地產化注射用頭孢唑林鈉對葡萄球菌體外PK/PD研究

摘要：目的 研究地產化注射用頭孢唑林鈉對葡萄球菌的體外抗菌效果，為臨床用藥提供參考。方法 通過藥敏實驗、殺菌曲線和體外藥動學/藥效學（pharmacokinetics/pharmacodynamics， PK/PD）模型比較地產化與原廠頭孢唑林鈉體外抗菌效果。結果 地產化與原廠頭孢唑林鈉對所測4株細菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）值完全一致，對金黃色葡萄球菌ATCC29213、2株臨床分離甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-susceptible Staphylococcus aureus， MSSA）的MIC值均為0.25 μg/mL，對1株甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌（methicillin-susceptible coagulas-negative Staphylococcus， MSCNS）MIC值均為0.06 μg/mL。2種頭孢唑林鈉對4株葡萄球菌在3種藥物濃度下的殺菌曲線無顯著差異，藥物濃度為1×MIC時細菌生長受到明顯抑制，4株細菌24 h菌液濃度增量小于2 lgCFU/mL，藥物濃度為2×MIC和4×MIC時，菌落數量均由6 lgCFU/mL持續下降到3 lgCFU/mL左右。分析動態殺菌曲線發現，2種頭孢唑林鈉整體PK/PD模擬結果相似，但對于菌株MSCNS117933和MSSA164342的殺菌曲線面積差，地產化頭孢唑林鈉參數值為（151.40±0.05）和（177.69±2.79） lgCFU·h/mL，原廠頭孢唑林鈉參數值為（151.10±0.11）和（170.4±1.96） lgCFU·h/mL，地產化參數值均大于原廠。結論 地產化與原廠頭孢唑林鈉對葡萄球菌的抗菌效果整體相同。

關鍵詞：頭孢唑林鈉；藥動學/藥效學；地產化；葡萄球菌；殺菌曲線；體外

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

In vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic studies on localized cefazolin sodium for injection against staphylococci

Du Mengjiao1，2， Wang Xueting3，4，" and Xiao Yonghong2，3，4

（1 Shandong First Medical University amp; Shandong Academy of Medical Sciences， Ji'nan 250117; 2 Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory， Ji'nan 250098; 3 Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases ， State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases， the First Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou" 310003; 4 Research Units of" Infectious disease and Microecology， Chinese Academy of Medical Sciences， Hangzhou 310003）

Abstract Objective To investigate the in vitro antimicrobial effects of cefazolin sodium for injection against staphylococci and provide reference for clinical medication. Methods Comparison of in vitro antimicrobial efficacy of localized and original cefazolin sodium by in vitro antibacterial susceptibility test， time-kill curve and pharmacokinetics/pharmacodynamics modeling was processed. Results The minimum inhibitory concentration （MIC） values of localized and original cefazolin sodium against staphylococci were consistent， with 0.25 μg/mL against Staphylococcus aureus （S. aureus） ATCC29213 and 2 clinical strains of methicillin-sensitive S. aureus （MSSA）， and 0.06 μg/mL against 1 strain of methicillin-sensitive coagulase-negative Staphylococcus （MSCNS）. There was no significant difference in the time-kill curve of the 2 types of cefazolin sodium against the 4 strains of S. aureus at 3 drug concentrations. Bacteria was significantly inhibited at the drug concentration of 1×MIC， and the total number of colonies of 4 strains increased by less than 2 lgCFU/mL in 24 h. The number of colonies gradually decreased from 6 lgCFU/mL to about 3 lgCFU/mL at the 2×MIC and 4×MIC drug concentrations. Overall， the PK/PD results of the 2 agents were similar by analyzing the dynamic sterilization curves， but the area difference of the bactericidal curves of localized cefazolin sodium against MSCNS117933 and MSSA164342 were greater than those of the original cefazolin sodium. The parameter values of the original cefazolin sodium were （151.40±0.05）and （177.69±2.79） lgCFU·h/mL， and the localized cefazolin sodium were （151.10±0.11） and （170.4±1.96） lgCFU·h/mL， respectively. Conclusion The antibacterial effect of localized cefazolin sodium against staphylococci is the same as that of original cefazolin sodium.

