基于關聯分析挖掘小麥SDS 沉降值相關候選基因及KASP 標記開發

摘要：SDS沉降值是小麥品質育種的一項重要指標。對145份小麥品種的SDS沉降值進行了全基因組關聯分析，在染色體3DL 末端鑒定到成簇的顯著信號，結合peak SNP 的位置與LD 衰減距離鎖定587.514～589.514 Mb為候選區段；利用重測序數據（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）發掘該區段內候選基因的變異位點，再對SDS沉降值的候選基因進行關聯分析。綜合關聯結果、基因注釋和基因表達分析，獲得沉降值相關候選基因TraesCS3D03G1092400，命名為TaAGAP-3D。基于該基因的多態性SNP位點開發了可供育種利用的KASP標記Sv-3D-KASP，發現TaAGAP-3D（C）為SDS沉降值相關的優異等位變異。研究結果將為小麥SDS沉降值的遺傳改良提供有效分子標記，同時也為進一步克隆品質基因提供參考。

關鍵詞：小麥；SDS沉降值；全基因組關聯分析；候選基因關聯分析；KASP標記doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0895

中圖分類號：S511 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）12001812

小麥（Triticum aestivum L.）是世界上重要的糧食作物之一，在全球各地廣泛種植，以小麥為主要口糧的人口占世界總人口的35%～40%[1]。隨著生活水平的提高和消費結構的轉變，人們更趨向于營養、豐富和健康的飲食消費。因此，培育優質專用小麥已成為現階段小麥育種的重要目標。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）沉降值是小麥品質育種的一項重要指標[2]，其與蛋白質含量、濕面筋含量和穩定時間等呈顯著正相關[3]，同時SDS沉降值是由多基因控制的數量性狀，具有較高的遺傳力，能夠用于育種早代選擇[45]。

關聯分析（association analysis），又稱為關聯作圖（association mapping）或連鎖不平衡作圖（linkagedisequilibrium mapping），其基于基因位點間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）進行群體內基因型與表型的相關性分析，以此來確定與目標性狀密切相關的基因位點或標記位點[6]。根據基因型鑒定范圍的不同可將關聯分析分為全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）和候選基因關聯分析（candidate gene association study，CGAS）[7]。

隨著高通量測序技術的發展以及模型的更新，GWAS已成為解析作物復雜數量性狀的有力工具。席甜甜等[8]通過對337份小麥品種籽粒相關性狀進行GWAS，定位到49個穩定的顯著單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點。董一帆等[9]利用90K SNP芯片對259份小麥品種的沉降值、蛋白質含量等品質性狀進行GWAS，檢測到44個顯著關聯位點。CGAS是進行候選基因挖掘和功能驗證的一種有效手段，可以借助前人的QTL作圖、表達譜等研究結果，優先選擇與目標性狀相關的候選基因，結合表型數據、群體結構等進行候選基因關聯分析[10]。Ehrenreich等[11]基于275份擬南芥材料對51個開花時間相關基因進行關聯分析，進一步鑒定到2～10個與開花時間顯著相關的基因，其中CO 基因是最可能的候選基因。Wilson等[12]對玉米籽粒淀粉含量相關的6個候選基因進行了關聯分析，發現這些基因分別影響籽粒組分性狀、淀粉糊化特性和直鏈淀粉水平。上述結果表明，CGAS是候選基因挖掘及基因功能驗證的重要方法。

本研究以145份小麥品種為材料，結合重測序數據和多年多點SDS沉降值表型數據進行全基因組關聯分析，挖掘相關候選區段，進一步通過候選基因關聯分析篩選目標基因，根據目標基因的差異位點開發競爭性等位基因特異性PCR（kompetitiveallele-specific PCR，KASP）標記，并設計衍生限制性內切酶多態性標記（derived cleaved amplifiedpolymorphic sequences，dCAPS）加以驗證，為小麥品質基因克隆及分子機制解析提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間試驗設計

