星孢菌素產生菌Streptomyces sp. FIM18-327基因組的測序與遺傳操作體系的建立

摘要：目的 通過基因組測序明確星孢菌素高產菌株Streptomyces sp. FIM18-327遺傳背景，并建立該菌的遺傳操作體系。方法 通過第二代和第三代DNA測序技術相結合的策略對Streptomyces sp. FIM18-327進行全基因組測序并組裝，利用antiSMASH軟件預測該菌的次級代謝產物生物合成基因簇分布。通過優化接合轉移載體、培養基種類及鎂離子濃度，建立了Streptomyces sp. FIM18-327的遺傳操作體系。結果 Streptomyces sp. FIM18-327基因組大小為9.73 Mb，由一條染色體、兩個線性質粒及一個環狀質粒組成。其中染色體大小為9.48 Mb，GC含量70.12%，包含了8431個蛋白編碼基因與34個次級代謝產物生物合成基因簇；以pFIM4123為載體，MS為接合轉移培養基，在MS中添加MgCl2至終濃度為20 mmol/L時，接合轉移的效率達3.2×10-6。結論 Streptomyces sp. FIM18-327基因組信息的解析及遺傳操作體系的建立，為該菌的進一步開發與應用奠定了基礎。

關鍵詞：星孢菌素；全基因組測序；代謝途徑；接合轉移

中圖分類號：R9， Q93 文獻標志碼：A

Genome sequencing of staurosporine-producing strain Streptomyces sp. FIM18-327 and establishment of its genetic manipulation system

Fang Zhikai1， Xie Lijun1， Lin Penghui1，2， Lin Ru1， Zhou Jian1，2， and Jiang Hong1

（1 Fujian Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products， Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350007;

2 School of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350122）

Abstract Objective To elucidate the genetic background of the high-producing staurosporine strain Streptomyces sp. FIM18-327 and establish the genetic manipulation system for this strain. Methods The whole genome of Streptomyces sp. FIM18-327 was sequenced and assembled using both PacBio Sequel II and Illumina NovaSeq platforms， and the secondary metabolite biosynthesis gene clusters in the strain were predicted by antiSMASH. The genetic manipulation system of Streptomyces sp. FIM18-327 was established by investigating the conjugation transfer carrier， the type of culture medium and magnesium ion concentration. Results The genome size of this strain was 9.73 Mb， which consists of one chromosome， two linear plasmids and one circular plasmid. The chromosome size of Streptomyces sp. FIM18-327 was 9.48 Mb， with a GC content of 70.12%， containing 8，431 protein-coding genes and 34 secondary metabolite biosynthetic gene clusters. With pFIM4123 as the carrier， the efficiency of conjugation transfer reached 3.2×10-6， when MgCl2 was added to MS medium at the final concentration of 20 mmol/L. Conclusion The analysis of genomic information for Streptomyces sp. FIM18-327 and the establishment of a genetic manipulation system have laid the foundation for the further development and application of this strain.

Key words Staurosporine; Whole genome sequencing; Metabolic pathways; Conjugation transfer

星孢菌素（staurosporine）是由Streptomyces staurosporeus等放線菌產生的吲哚咔唑生物堿，具有廣譜的蛋白激酶抑制活性，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和分裂[1]。星孢菌素的衍生物米哚妥林（midostaurin）克服了其原型藥物選擇性差、毒性大的問題，已獲FDA批準用于治療急性髓系白血病和系統性肥大細胞增多癥等疾病[2-3]。

星孢菌素作為米哚妥林化學半合成的關鍵中間體，其生產效率和質量直接影響米哚妥林的生產成本和市場競爭力。盡管已有多種星孢菌素產生菌的報道[1，4-6]，但這些菌株的產量普遍偏低，難以滿足工業規模化生產的需求。目前，提升星孢菌素產量的方法主要依賴于傳統的誘變育種和發酵工藝優化，這些方法通常效率不高且耗時較長。隨著生物信息學的快速發展，基于基因組信息的遺傳定向改造已成為獲得高產菌株的有效途徑[7-9]。因此，獲得性狀優良的星孢菌素產生菌的基因組信息，并建立高效的遺傳操作體系，對于菌種的遺傳改良至關重要。這不僅有助于提升星孢菌素的產量，還能為米哚妥林的穩定生產和質量控制提供堅實的技術基礎。