Key words" " Cefazolin sodium; Pharmacokinetics/Pharmacodynamics; Localized product; Staphylococcus; Time-kill curves; In vitro

頭孢唑林為第一代頭孢菌素，對革蘭陽性球菌的抗菌作用強于第二代和第三代，是世界衛生組織（World Health Organization， WHO）和我國國家基本藥物，臨床上主要用于甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌等敏感致病菌引起的各種感染及外科圍術期預防用藥[1]。

ACS Dobfar公司生產的頭孢唑林鈉于1973年以品牌產品在美國注冊上市，已同時被美國藥監局和中國藥監局認定為參比制劑（標準制劑）[2]。現已廣泛在歐洲、美國和中國等多個地區和國家臨床應用[3]。廣東金素制藥有限公司所持證的注射用頭孢唑林鈉為采用參比制劑持證商ACS Dobfar相同供應鏈并獲其授權進行地產化品種，首家通過了國家藥監局仿制藥質量與療效一致性評價并中選第五批國家藥品集中采購[4]。

體外PK/PD模型是藥效學和藥動學的綜合分析模型，可以對多種給藥方式、劑量、間隔乃至適應癥等進行模擬分析，能夠部分反映藥物、機體和病原菌三者之間的相互作用關系和藥效隨時間變化的規律，目前已廣泛應用于抗菌藥物研究的多個方面[5-6]。故本研究選擇體外PK/PD模型，進行地產化與原廠頭孢唑林鈉的體外抗菌活性的比較，評估二者藥效學一致性，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和培養基

參比制劑原廠頭孢唑林鈉（生產批號2010E0）購自意大利ACS Dobfar公司；地產化頭孢唑林鈉（生產批號101220500）購自廣東金素制藥有限公司； Mueller-Hinton Broth液體培養基（MHB，貨號CM0405B），Mueller-Hinxton Agar固體培養基（MHA，貨號CM0337），均購自英國Oxoid公司。

1.1.2 實驗菌株

金黃色葡萄球菌標準株ATCC29213；臨床分離株MSSA164342、MSSA172694和MSCNS117933，均為本實驗室保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 最低抑菌濃度測定

測定方法參照美國臨床和實驗室研究標準（Clinical And Laboratory Standards Institute， CLSI）推薦方法[7]，地產化與原廠頭孢唑林鈉對4株細菌的MIC值采用瓊脂稀釋法進行測定。

1.2.2 靜態殺菌曲線測定

過夜培養的菌液，使用比濁儀調至1.5×108 CFU/mL，將調配好的菌懸液10倍稀釋后分別取400 μL加入藥物濃度分別為0、1×MIC、2×MIC和4×MIC的搖菌管（加入菌液前管中MHB肉湯體積為3.6 mL，加入菌液后相當于菌液作10倍稀釋）中震蕩孵育，使初始接種菌量為106 CFU/mL左右。細菌接種到搖菌管后連續孵育24 h，在實驗開始后的0、1、2、4、6、8、12和24 h各收集100 μL樣品，使用0.9%生理鹽水稀釋后接種至MHA平板，37 ℃孵育20 h后進行計數。實驗均重復3次，根據3次實驗結果繪制殺菌曲線。由于菌落計數的最佳數量為300～30個菌落，超過則過密，小于則稀釋倍數太大，原液涂板時，菌落數為30定為檢測下限，大約為3.96×102 CFU/mL，少于30則按照實際數量進行計數。

1.2.3 頭孢唑林鈉體外PK過程模擬

按照說明書中頭孢唑林鈉在健康人體內的藥動學參數進行PK過程的模擬，給藥方案為1g iv. q8h，每次靜滴0.5 h，共24 h[8]。原廠頭孢唑林鈉具體PK參數：峰濃度（Cmax）185 μg/mL，半衰期（t1/2）2.0 h以及達峰時間（Tmax）為30 min[1]；地產化頭孢唑林鈉峰濃度為188 μg/mL，其余參數同原廠參比制劑。根據一房室模型繪制藥時濃度曲線[9]（圖1）。

1.2.4 體外PK/PD模擬

本研究采用PASS-400血藥濃度自動模擬儀（日本Dainippon Seiki公司）（圖2）進行體外PK/PD研究，該儀器由配套軟件PASS-402W（Version 2.00，日本Dainippon Seiki公司）操控，儀器分為中央室、培養基儲液室、抗菌藥物儲液室和廢液室4部分，各部分由無菌注射器、滅菌三通和配管相互連接，形成一個封閉系統。中央室、培養基儲液室、抗菌藥物儲液室為3個1000 mL三角燒瓶，中央室中有一個磁力攪拌子，持續旋轉使中央室藥物濃度均一。在PASS-402W軟件中輸入藥物在體內的藥動學參數后，軟件將根據模擬出的藥物濃度時間曲線（圖1）操控PASS-400儀器還原抗菌藥物在人體內的代謝過程，借助氣缸泵將抗菌藥物從藥物儲液室以恒定的速度泵入中央室，給藥過程持續30 min，同時將新鮮的肉湯從培養基儲液室泵入中央室和以不同的消除速度將含藥培養基從中央室泵出，模擬藥物的代謝過程。模擬過程中，中央室的體積恒定，中央室、培養基儲液室和抗菌藥物儲液室均置于37 ℃恒溫水浴中。實驗前后各部分需要高壓滅菌，組裝各部件時需要無菌操作。