本研究以實驗室構建的145份重測序自然群體為材料，包含100份育成品種，25份地方品種和20份國外引進品種[13]。試驗材料分別種植在中國農業科學院作物科學研究所新鄉試驗基地（113°54′ E，35°18′ N）和中國農業科學院作物科學研究所順義試驗基地（116°65′ E，40°13′ N）。每份材料種植4行，行長2 m，行距25 cm，人工點播，每行播種40粒。田間管理依據當地農業生產實際進行管理，材料成熟后選取中間兩行全株收獲并脫粒曬干。

本研究試驗材料的鑒定環境包括2018/2019年河南新鄉（E1）、2019/2020 年河南新鄉（E2）、2019/2020年北京順義（E3）、2020/2021年河南新鄉（E4）、2020/2021 年北京順義（E5）、2021/2022年河南新鄉（E6）、2021/2022 年北京順義（E7）以及上述7個環境的最佳線性無偏估計（best linearunbiased prediction，BLUP）。

1.2 微量SDS 沉降值測定

將待試樣品按GB5497—1985[14]定溫定時法測定面粉含水量。用80 目篩旋風磨（型號Cyclotec 1093，FOSS公司，德國）將小麥磨成全粉，參照馬傳喜等[5]方法測定微量SDS沉降值。具體步驟如下：稱取全麥粉2 g，裝入35 mL的專用帶塞試管中，加入16.7 mL溴酚藍溶液，充分混勻后放置到沉淀值測定儀（型號Y15，YUCEBAS公司，土耳其）上搖5 min；取下試管再加入16.7 mLSDS-乳酸混合液（稱取20 g SDS，加入20 mL乳酸儲備液，用水溶解并定容至1 L），充分搖勻，放置到測定儀上搖5 min；取下試管豎立靜止放置5 min，記錄試管中沉淀體積。

每個樣品2次重復，取其平均值。以面粉含水量14%（質量分數）濕基計算沉降值（mL），公式如下。

1.3 表型數據統計

采用IBM SPSS Statistics 27.0 軟件（https：//www.ibm.com/spss）和Microsoft Excel 2021對表型數據進行t 檢驗、方差分析和基本描述性統計。利用R語言“lme4”程序包[15]計算BLUP值，以基因型為固定效應、環境為隨機效應，計算遺傳力（公式2）。通過R語言繪制不同環境下SDS沉降值的頻率分布圖和相關性分析圖。

1.4 全基因組關聯分析

基因型數據來自實驗室前期獲得的重測序數據[13]，本研究利用VCFtools-1.15對其進行質控，共鑒定到37 466 916個高質量的多態性SNP位點。質控參數為--minGQ 8 --minDP 12 --max-missing 0.9 --maf0.05 --min-alleles 2 --max-alleles 2。群體結構、LD衰減距離及主成分分析等參照已發表結果[13]，即群體結構和主成分均為3，LD衰減距離為2 Mb。

全基因組關聯分析采用GEMMA（genomewideefficient mixed-model association）軟件的混合線性模型（mix linear model，MLM）[16]，利用Q+K矩陣矯正群體結構和親緣關系的影響。為了進一步控制假陽性，顯著性閾值設定為Plt;1.0×10-6。

通過R語言將關聯分析的曼哈頓圖和Q-Q圖進行可視化。通過LDBlockShow v1.39 軟件[17]統計區段內變異位點的連鎖不平衡程度并繪制熱圖。基于expVIP8（http：//www. wheat-expression.com/）分析基因表達模式。

1.5 候選基因關聯分析

在顯著關聯候選區段發掘的基礎上，利用實驗室前期的重測序數據[13]（http：//wheat.cau.edu.cn/WheatUnion/）查詢區段內所有候選基因的序列變異（包含上下游及3’/5’-UTR區的變異），提取全部變異位點作為基因型數據。候選基因關聯分析使用GAPIT v3.0包（genomic association and predictionintegrated tool version 3.0）[18]的貝葉斯信息與連鎖不平衡迭代嵌套式模型（bayesian-information andlinkage-disequilibrium iteratively nested keyway，BLINK）[19]。依據Bonferroni 方法，以Plt;1.0×10-4 為閾值判定SNP標記與目標性狀顯著關聯。