本實驗室篩選到1株星孢菌素的產生菌Streptomyces sp. FIM18-327，經優化后，具備工業化生產的潛力。為了進一步提升該菌株的生產能力并探索其應用前景，本研究對其全基因組進行了測定和分析。通過大腸埃希菌-放線菌的屬間接合轉移，建立了高效的遺傳操作體系，為Streptomyces sp. FIM18-327的代謝調控、遺傳改造和組合生物合成研究提供了有利條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與引物

星孢菌素產生菌Streptomyces sp. FIM18-327、質粒克隆菌株E. coli DH5α、接合轉移供體菌E. coli ET12567（pUZ8002）、基因敲除質粒pFIM4123及pKC1139均為本實驗室保存。引物合成委托北京擎科生物科技股份有限公司，序列如表1所示。

1.1.2 培養基與抗生素

Streptomyces sp. FIM18-327的固體培養基ISP4、孢子預萌發培養基、接合轉移培養基（MS、高氏1號和ISP4）及細菌基礎培養基LB等參見文獻[10]。

種子培養基：甘油2%、可溶性淀粉1.0%、蛋白胨1.0%、黃豆餅粉1.0%、CaCO3 0.2%，pH 7.5。

發酵培養基：甘油6.0%、蛋白胨1.5%、酵母粉1.0%、黃豆餅粉1.5%、色氨酸0.3%、K2HPO4 0.05%、NaCl 0.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、碳酸鈣0.6%，pH 7.5。

LB中抗生素終濃度為：卡那霉素25 μg/mL，安普霉素50 μg/mL，氯霉素25 μg/mL；接合轉移培養基中抗生素終濃度為：萘啶酸25 μg/mL、安普霉素25 μg/mL。

1.1.3 主要試劑

基因組提取、PCR擴增、拓撲克隆、質粒提取及膠回收等試劑盒等購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，限制性內切酶和DNA連接酶購于NEB（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 全基因組測序及分析

（1）基因組測序

質量和濃度測定合格的基因組DNA委托上海派森諾生物科技有限公司進行基于第三代PacBio和第二代Illumina NovaSeq的細菌完成圖測序。

（2）基因組分析

采用GeneMarkS軟件對菌株基因組進行基因預測，采用Barrnap、tRNAscan-SE及Rfam等對非編碼RNA進行預測，采用PhiSpy、CRISPR finder對CRISPRs及原噬菌體進行預測；將菌株預測的基因序列結果分別與NCBI NR數據庫、Swiss-Prot蛋白數據庫、COG數據庫、KEGG數據庫等進行比對，完成基因功能注釋；將拼接的染色體序列提交到antiSMASH網站上，預測Streptomyces sp. FIM18-327可能存在的次級代謝產物生物合成基因簇。

1.2.2 遺傳操作體系的建立

（1）抗生素敏感性實驗

配置終濃度為12.5、25、50和100 μg/mL的卡那霉素、安普霉素、硫鏈絲菌素、紅霉素和氯霉素的ISP4平板，將Streptomyces sp. FIM18-327的孢子懸液（1×108 個/mL）涂布于平板上，于28 ℃下培養10 d，以生長情況確定菌株對不同抗生素的敏感性。

（2）敲除質粒的構建

PCR、質粒提取、酶切、酶聯和大腸埃希菌感受態細胞的制備及轉化等分子生物學操作方法見參考文獻[11]；DNA測序由鉑尚生物技術（福州）有限公司完成。分別以pFIM4123或pKC1139為骨架，構建staR敲除質粒pFIM4123-staR和pKC1139-staR：利用特異性引物staR-UF/staR-UR通過PCR擴增得到上游同源臂staR-U（1771 bp），以及引物staR-DF/staR-DR擴增得到下游同源臂staR-D（1884 bp）；將上述同源交換臂分別克隆到pCE2-TA-Blunt-Zero載體中，得到初步的克隆質粒。使用Xba I-Xho I對含有staR-U的克隆質粒進行雙酶切后，電泳回收staR-U片段，同樣以Xho I-EcoR I酶切含staR-D的克隆質粒，電泳回收staR-D片段；以Xba I-EcoR I酶切pFIM4123或pKC1139，經回收得到載體骨架；將回收的staR-U、staR-D片段與載體骨架等三片段通過DNA連接酶連接，構建得到敲除質粒pFIM4123-staR和pKC1139-staR。