將高壓滅菌后的各部件組裝完成后，添加適量頭孢唑林鈉儲備液至含有500 mL 0.9%生理鹽水的抗菌藥物儲液室中，儲液室中所需地產化與原廠頭孢唑林鈉藥物濃度分別為275和350 μg/mL（藥物濃度通過PASS-402W軟件模擬得出）。過夜培養的菌液，使用比濁儀調至1.5×108 CFU/mL，取1 mL接種到含有100 mL MHB肉湯的中央室中，初始接種菌量為106 CFU/mL左右。細菌接種到中央室后連續孵育24" h，在預定時間點（0、1、2、4、6、8、12和24 h）收集1 mL樣品，使用0.9%生理鹽水稀釋后接種至MHA平板，37 ℃孵育20 h后進行計數，實驗均重復3次，根據3次實驗結果進行統計分析。

1.2.5 PD參數測定

最大殺菌量（maximum kill down， MKD）、再生至初始菌量所需時間（bacterial growth recovery time， RT）和24 h殺菌量（ΔlgN24）使用PASS-400系統分析得出，殺菌曲線下面積（area under kill curve， AUKC）和藥物殺菌曲線與細菌生長空白對照曲線面積差（IE）使用GraphPad Prism 8.0.2軟件（美國graphpad software公司）積分獲得，殺菌速率（killing rate， KR）計算：各時間點給藥組減去對照組菌落計數，然后0與2 h菌落計數差值相減再除以時間差[6]，可以轉化為下式（圖3）：

KR=

N給藥（0h）：給藥組0 h時菌落計數值；N給藥（2h）：給藥組2 h時菌落計數值；N對照（0h）：對照組0 h時菌落計數值；N對照（2h）：對照組2 h時菌落計數值。

1.2.6 統計分析

使用GraphPad Prism 8.0.2軟件（美國Graphpad software公司）對數據進行統計分析，地產化與原廠頭孢唑林鈉對4株菌的PD參數的值以（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗比較二者對4株細菌的PD參數是否有差異，Plt;0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥敏實驗

地產化與原廠頭孢唑林鈉對4株細菌均敏感且MIC值一致，ATCC29213、2株MSSA的MIC值均為0.25 μg/mL，1株MSCNS的MIC值均為0.06 μg/mL。

2.2 靜態殺菌曲線

1×MIC、2×MIC和4×MIC藥物濃度下，地產化與原廠頭孢唑林鈉對4株細菌的殺菌曲線均無顯著差異。藥物濃度為1×MIC時，4株菌的生長均受到明顯抑制，12 h之后菌落數量緩慢上升，24 h菌液濃度增量小于2 lgCFU/mL；藥物濃度為2×MIC和4×MIC時殺菌效果類似，符合頭孢唑林時間依賴型殺菌的特點，菌落數量呈現出一直下降的趨勢，由6 lgCFU/mL下降到3 lgCFU/mL左右，地產化與原廠頭孢唑林鈉均表現出良好的殺菌效果（圖4）。

2.3 動態殺菌曲線

2.3.1 地產化與原廠頭孢唑林鈉殺菌作用

在體外PK模擬情況下，地產化與原廠頭孢唑林鈉整體殺菌效果類似。但對ATCC29213，原廠頭孢唑林鈉較地產化頭孢唑林鈉更加迅速地將細菌清除，12 h時所采集樣本已不能培養出細菌，且無菌株復生現象，對MSSA172494，原廠頭孢唑林鈉則稍差于地產化頭孢唑林鈉，24 h時仍能檢出細菌（菌量在1 lgCFU/mL左右）。從殺菌曲線下面積分析，對MSSA164342，地產化頭孢唑林鈉殺菌曲線幾乎在實驗全程中都明顯低于參比頭孢唑林鈉殺菌曲線，顯示出更優越的殺菌效果（圖5）。

2.3.2 地產化與原廠頭孢唑林鈉PD參數比較

比較地產化與原廠頭孢唑林鈉對菌株ATCC29213和MSSA172694的各PD參數發現均無統計學差異。對于菌株MSSA164342，地產化頭孢唑林鈉IE為（177.69±2.79） lgCFU·h/mL，原廠頭孢唑林鈉為（170.4±1.96） lgCFU·h/mL，二者具有統計學差異。對于菌株MSCNS117933，地產化與原廠頭孢唑林鈉對PD參數MKD、ΔlgN24、AUKC、IE以及KR均表現出統計學差異，P＜0.05（表1）。地產化與原廠頭孢唑林鈉組24 h內各菌株均未發現再生現象，故再生至初始菌量時間RT均記為大于24 h。

