辣椒響應逆境脅迫的誘導型啟動子研究進展

摘" " 要：干旱、澇漬、極端溫度以及病蟲害等多種逆境脅迫嚴重影響辣椒的生長，導致辣椒發育不良而減產。啟動子包含重要的順式作用元件，對目的基因的表達調控有重要作用，尤其是植物誘導型啟動子，在脅迫條件下會激發抗逆調控機制與激活目的基因表達，改變植物代謝組分和生理生化反應，增強植物抗逆性。主要對辣椒應答干旱、高溫、低溫、鹽等非生物和生物脅迫誘導型啟動子的種類、功能以及與反式作用因子的互作進行綜述，以期為進一步研究辣椒基因誘導型啟動子提供一定的理論依據和抗逆品種改良提供參考。

關鍵詞：辣椒；逆境脅迫；誘導型啟動子；功能分析

中圖分類號：S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）12-001-08

收稿日期：2024-07-29；修回日期：2024-09-24

基金項目：國家自然科學基金（32260760）；貴州省科技計劃項目（黔科合成果2020 1Z002號）

作者簡介：楊柳煙，女，在讀碩士研究生，研究方向為蔬菜生理生態與生物技術。E-mail：2856490986@qq.cm

通信作者：耿廣東，男，教授，主要從事蔬菜栽培生理生態和生物技術的研究。E-mail：genggd213@163.com

Research progress on inducible promoters of pepper in response to stresses

YANG Liuyan， OU Siyang， ZHANG Suqin， GENG Guangdong

（College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract： Drought， waterlogging， extreme temperature， pests and diseases seriously affect the growth of pepper， leading to poor development and reduced yield. Promoters contain important cis-acting elements and play crucial roles in regulating the expression of target genes. Plant inducible promoters can stimulate stress resistance regulatory mechanisms and activate the expression of target genes under stress conditions， which alter plant metabolic components and physiological-biochemical reactions， and enhance plant stress resistance. In this paper， the authors mainly review the types， functions， and interactions with trans-acting factors of inducible promoters in response to abiotic and biotic stresses， such as drought， high temperature， low temperature， salt in pepper， in order to provide a theoretical basis for further research on inducible promoters of pepper genes and stress-tolerant cultivar improvement.

Key words： Pepper; Stress; Inducible promoter; Functional analysis

辣椒為茄科辣椒屬一年生或有限的多年生草本植物。近年來，我國辣椒栽培面積和產量穩居世界首位，栽培面積穩定在210萬hm2以上，占蔬菜種植面積的10%以上，且產量和收益十分可觀，是我國經濟價值較高的蔬菜作物之一[1-2]。辣椒因營養成分豐富以及特有的辣味深受人們的喜愛，是全球銷量最高的辛辣調味品，種植面積逐步擴大。但近幾年，由于天氣變化多端，植株在生長過程中容易受到逆境脅迫，影響植株正常生長發育。辣椒為淺根系蔬菜，既不耐旱也不耐澇，多種逆境脅迫下會嚴重制約辣椒的生長發育，導致產量和品質下降，因此尋找合適的措施來抵御逆境是十分重要的。前人研究大多是基于改良土壤或者栽培技術、施用農藥以及常規育種等措施來提高辣椒的抗逆性，但存在一定的局限性。隨著轉基因以及分子技術的迅速發展，許多研究者在植物中已經報道響應逆境脅迫的關鍵基因，并克服了上述局限性，為辣椒抗逆育種開辟了新途徑。此外，抗逆基因對逆境的適應性越強，其表達量也越高，而基因表達受到轉錄調控的影響，轉錄調控是植物基因表達調控的一個重要環節，依賴多種反式作用因子和順式作用元件相互協調和作用，共同提高目的基因的表達水平[3]。