（3）屬間接合轉移

構建的敲除質粒經CaCl2法轉化E. coli ET12567 （pUZ8002）后，通過大腸埃希菌-鏈霉菌的屬間接合轉移[10]進入到Streptomyces sp. FIM18-327細胞中，簡要步驟如下：供體菌E. coli的過夜培養物接入到含抗生素的LB培養基中，于37 ℃下振蕩培養至菌液A600為0.4～0.6；通過離心收集菌體，并用LB培養基洗滌2次后，重懸備用；刮取新鮮孢子至1 mL 2×YT培養基中，在50 ℃下熱激處理10 min，之后離心并棄去大部分上清液；將供受體按108：108的比例混合，涂布于添加20 mmol/L MgCl2的MS平板上，并在28℃下培養20 h。覆蓋抗生素，繼續培養8 d后可見接合子。

（4）基因敲除菌株的獲得與驗證

挑選接合子，在未添加抗生素的ISP4斜面上松弛培養2代后進行分離純化。孢子成熟后，分別影印到含安普霉素和不含安普霉素的ISP4平板上。利用引物staR-VF與staR-VR，通過PCR來篩選雙交換菌株。

雙交換菌株與出發菌株在ISP4斜面上培養10 d后，將其接入30 mL/250 mL的種子培養基中，在28 ℃、280 r/min的條件下振蕩培養約30 h。以3%的接種量將其轉入發酵培養基中，在相同的培養條件下培養132 h。培養結束后，取1 mL的發酵液，加入4 mL甲醇，并進行30 min的超聲破壁，然后以4000 r/min的速度離心15 min。取離心后的上清液，通過0.45 μm聚偏二氟乙烯膜過濾后進行HPLC分析。

色譜條件如下：使用島津LC-20A高效液相色譜儀，采用Phenomenex Kinetex EVO C18色譜柱（4.6 mm ×

250 mm，5 μm），流動相為45%乙腈-55%含0.1%的三乙胺水溶液，檢測波長為292 nm，流速為1 mL/min，柱溫設定為40 ℃。

2 結果與分析

2.1 Streptomyces sp.FIM18-327基因組特征

采用第三代PacBio和第二代Illumina NovaSeq結合的測序技術，獲得Streptomyces sp. FIM18-327的基因組完成圖。整個基因組包括1條染色體、兩條線性質粒及1個環狀質粒，總長9，725，711 bp，其中染色體大小為9，479，579 bp，GC含量為70.12%（圖1）。基因預測顯示，Streptomyces sp. FIM18-327染色體共含8431個蛋白編碼基因，16個rRNA、67個tRNA和38個nc RNA編碼基因，以及12條CRISPRs結構。

NR數據庫是NCBI中的一個數據豐富的非冗余蛋白數據庫。在Streptomyces sp. FIM18-327染色體中，共有8131個基因在NR數據庫得到了注釋，其中有7518個與鏈霉菌同源性，這表明該菌歸屬于鏈霉菌。Swiss-Prot是一個經過人工檢查和注釋的蛋白序列數據庫，其注釋信息詳細、可信度高。共有5167條蛋白序列得到有意義的注釋。NR數據庫和Swiss-Prot的注釋有助于靶基因的確定和目標蛋白質功能的分析，這為Streptomyces sp. FIM18-327的基因功能研究奠定了基礎。eggNOG通過比較基因的序列來確定同源蛋白，并將其分配到特定的功能組中。共有7155基因在eggNOG數據庫中得到了注釋（圖2），其中未知功能注釋到的基因最多，達2400個，這也說明該菌基因組存在較多的未知區域，需要進一步地挖掘。

KEGG是1個整合了基因組、酶促反應和生物化學物質的數據庫，能直觀地顯示代謝途徑以及各途徑之間的關系。2885個基因在KEGG得到注釋，在代謝層級中，氨基酸代謝和碳水化合物代謝富集的基因數量最多，分別為537和513，其他次級代謝產物富集到的基因也達到了111個。

在星孢菌素的生物合成過程中，吲哚咔唑苷元來源于色氨酸，糖殘基來源于葡萄糖，而苷元和糖殘基連接后修飾的碳原子和質子來源于甲硫氨酸[1]。因此，KEGG注釋到的色氨酸生物合成（ko00400，27個基因）、聚酮糖單元生物合成（ko00523，7個基因）、甲硫氨酸代謝（ko00270、34個基因）和星孢菌素生物合成（ko00404，9個基因）等通路是研究星孢菌素生物合成與代謝調控的重點。后續研究可通過敲除或過表達上述通路中的基因來阻斷競爭支路代謝、增強星孢菌素生物合成，或者在發酵過程中添加通路中的代謝物來提高產量。

