕霉素的分離和結構鑒定[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44（2）： 208-213.

Kessler H， Haessner R， Schuler W. Structure of rapamycin： An NMR and molecular-dynamics investigation[J]. Helv Chim Acta， 1993， 76： 117-130.

Liang J， Choi J， Clardy J. Refined structure of the FKBP12-rapamycin-FRB ternary complex at 2.2 A resolution[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 1999， 55： 736-744.

Refined structure of the FKBP12-rapamycin-FRB ternary complex at 2.2 ? resolution[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 1999， 55（Pt 4）： 736-744.

文章編號：1001-8689（2024）09-1013-06

收稿日期：2023-11-07

基金項目：福建省公益類科研院所基本科研專項（No. 2021R10050013）

作者簡介：陳夏琴，女，生于1985年，助理研究員，從事微生物藥物化學研究，E-mail： chenxiaqin007@163.com

*通信作者，E-mail： guo-xinyang@163.com