1.6 KASP 標記開發與驗證

根據候選基因顯著關聯位點設計特異性KASP引物（WheatOmics v1.0網站，http：//wheatomics.sdau.edu.cn/），包含2條帶有熒光接頭的分型上游引物F1-FAM 和F2-HEX 以及1 條通用下游引物Common-primer-R，引物序列見表1。KASP引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，反應在384孔熒光定量PCR板上進行。混合反應體系5 μL∶2.2 μL DNA（20～40 ng·μL-1），2.5 μL KASP Mastermix 和0.3 μL Primer mix（F1-FAM、F2-HEX、Common-primer-R分別3.0、3.0、7.5 μL，利用ddH2O加到25 μL）。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火40 s，10個循環；95 ℃變性20 s，58 ℃退火40 s，37個循環；28 ℃讀板 1 min。采用QuantStudioTM 7 Flex 熒光定量儀（appliedbiosystems by life technologies）對擴增產物進行熒光信號檢測，QuantStudioTM Real-time PCR Software v1.3（applied biosystems by life technologies）軟件實現數據的可視化及結果判讀。通過OriginPro 2024軟件（https：//www.originlab.com/）對KASP 變異與SDS 沉降值的箱線圖進行可視化。

1.7 dCAPS 擴增與酶切

為了驗證KASP標記的有效性，進一步利用dCAPS Finder 2.0網站（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）設計特異性dCAPS引物，包含一輪特異性正向引物dCAPS-F1 和反向引物dCAPS-R1（表1），該引物擴增包含變異位點的585 bp PCR產物。第2次PCR時，在SNP位點上游引入GA變異，包含特異性正向和反向引物dCAPS-F2 和dCAPS-R2（表1），并形成內切酶Sal Ⅰ的識別位點“GTCGAC”。利用內切酶Sal Ⅰ對二次PCR產物進行酶切，酶切產物在4%的瓊脂糖凝膠中電泳。

具體的實驗步驟如下：首先進行一輪PCR，反應體系為DNA（50 ng·μL-1） 2 μL，2×Mix 10 μL，dCAPS-F1 （10 μmol·L-1） 1 μL， dCAPS-R1（10 μmol·L-1） 1 μL，加ddH2O補至20 μL。PCR擴增程序如下：95 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫。然后，將一輪PCR 產物稀釋200倍作為二輪PCR的模板，引物為dCAPS-F2和dCAPS-R2，使用2×Mix進行二輪PCR，體系及擴增程序同上。利用內切酶Sal Ⅰ對二輪PCR產物進行酶切孵育，孵育條件為37 ℃，4 h。反應體系為：PCR 產物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性內切酶0.2 μL，ddH2O補至10 μL。最后，酶切產物在4%的瓊脂糖凝膠電泳（120 V穩壓電泳20 min）。

2 結果與分析

2.1 SDS 沉降值表型變異分析

145份供試材料多年多點的SDS沉降值基本描述性統計分析結果如表2所示。可以看出，不同環境下SDS 沉降值的變異系數在14.15%～19.30%，其廣義遺傳力為94.10%，這表明SDS 沉降值主要受遺傳因素影響，供試材料間存在較豐富的遺傳變異。SDS沉降值的偏度和峰度絕對值均小于1，且頻率分布直方圖均呈現出正態分布（圖1），表明SDS沉降值是由多基因控制的數量性狀，適用于后續的關聯分析。相關性分析（圖1）發現，環境間的SDS沉降值呈極顯著正相關，相關系數在0.47～0.94（Plt;0.001）。

2.2 SDS 沉降值全基因組關聯分析

基于質控后的重測序基因型數據，利用GEMMA軟件的MLM模型對多環境下的SDS沉降值進行全基因組關聯分析。根據LD衰減距離，將peak SNP位置前后1 Mb設定為候選區段。在3DL末端發現成簇的顯著信號（Plt;1.0×10-6），參照peakSNP的物理位置，鎖定587.514～589.514 Mb為候選區段（圖2A）。該區段內變異位點的連鎖不平衡分析發現（圖2B），多個LD區域與顯著位點強連鎖，進一步表明該區段與SDS沉降值存在較強的關聯性。基于WheatOmics v1.0 網站（http：//wheatomics.sdau.edu.cn/）查詢發現，該區段包含28個高置信基因，其中通過expVIP 數據庫（https：//www.wheat-expression.com/）預測顯示9個基因在籽粒中表達（圖2C）。