基因組中存在兩個線性質粒及1個環狀質粒，分別命名為pSTA1、pSTA2和PSTA3。它們的GC含量在68%～72%。最大的質粒為線性質粒pSTA1，長約0.17 Mbp，預測到含191個蛋白編碼基因。pSTA1基因中還含有1個原噬菌體，7個轉座子和1個復制整合酶等移動遺傳因子編碼基因，這些元件的存在促進了pSTA1與宿主間的遺傳物質交換。此外，pSTA1中存在接合轉移蛋白的編碼基因，部分序列與Streptomyces lydicus及Streptomyces sp. 769中的質粒 pSGZL高度同源，這表明在進化中發生了質粒的接合轉移。這些發現為研究基因組中質粒的進化和功能提供了重要線索。

2.2 Streptomyces sp. FIM18-327的次級代謝產物生物合成基因簇分析

antiSMASH預測到Streptomyces sp. FIM18-327中共有34個次級代謝產物生物合成基因簇，其中包括星孢菌素、多聚賴氨酸、柚皮素、依克多因、去鐵胺E等（表2）。除星孢菌素外，其他次級代謝產物在目前發酵條件下處于沉默或低水平表達狀態。

Streptomyces sp. FIM18-327中星孢菌素的生物合成基因簇由15個開放性閱讀框組成，如圖3所示。其中4個基因（staO、staD、staP和staC）等負責吲哚咔唑環K253c的生物合成，6個基因（staA、staB、staE、staK、staI和staJ）催化糖殘基dTDP-L-利托胺的合成，2個基因（staG和staN）負責K253c與dTDP-L-利托胺之間的C-N鍵形成，1個基因（staR）則負責轉錄調控。

星孢菌素生物合成基因在不同產生菌的染色體上區域分布存在差異。在Streptomyces sp. FIM18-327和Streptomyces sp. TP-A0274中成簇存在（Genbank登錄號：AB088119.1），而在Streptomyces fradiae CGMCC4.576（Genbank登錄號：CP023696.1）中被2.15 Mb的序列分隔成兩部分[12]。Streptomyces sp. FIM18-327中星孢菌素生物合成基因簇與Streptomyces sp. TP-A0274的相似性為82.20%，與Streptomyces fradiae CGMCC4.576的相似性為83.52%。這些差異可能導致了不同菌株之間星孢菌素合成能力的不同。

2.3 Streptomyces sp.FIM18-327接合轉移體系的建立

2.3.1 抗生素及其濃度的選擇

為豐富Streptomyces sp. FIM18-327遺傳操作中的抗性篩選標記，考察了該菌株對鏈霉菌遺傳操作中常用的幾種抗生素的敏感性。結果如表3所示，Streptomyces sp. FIM18-327對卡那霉素、安普霉素、紅霉素及硫鏈絲菌素比較敏感，12.5 μg/mL濃度的上述抗生素能完全抑制Streptomyces sp. FIM18-327的生長。這表明這幾種抗生素的抗性基因均可作為Streptomyces sp. FIM18-327的抗性篩選標記，為后續的遺傳操作提供了重要的參考依據。

2.3.2 接合轉移方法的建立

（1）接合轉移載體的選擇

pKC1139與pJTU4123是放線菌基因操作中常用的復制型載體，分別攜帶pSG5復制子和pIJ101復制子。在本研究中，以pKC1139和pFIM4123（pJTU413衍生質粒）為載體，分別構建了staR的敲除質粒pKC1139-staR和pFIM4123-staR（圖4）。經接合轉移后發現，pFIM4123-staR轉化Streptomyces sp. FIM18-327的效率（2.9×10-6）是pKC1139-staR（2.4×10-7）的10倍以上。因此選擇pFIM4123作為基因敲除載體。

（2）培養基的選擇

合適的接合轉移培養基能實現供受體的同步生長，從而促進質粒的跨屬轉移。研究比較了MS、高氏1號及ISP4等3種培養基對接合轉移效率的影響。按照“1.2.2”項下（3）方法，試驗組涂布供受體于上述培養基上，陰性對照組只涂布受體。結果如表4所示，試驗組在上述培養基上經均有接合子生長，其中MS培養基上接合子的數量較多，高氏1號培養基上只出現零星的接合子。而ISP4培養基，不管是試驗組還是對照組，都有菌落成片長出。因此選擇MS培養基作為接合轉移的培養基。

（3）Mg2+濃度的優化

Mg2+能促進質粒的跨屬轉移。為了確定最佳的鎂離子濃度，研究配置了一系列含不同濃度Mg2+的MS平板（0、10、20、40和80 mmol/L），并通過接合轉移效率來評估其影響。如表5所示，在20 mmol/L的Mg2+濃度下，接合轉移效率最高。