啟動子是重要的順式作用元件，它位于結構基因5'端上游區域，是能夠指導RNA聚合酶與模板正確結合、保證基因轉錄準確而有效起始的一段DNA序列。它主要由核心啟動子區和上游調控區組成，上游調控區有多種關鍵元件，能與反式作用因子共同作用，調控下游目的基因表達[4]（圖1）。根據基因表達情況，可將啟動子分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導型啟動子三類[5]。組成型啟動子在對植物進行調控時不會受到外界的影響，利用組成型啟動子來調控目的基因，能夠讓基因持續保持強烈的高表達量，但是持續表達會造成植物能量過度消耗，阻礙植物生長，造成植物減產。組織特異型啟動子是只在植物特異的組織、器官中起作用。誘導型啟動子是在特定的逆境脅迫條件下被激活，啟動下游基因表達，并在植物體內產生大量的調節反應特異蛋白，使得植物表現出一定的抗逆性，抵御外界環境[6-7]。誘導型啟動子的形成對提高辣椒體內的許多抗逆基因響應逆境脅迫具有重要作用，說明啟動子對基因的表達調控具有重要作用[8]。因此，篩選出合適的誘導型啟動子對選育抗逆性強的作物品種是十分重要的，該啟動子在逆境條件下既可以增強植株抗逆基因的表達，提高抗逆性，達到預期目標，又不會對植物產生副作用。目前，關于植物啟動子響應逆境脅迫的研究已經成為全球熱點。筆者綜述了辣椒應答逆境脅迫的誘導型啟動子功能、順式作用元件以及關鍵元件等方面的研究進展，分析了誘導型啟動子調控機制，篩選出能積極響應辣椒逆境脅迫條件下合適的誘導型啟動子，為辣椒抗逆分子育種技術研究提供一定的理論和研究基礎。由于響應辣椒蟲害的基因啟動子較少，筆者只綜述了與病害相關的啟動子，并總結了關于辣椒逆境基因啟動子預測元件的作用。

1 響應非生物脅迫的誘導型啟動子

1.1 響應干旱脅迫的誘導型啟動子

水是植物正常生長不可缺少的成分之一，水分虧缺會引起植物葉片氣孔關閉、細胞滲透勢降低、活性氧增加、光合作用效率下降等現象[9]。辣椒屬于淺根系植物，根系發育較弱，對水分的吸收能力差，因此缺水對辣椒生長發育有不利的影響[10]。在干旱脅迫下，細胞可以傳遞信號，誘導響應水分脅迫相關基因的表達。通常抗旱基因啟動子可能會包含DRE（dehydration-responsive element）元件、ABRE元件（ABA-responsive element）、ABF（ABA-binding factor）等順式作用元件。植物脫水素（DHNs）是一種具有高度親水性的植物蛋白，也是一種有抗逆境脅迫能力的蛋白，在植物非生物脅迫過程中起很大的作用[11]。前人發現CaDHN4基因啟動子存在響應干旱的順式作用元件。劉蘇雅[12]通過沉默CaMYB025轉錄因子使辣椒體內CaDHN4基因表達量降低，CaDHN4啟動子含有的CGGTCAGT區域為干旱脅迫元件，推測轉錄因子CaMYB025可能與CaDHN4基因啟動子的CGGTCAGT順式作用元件結合，提高CaDHN4基因的表達量，二者共同響應干旱脅迫（圖2）。鈣離子（Ca2+）作為植物重要的第二信使，在植物逆境脅迫條件下，通過鈣調神經磷酸酶B類蛋白（CBLs）和CBLs相互作用蛋白激酶（CIPKs）解碼和傳遞來響應干旱脅迫[13]。馬瀟[14]研究認為，干旱脅迫可以激活CaCIPK3和CaCIPK7基因啟動子，推測CaCIPK3和CaCIPK7基因啟動子可以作為響應干旱脅迫的誘導型啟動子，提高基因的表達量。此外，通過酵母單雜試驗發現，CaCIPK3基因啟動子受到CaRKY4轉錄因子的調控，CaCIPK7受到CaMYB4和CaMYB8調控，各自協調互作正向調控2個基因的表達，增強辣椒抗旱性。Ma等[15]克隆了CaCIPK7基因，分析了其啟動子含有與干旱相關的MYB結合位點和ABA響應順式作用元件，并分析認為CaCIPK7基因啟動子可以作為響應干旱脅迫的誘導型啟動子。谷胱甘肽S-轉移酶（GST）是一類多功能酶家族，參與調節植物生長、發育和脅迫反應。Islam等[16]對辣椒的85GST基因進行鑒定，利用PlantCARE數據庫檢索了CaGST基因轉錄起始位點5'上游1000 bp的區域，確定該啟動子具有幾種防御反應元件，如熱脅迫響應（HSE）、低溫響應（LTR）以及干旱誘導相關MYB結合位點（MBS）等元件，這些結果表明大多數CaGST啟動子能夠響應非生物脅迫。