3 討論

參比制劑是指用于仿制藥質量和療效一致性評價的對照藥品，通常具有完整的臨床研究數據，如原研藥品或國際公認的同種藥物。參比制劑是處方工藝合理、質量穩定、療效確切的藥品。由于常規的注射用藥品一致性評價并不要求進行藥效學比較臨床研究，不能完全反映抗菌藥物臨床使用過程的一致性[2]。《醫療機構抗菌藥物集中帶量采購管理專家共識》鼓勵醫療機構完善集采抗菌藥物臨床綜合評價的方法學體系建設，充分利用各級醫療衛生機構的真實世界數據，按照《藥品臨床綜合評價管理指南（2021版試行）》組織開展科學規范的抗菌藥物臨床綜合評價。先后有多位學者采用體外和體內多種實驗方法對仿制藥和參比制劑療效是否一致進行了考察。包括通過藥敏實驗和靜態殺菌曲線比較仿制藥和參比藥的體外抗菌活性和殺菌效率[10-11]；通過蒙特卡羅模擬比較仿制藥和參比制劑在特定給藥方案以及不同MIC下PK/PD靶值的達標概率，進行臨床療效的預測[12-13]；通過體外PK/PD模型動態研究抗菌藥物與細菌的作用關系，繪制殺菌曲線、比較PD參數[6，14]；以及利用動物感染模型[15]和開展臨床試驗[16-18]進行仿制藥和參比藥體內抗菌療效的比較等。部分結果表明，通過了生物等效性評價的一些仿制藥藥效仍不能與參比制劑相媲美。原因可能在于仿制藥活性成分實際含量與標注含量有所差異[12]以及雜質和所添加輔料影響了藥效的發揮[16]。

本研究實驗結果顯示，地產化與原廠頭孢唑林鈉對4株細菌均敏感且MIC值完全一致，2株MSSA MIC值為0.25 μg/mL，與文獻中0.25～0.5 μg/mL藥敏結果相符[19]。基于MIC值，觀察在1、2和4倍MIC藥物濃度下殺菌情況，地產化與原廠頭孢唑林鈉殺菌曲線同樣沒有顯著差異。1×MIC藥物濃度下細菌生長先被抑制，大約12 h后菌落數量開始明顯增加，2×MIC和4×MIC藥物濃度殺菌效果類似，與文獻中結果一致[20]，該結果與頭孢唑林鈉為時間依賴型抗菌藥物相符。

進一步PK/PD模擬的結果表明，地產化與原廠頭孢唑林鈉對其中2株細菌PD參數的值存在統計學差異。對于菌株MSCNS，PD參數MKD、ΔlgN24、KR、AUKC和IE皆有差異。由于PD參數IE綜合考慮了藥物殺菌曲線與細菌生長空白對照曲線，直接衡量抗菌劑的抗菌效果，有學者認為IE更能全面、無偏倚地評估各抗菌藥物不同給藥方案下的治療效果[21]。同樣另一株MSSA164342也是地產化頭孢唑林鈉IE的值大于參比頭孢唑林鈉，提示地產化頭孢唑林鈉的藥效不遜色甚至略優于原廠頭孢唑林鈉。

本研究亦有一些不足之處，雖然有研究表明體外模型和動物感染模型的研究結果差異無統計學意義[22]，但是體外PK/PD模型無法模擬機體、細菌和藥物之間的相互作用，包括免疫系統對細菌的清除能力，藥物對機體免疫能力的影響，機體對藥物的代謝作用、機體內代謝產物以及內環境的理化性質對藥物的影響等[23]，所以對于地產化與原廠頭孢唑林鈉整體抗菌效果類似的實驗結果，仍需在動物實驗以及臨床應用中進一步驗證。其次，本研究的實驗菌株只有4株，數量較少，考慮在進一步的研究中，擴大菌株數量，使實驗結果更具有代表性。此外，在接下來的研究中也會增加對中央室藥物濃度的檢測，確保中央室藥物濃度與人體藥動學過程相契合。

總之，本研究的實驗結果表明參比制劑地產化（金素）與原廠（ACS Dobfar）頭孢唑林鈉對葡萄球菌整體抗菌效果類似。結果一方面可以彌補地產化頭孢唑林鈉臨床療效研究的不足，作為臨床用藥時的重要參考，增加醫師、藥師和患者對于廣東金素頭孢唑林鈉的用藥信心，緩解患者經濟壓力；另一方面又為一致性評價方法提供思路，作為藥效學和藥動學的綜合分析模型，體外PK/PD模型是能夠反映藥效隨藥物濃度及時間變化的規律， 比起以PK參數為終點評價指標的生物等效性研究，具有獨特優勢。

參 考 文 獻

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文章編號：1001-8689（2024）09-1075-07

收稿日期：2024-02-26

作者簡介：杜夢嬌，女，生于2000年，在讀碩士研究生，主要研究方向為抗菌藥物PK/PD研究，E-mail： 2567529079@qq.com

*通信作者，E-mail： xiao-yonghong@163.com