（4）staR敲除菌株的篩選與驗證

通過操縱途徑特異性調控因子LuxR，可增強或抑制次級代謝產物的生物合成[12，14-15]。本研究以星孢菌素產量較高的Streptomyces sp. FIM18-327為出發菌株，通過阻斷staR來建立該菌株的接合轉移體系。

通過松弛培養和影印點板，挑選安普霉素抗性敏感型菌株進行PCR篩選，結果如圖5所示，單交換菌株（泳道3）擴增出703和2521 bp條帶；回復突變菌株與出發菌株（泳道1）擴增出2521 bp條帶；雙交換菌株與質粒pFIM4123-staR擴增出703 bp條帶。因此，泳道7與9所代表菌株為回復突變菌株，泳道4、5、6、8與10所代表菌株為staR敲除菌株。回收泳道4中約700 bp條帶進行測序，測序結果與預測的staR敲除缺失菌株相符。挑選泳道4的菌株Streptomyces sp. FIM18-327-△staR1進行發酵驗證。

經HPLC檢測，出發菌株Streptomyces sp. FIM18-327發酵液中存在星孢菌素物質峰（保留時間為

13.68 min），而敲除了staR的菌株Streptomyces sp. FIM18-327-△staR1則未檢測到該峰（圖6）。HPLC的檢測結果再次驗證了staR的成功敲除，也說明了該基因是生物合成過程中必不可少的調控基因。

3 討論

星孢菌素具有強效的蛋白激酶C抑制活性，是一種重要的先導化合物，其衍生物如米哚妥林、UCN-01和來他替尼等已進入臨床或正在進行臨床試驗[16]。隨著合成生物學的發展，組合生物合成已成為高效獲取衍生物的重要手段，特別是對星孢菌素、rebeccamycin或K252a等吲哚咔唑類級代謝產物的生物合成基因進行組合表達，可產生許多結構新穎的衍生物[17-19]。然而，這些新衍生物產量通常較低，限制了它們的進一步開發和應用。

在此背景下，Streptomyces sp. FIM18-327顯示出工業化潛力，有望成為吲哚咔唑類新衍生物組合生物合成的理想宿主。通過對Streptomyces sp. FIM18-327的全基因組序列進行測序和分析，本研究注釋到了與星孢菌素合成密切相關的多個基因和代謝途徑。其中色氨酸生物合成、聚酮糖單元生物合成和甲硫氨酸代謝等關鍵代謝途徑的注釋，為通過代謝工程手段調控星孢菌素的合成提供了重要的靶標。

生物合成基因簇的差異會影響次級代謝產物的產量[7]，Streptomyces sp. FIM18-327中的星孢菌素生物合成基因簇與已報道的其他菌株存在差異，這為吲哚咔唑類級代謝產物的組合生物合成提供了豐富的基因元件。除星孢菌素生物合成基因簇外，Streptomyces sp. FIM18-327中還存在多聚賴氨酸、柚皮素等多個處于沉默狀態的次級代謝產物生物合成基因簇，值得我們進一步挖掘。

盡管星孢菌素的產生菌很多，但鮮有研究采用基因工程來提高野生菌星孢菌素的產量[7]。一方面，野生菌的產量普遍不高，因此基因改造提升產量的潛力有限，另一方面，高產菌株的遺傳操作難度大，直接對其進行基因改造并非易事。本研究通過接合轉移，成功建立了高效的遺傳操作體系，為星孢菌素高產菌的基因改造提供了有利條件。

總之，星孢菌素高產菌株Streptomyces sp. FIM18-327遺傳信息的解析和遺傳操作體系的建立，有助于從分子水平上了解和改造該菌株，也為星孢菌素的產量提升和高效組合表達奠定了基礎。

參 考 文 獻

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文章編號：1001-8689（2024）09-1004-09

收稿日期：2024-02-29

基金項目：福建省社會發展引導性（重點）項目（No. 2021Y0044）；福州市科技計劃項目（No. 2021-P-026）；福建省公益類科研院所專項

（No. 2020R10050011）；中央引導地方科技發展專項（No. 2021L3016）；福建省自然科學基金（No. 2022J01387）

作者簡介：方志鍇，男，生于1986年，助理研究員，主要研究方向為放線菌的遺傳改造，E-mail： fangzk1986@126.com

*通信作者，E-mail： zjian503@163.com