1.2 響應鹽脅迫的誘導型啟動子

在鹽脅迫下，辣椒細胞內外離子和水分平衡失調，代謝紊亂，導致植物細胞膜受損和大量的活性氧積累，造成辣椒產量降低。植物DHNs屬于LEA家族，是一類高度親水的蛋白質，在植物逆境脅迫的防御中起著至關重要的作用。Zhang等[17]將CaDHN4基因啟動子區域克隆到載體，構建CaDHN4pro：GUS，在鹽脅迫處理下，過表達擬南芥株系顯示出更強的GUS染色，表明辣椒CaDHN4基因啟動可能是鹽脅迫下的合適誘導啟動子，提高下游目的基因的表達量。半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases，CPs）對調節和降解活性氧有重要作用。杜清潔等[18]對CaCP1基因上游2086 bp啟動子的調控元件預測得出該基因啟動子具有5個響應干旱MYC元件、脫落酸（ABA）響應元件、ABRE光響應元件Box4和G-box以及防御等順式作用元件，并且順式作用元件CAAT-box分布在整個CaCP1啟動子區域中。為探索CaCP1基因啟動子序列中響應鹽脅迫的區域，構建4段不同長度（-2086、-1540、-980、-410 bp）的啟動子片段重組載體，通過瞬時轉化煙草以及GUS表達量分析表明，4個啟動子缺失區域均表現出藍色，且高于對照，其中-410 bp缺失區域顏色最深，表明-410～1 bp啟動子缺失片段能強烈地響應鹽脅迫，并對CaCP1基因轉錄有較大的激活作用，增強了對鹽脅迫的適應性。CabHLH035在鹽脅迫后表達量增加，還可以直接結合CaSOS1和CaP5CS基因啟動子，并積極激活它們的表達，增強辣椒的抗鹽性[19]。有些基因只有被啟動子的某個特定區域片段激活才起作用。從辣椒基因組分離CAChi2基因啟動子1365 bp，發現啟動子含有典型的TATA-box和CAAT-box，可以與特異的蛋白質結合，啟動轉錄。同時也存在MYB、MYC結合位點、W-box、乙烯響應元件（ERE）、低溫響應元件以及ABRE-like等元件。為確定在鹽脅迫處理下CAChi2基因啟動子活性所需的最小啟動子序列，構建CAChi2基因ATG翻譯起始位點上游-1365、-878、-661和-378 bp啟動子缺失片段到GUS報告基因上的載體，瞬時轉化煙草后進行熒光定量測定，得出-878 bp片段基因啟動子對基因有明顯的誘導作用，提高下游基因的表達量，從而增強植株的耐鹽性[20]。