2.3 3DL 末端區段候選基因關聯分析

利用重測序數據（http：//wheat. cau. edu. cn/WheatUnion/）查詢28個高置信基因的變異位點，其中21個基因存在變異位點，獲得1 473個SNPs。結合多年多點的SDS沉降值表型數據，利用GAPITv3.0包的BLINK模型進行候選基因關聯分析，結果（圖3A、B）表明，6 個SNP 位點顯著關聯（Plt;1.0×10-4），其中1個位點在4個環境下均顯著關聯（圖3A、表3）。進一步對關聯位點進行注釋，4個位點為啟動子上游，5’-UTR和編碼區變異，而其他2個位點為內含子變異（圖3A，表3）。有趣的是，這6個關聯位點分別位于6個基因上，這些基因的表達量分析發現僅有3個基因在籽粒中表達。結合表達量分析和變異位點注釋，初步鎖定TraesCS3D03G10-92400 和TraesCS3D03G1089600 為候選基因。基因注釋表明TraesCS3D03G1092400 編碼GTP相關的激活蛋白（Arf GTPase activating protein），而TraesCS3D0-3G1089600 編碼絨毛蛋白（Villin）。綜合上述結果，推測TraesCS3D03G1092400 為SDS沉降值的候選基因，并將其命名為TaAGAP-3D。

2.4 TaAGAP-3D 基因KASP 標記開發與驗證

根據TaAGAP-3D 編碼區上SNP 的兩種變異類型（C/T）（圖A），開發了有效區分它們的KASP標記Sv-3D-KASP（圖B）。為了進一步驗證KASP標記的準確性，同時設計了dCAPS 標記Sv-3DdCAPS-1（圖4C），該標記的分型結果與KASP 標記基本吻合（表4）。進一步結合多年多點的SDS沉降值數據驗證KASP標記的遺傳效應，發現在大多數環境下TaAGAP-3D（C）型材料的SDS 沉降值顯著高于TaAGAP-3D（T）型材料（圖4D），表明TaAGAP-3D（C） 是SDS 沉降值相關的優異等位變異。

3 討論

3.1 小麥3D 染色體上沉降值關聯區段的多效性分析

小麥是異源六倍體作物，與A、B亞基因組相比，其D亞基因組的遺傳多樣性嚴重匱乏，是小麥品種改良的重要瓶頸[2021]。本研究在3D染色體的末端定位到1個SDS沉降值候選區段，其物理位置為587.523～589.514 Mb。陳華斌[22] 利用90KSNP芯片鑒定272份小麥材料，結合蛋白質含量進行了全基因組關聯分析，發現在3DL末端檢測到多個顯著位點（IWB18421、IWB42714、IWB6798、IWB2250 和IWB58810），其物理位置相近，分別為596.089、596.718、596.916、596.916 和609.626 Mb；基于全基因組LD衰減距離18.3 Mb，該研究將這些位點劃分到了同一QTL區段，而該區段涵蓋了本研究鑒定到的位點。彭小愛等[23]對118份小麥材料的55K SNP芯片基因型數據和容重進行全基因組關聯分析，在3個環境下均定位到了3D染色體上的顯著關聯位點AX-108887454，其物理位置為590.04 Mb；基于作者報道的8 Mb全基因組LD衰減距離，該候選區段同樣包含了本研究定位到的區段。這些結果表明本研究鑒定的3DL末端區段可能控制多個品質性狀，其遺傳基礎有待進一步深入解析。