1.3 響應低溫脅迫的誘導型啟動子

低溫是植物主要的非生物脅迫因子，可引起植物生理生化性質的改變，從而限制植物正常生長。辣椒原產熱帶地區，是喜溫植物，溫度過低會引起辣椒水分缺失、光合作用效率降低以及養分流失等現象，從而導致蛋白合成減少、代謝能力降低等，造成生命力降低甚至停止[21]。NAC轉錄因子中的CaNAC035對辣椒的低溫脅迫有正向調控作用[22]。Wang等[23]利用酵母單雜交鑒定出CabHLH79與CaNAC035啟動子結合，為了研究CabHLH79激活CaNAC035基因的能力，利用CabHLH79直接靶向CaNAC035啟動子，在煙草中使用CabHLH79作為效應物進行了雙熒光素酶（LUC）測定，發現效應因子和GUS報告基因的共轉化顯著提高了啟動子活性，表明CabHLH79能夠激活CaNAC035基因啟動子，共同調節低溫脅迫。從辣椒DNA分離出CABPR1基因并擴增啟動子，發現其啟動子在-38 bp位置包含典型的TATA-box元件，其他位置還存在GCC-boxes元件、響應赤霉素元件等。為鑒定啟動子活性以及在低溫調節下對CABPR1進行表達調控，構建該基因啟動子的一系列片段缺失并驅動GUS報告基因，發現4 ℃低溫可以誘導CABPR1基因啟動子-670 bp片段區域響應，調控CABPR1基因表達，增強對低溫的抗性[24]。生物膜不僅為細胞生命活動提供一個穩定的內環境，還承擔信號轉導、能量轉換等功能。而膜脂質是生物膜的重要成分之一，參與細胞結構和生理功能，因此，了解關于膜脂質與響應冷基因之間的關系是十分重要的。Kong等[25]利用酵母單雜交驗證了CaNAC1與CaPLDα4相互作用，CaNAC1基因在4 ℃低溫下被誘導且高度表達，CaPLDα4基因被證明可能是導致辣椒在低溫脅迫下膜脂質降解的主要因素，了解其轉錄調控機制具有重要意義。進一步將CaPLDα4基因啟動子截短為4個區域，并用生物素標記，與純化的CaNAC1蛋白進行EMSA反應，結果表明CaNAC1與CaPLDα4基因啟動子結合元件位置是CTGCAG，說明CTGCAG可能是關鍵的順式作用元件。馬玉虎等[26]研究了CaPP2Cs基因啟動子的順式作用元件，發現有低溫響應元件、光響應元件、厭氧誘導元件以及激素類響應元件等。脫水素（DHNs）不僅響應干旱、鹽脅迫，也是一種重要的低溫響應蛋白，辣椒CaDHN3啟動子序列中含有響應低溫（ARE）的作用元件[27]。

1.4 響應高溫脅迫的誘導型啟動子

辣椒是喜溫植物，最適生長溫度20～25 ℃，35 ℃以上可發生熱害。在高溫脅迫下，辣椒體內活性氧代謝紊亂，自由基積累增多，造成生理代謝失調，導致植株生命力降低，最終影響辣椒的產量與品質[28]。植物熱激轉錄因子（Hsfs）能夠調控非生物脅迫下響應基因的表達，如干旱脅迫、熱脅迫和鹽脅迫。在高溫脅迫下，許多高等植物會誘導大量熱激蛋白如HSP70、HSP100等的表達。從辣椒Hsp70家族鑒定出有11個CaHsp70基因的啟動子含有熱脅迫元件，其中，在CaHsp70基因的10號染色體啟動子區HSE元件最多[29]。植物受到各種脅迫如高溫、機械損傷、病原菌等會在體內產生次生代謝物，這些脅迫條件下產生的代謝產物稱為植保素，當其積累到一定程度時可以抵御外界環境脅迫。CaSC是辣椒倍半萜環化酶，在辣椒倍半萜植保素合成過程起著重要作用。嚴雁[30]從辣椒DNA分離并克隆出CaSC2基因上游啟動子序列，分析發現CaSC2基因啟動子存在HSE（熱應激反應）元件、W-box、S-box以及響應乙烯等元件。為研究在43 ℃高溫脅迫下CaSC2基因啟動子的表達調控機制，構建一系列的CaSC2啟動子缺失體（-1227、-926、-828、-660、-229 bp）融合到GUS報告基因的載體，對轉基因煙草進行高溫處理，證明了所有的啟動子缺失體在43 ℃高溫處理下都明顯誘導了GUS基因的表達，表明CaSC2基因啟動子可以作為響應高溫脅迫的合適誘導型啟動子。Ca2+作為植物第二信使參與高溫應答的生理過程調節[31]。突觸結合蛋白（SYT）最開始是動物體內的一類蛋白，后期在擬南芥植物中研究發現有6個SYT家族基因，SYT可作為Ca2+的結合蛋白，實現Ca2+信號傳遞運輸，響應高溫脅迫。王榕璋[32]對CaSYT5基因上游序列的順式作用元件進行分析，發現該基因啟動子存在高溫相關元件HSE以及響應激素（乙烯、生長素）相關元件，并且在40 ℃高溫處理2 h后，CaSYT5基因表達水平與空白對照形成極顯著差異，預測CaSYT5基因的啟動子積極應答高溫脅迫。AP2/ERF家族是植物界最大的轉錄因子（TF）家族之一。AP2/ERF在植物生長發育、激素信號轉導以及逆境脅迫方面有重要作用[33]。Jing等[34]鑒定辣椒AP2/ERF基因順式調控元件，發現總共17種對植物激素和各種脅迫有反應的順式元件，如HSE（熱應激反應）、LTR（低溫應激反應）、MBS（干旱誘導能力）和富含TC的重復序列（參與防御和應激反應），存在于大多數CaAP2/ERF基因啟動子區域。

2 響應生物脅迫的誘導型啟動子

在辣椒生長過程中容易發生病害影響辣椒的生長發育，造成辣椒產量降低。因此，對辣椒抗病相關基因啟動子的研究十分重要。WRKY是植物中最大的TF家族之一，WRKY轉錄因子主要參與植物生物和非生物脅迫[35]。Liu等[36]克隆出CaWRKY40基因啟動子，長度為1802 bp，分析發現該啟動子含有核心啟動子基序（TATA-box）、防御相關基序（Wbox基序、ABRE基序）等，為進一步確認CaWRKY40啟動子在接種青枯菌（RSI）后轉錄上調的具體功能，將pCaWRKY40：GUS轉化煙草，發現RSI顯著誘導了GUS的表達。此外，為進一步確定pCaWRKY40的核心功能區域對RSI的反應，基于基序的分布產生了pCaWRKY40的5個5?缺失（-1802、-1464、-1060、-746和-360 bp），然后與GUS基因融合，結果表明在RIS處理下，-1802 bp區域表現出顯著水平的GUS誘導，其他區域沒有明顯反應，證明-1802 bp啟動子片段的某些部分是可以作為響應青枯菌的誘導型啟動子（圖3）。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯在植物的生長發育以及應答病害方面有著重要作用。楊明星等[37]對辣椒CaMAPK7基因啟動子進行克隆，構建該啟動子和GUS報告基因載體進行瞬時表達，發現在RSI的處理下，12 h后GUS蛋白活性顯著增強，是對照的2.63倍，表明CaMAPK7啟動子能夠響應RSI。Shen等[38]利用染色質免疫沉淀（ChIP）-PCR檢測CaCML13基因的含g-box的啟動子與CabZIP63結合情況，結果證明CabZIP63直接靶向含有g-box的CaCML13啟動子片段結合參與了辣椒對RSI的免疫，啟動子與轉錄因子共同作用增強了辣椒對RSI的抗性。幾丁質可以被幾丁質酶還原降解，從而可以抑制病原體，有研究表明，幾丁質酶基因的大量表達可以增強植株對真菌的抵抗力。Liu等[39]發現，辣椒編碼中含有幾丁質結合域的幾丁質酶蛋白基因ChiIV3，分離出ChiIV3基因啟動子上游1017 bp片段，分析發現存在6個W-box、4個CGTCA-motif等元件，構建pChiIV3：GUS瞬時轉化辣椒，在接種辣椒疫酶菌孢子24 h和28 h后，由pChiIV3驅動的GUS在辣椒葉片顯著表達。為進一步確定pChilV3響應辣椒疫霉侵染的關鍵啟動子區域，擴增ChilV3啟動子5'不同大小片段的缺失（-1017、-892、-712、-459和-276 bp），構建與GUS報告基因融合載體并轉化煙草，研究發現-712～-459 bp區域的啟動子可調控ChilV3基因表達，預測該區域的啟動子可以作為疫霉入侵的合適誘導型啟動子。AMP1是擬南芥體內的一個重要編碼基因[40]。CaAMP1是從油菜黃單胞菌感染的辣椒葉片中分離出的有高抑菌活性的新型抗菌蛋白基因，利用農桿菌瞬時轉化煙草，分析煙草中CaAMP1基因轉錄起始位點上游-1190 bp區域的一系列5'缺失，來確定與GUS報告基因融合的CaAMP1啟動子的活性。結果表明，CaAMP1基因啟動子（-1190、-967、-626 bp）可作為誘導型啟動子來應答煙草假單胞桿菌的脅迫。此外，研究發現轉錄因子CaRAV1可以激活CaAMP1基因，提高了該基因的表達能力，增強了對抗病害的能力[41]。CaPIMP1基因啟動子中存在與激素和脅迫相關反應的調控元件，為了確定CaPIMP1基因啟動子響應RIS的最小啟動子序列，從CaPIMP1啟動子上游的-1193、-1017、-793、-593和-417 bp開始的啟動子片段與GUS報告基因融合，瞬時轉化煙草，最后得出只有-1193 bp區域片段的啟動子可以被病原菌誘導，調控CaPIMP1基因表達，增強抗病性[42]。Lee等[43]克隆CaSAR82A基因啟動子，并構建CaSAR82A啟動子一系列5′缺失與GUS報告基因融合，瞬時轉化煙草，根據GUS蛋白活性得出在感染煙草假單胞桿菌致病變種24 h后，啟動子區域-831～-759 bp的序列被強烈誘導表達，表明病原體誘導表達CaSAR82A基因所需的順式作用元件可能位于啟動子區域內，該區域的啟動子可能促進CaSAR82A基因表達來抵御植物受到病原體侵害（表1）。