3.2 聯合多種關聯分析縮小候選區段及預測候選基因

全基因組關聯分析（GWAS）是對全基因組范圍內的基因型與表型進行關聯分析的方法，根據成簇的顯著信號及LD衰減距離定位候選區段[24]。而候選基因關聯分析（CGAS）則通過目標區段內候選基因的變異位點與表型展開關聯分析，利用統計分析挖掘與目標性狀相關的基因或功能位點[25]，從而進一步篩選候選基因。前人的研究大多數僅考慮使用GWAS或CGAS單一方法鑒定候選區段或基因，如Wen 等[26]利用重測序技術對121份棉花種質資源進行GWAS，檢測到與株高和果枝數量相關的11 個QTLs；Setter 等[27] 對玉米540個基因的1 229個SNP進行候選基因關聯分析，發現一些基因的SNP與糖和脫落酸相關。前人也聯合GWAS與其他組學分析進行共定位以縮小候選區段和預測候選基因，如Tang 等[28]結合GWAS和轉錄組分析來解析505份甘藍型油菜含油量的遺傳基礎，通過GWAS鑒定到27個與含油量顯著相關的QTLs后，進一步利用轉錄組分析鎖定了候選基因；Anacleto等[29]聯合GWAS和轉錄組關聯分析（transcriptome-wide association study，TWAS）對305 份秈稻的血糖生成指數（glycemicindex，GI）進行分析，GWAS在 6號染色體上鑒定到1 個與GI 性狀相關且包含26 個基因的區段，TWAS分析進一步將該區段內的候選基因縮小至13個。本研究通過聯合GWAS和CGAS有效縮小了與SDS沉降值相關的候選區段并預測了候選基因（圖2A和3A）。因此，全基因組關聯分析聯合其他多種分析方法如候選基因關聯分析，可以更有效地發掘作物重要農藝性狀基因。

本研究預測的候選基因TraesCS3D03G1092400 被注釋為ARF-GTP酶激活蛋白，關聯分析表明該基因與SDS沉降值相關。鑒于水稻中已克隆了1個具有相同注釋的基因OsAGAP[30]，因此將其命名為TaAGAP-3D。研究表明，OsAGAP 能夠調節生長素內流、囊泡運輸和根發育[31]；并且在小麥中發現GPC-B1 編碼NAC轉錄因子（NAM-B1），RNA干擾后延遲衰老并使小麥籽粒的蛋白質、鋅和鐵含量降低30%以上[32]。綜上所述，推測TaAGAP-3D可能響應生長素調節信號使營養物質進行再分配，其基因功能和分子機制有待通過多種分子生物學方法進一步研究。

3.3 小麥品質相關KASP 標記開發與應用

隨著分子生物技術的快速發展，分子標記輔助選擇已經成為現代分子育種的有效工具[33]。基于SNP的KASP基因分型技術具有靈活性強、高通量、成本低及操作簡單高效等特點，在分子標記輔助選擇育種中得到廣泛的應用。在小麥中，KASP技術多用于抗病和耐非生物脅迫相關基因的研究[34]，而在品質方面的分子標記還較少。魏廣源等[35]通過硒含量相關的SNP位點開發KASP標記AX-1和AX-2，該標記能夠有效區分高硒和低硒籽粒樣品并用于高硒小麥選育。Liu等[36]基于Gli-γ1-1D 的2種主要單倍型（Gli-γ1-Ⅰ和Gli-γ1-Ⅱ）開發了KASP標記，206份小麥材料基因型鑒定發現攜帶Gli-γ1-Ⅰ材料的SDS沉降值顯著高于攜帶Gli-γ1-Ⅱ材料，這為Gli-γ1-Ⅰ在小麥品質分子育種中的利用提供了可靠標記。畢俊鴿等[37]針對QTL定位到的與籽粒蛋白質含量相關的候選基因開發了2個KASP標記并在166份國內外小麥材料中進行驗證，用于篩選高籽粒蛋白質含量的優異資源。本研究基于TaAGAP-3D 多態性SNP 位點開發了KASP 標記Sv-3D-KASP，并發現TaAGAP-3D（C）為SDS沉降值相關的優異變異，將為小麥品質分子標記輔助育種提供新基因和新標記。

參 考 文 獻

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