3 展 望

辣椒在16世紀傳入中國，因其適應性強，在中國大面積種植且已經形成一個完整的產業鏈，辣椒富含辣椒素、辣椒堿、蛋白質、維生素以及礦物質等營養物質，在食用、醫療、工業上被廣泛應用，人們對辣椒的需求不斷提高，并對我國蔬菜周年均衡供應和豐富人們日常生活有很大作用[44-46]。但是，近年來極端天氣增多，逆境脅迫對辣椒造成的傷害增多，因此，培育出抗逆性強的辣椒品種對提高辣椒品質和產量非常重要。辣椒的育種目標已經由單一目標向多目標轉變，但是抗逆性、品質、口感等性狀屬于數量性狀，因其遺傳復雜，常規育種已經無法滿足育種需求，分子育種技術是一種新的育種途徑。植物基因工程是將外源基因導入受體細胞，使其與受體染色體整合，從而達到改變植物特性目標的一種方法，它可以很大程度上加速植物育種進程。因此，利用基因工程技術來增強植物抗性成為主要的研究趨勢，關于辣椒抗逆、抗病相關基因的研究也逐漸增多，基因功能分析和驗證已取得成功，但外源基因的表達必須要有啟動子的驅動，因為啟動子是能夠精確調控目的基因表達的“開關”。誘導型啟動子是在外界某種環境脅迫下才會驅動外源基因表達的一種啟動子，與組成型啟動子相比較，它不僅可以避免植物基因表達過量而造成植物能量損耗，同時又可以增強植物的抗逆性，具有重要的研究意義。啟動子通常與順式作用元件結合調控目的基因，一個基因可以包含多個順式作用元件，例如響應環境脅迫元件和抵御病原菌的元件等，誘導型啟動子會以特殊的結合方式來調控抗逆相關基因的表達，增強對逆境脅迫的抵抗力。目前，關于辣椒誘導型啟動子在逆境脅迫方面的功能研究以及網絡調控分析研究較少[47]。隨著分子生物技術的發展，辣椒抗逆基因的誘導型啟動子被分離和克隆，人們對這類啟動子的元件結構和種類有了初步的認識，也明確了一些辣椒誘導型啟動子的功能以及啟動子順式作用元件與轉錄因子的協同作用機制，它們結合并共同調控下游目的基因表達，增加抗逆基因表達量，提高抗逆性，為辣椒在抗逆遺傳改良中的應用奠定理論基礎。此外，隨著基因編輯技術的進步，以及對關鍵基因的啟動子研究更加深入，有研究者利用CRISPR/Cas9技術編輯基因的啟動子順式作用元件來調節基因的表達，并且取得成功。夏寒[48]利用CRISPR/Cas9技術對水稻基因RISBZ1和RPBF的啟動子區進行精細編輯來提高目的基因的表達水平，達到改良稻米品質以及獲得優良農藝性狀的目的。因此，今后可以利用該技術對辣椒啟動子區進行編輯，利用逆境脅迫誘導的關鍵元件，構建包含關鍵元件的人工啟動子，達到提高抗逆境脅迫關鍵基因表達量的目的，為辣椒優質育種提供新方法。總之，利用分子技術發掘辣椒新的誘導型啟動子、鑒定啟動子的順式作用元件并更好地將這類啟動子應用于生產中，將成為辣椒抗逆研究的主要趨勢，也為辣椒應答逆境脅迫提供了新的研究思路。

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