檢測H₂O₂熒光探針的研究進展

摘""""" 要：細胞內內源性的H₂O₂主要是由細胞內的有氧呼吸中通過線粒體電子傳遞鏈過程所產生的，它不僅在細胞內的氧化應激反應中扮演著細胞毒物的角色，而且還是重要的信使分子。熒光探針法具有靈敏度和選擇性高、響應快、操作簡單、生物相容性好、實時成像等優點，使用熒光探針檢測與人體許多疾病相關的內源性H₂O₂仍然是一項基本技術。綜述了小分子熒光探針檢測H₂O₂的研究進展。

關" 鍵" 詞：H₂O₂；線粒體；熒光探針

中圖分類號：O657.3"""""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號：1004-0935（2024）11-1758-03

H₂O₂是已知的活性氧和氮的前體物質，可導致氧化應激，是一系列物理化學過程以及各種疾?。ㄈ绨┌Y和神經退行性疾?。┌l生的關鍵因素。H₂O₂存在于生物系統中的大多數氧化過程中。內源性H₂O₂作為一種重要的活性氧（ROS），參與細胞免疫，重塑哺乳動物血管，并充當調節細胞生理活動的第二信使，包括細胞增殖、分化和遷移^[1-2]。然而，細胞中H₂O₂水平異常與許多疾病密切相關，例如糖尿病、癌癥、心血管疾病^[3]，大量的H₂O₂也可以分別通過髓過氧化物酶和芬頓反應轉化為更具毒性的次氯酸和羥基自由基，破壞細胞結構。

氧化應激是由細胞活性氧（ROS，即H₂O₂）的產生和解毒失衡引起的。H₂O₂是一系列生物過程的副產品。根據其產生的程度、時間和位置，它在活細胞內具有多種生理和病理作用。由于膜對H₂O₂具有高度滲透性，它可以在隔室之間擴散并介導細胞間的通信。因此，開發用于檢測和定量測定H₂O₂的方法對于監測該物種的體內生產和闡明其生物學功能具有重要意義。目前，檢測H₂O₂的方法有氧化還原滴定法、分光光度法、電化學方法、色譜法和光譜法^[4]。由于這些方法的樣品制備非常復雜，無法動態反映H₂O₂，因此無法有效檢測活細胞中的H₂O₂。熒光探針法具有靈敏度和選擇性高、響應快、操作簡單、生物相容性好、實時成像等優點^[5-8]，熒光成像技術表現出較高的時空分辨率和非侵入性檢測特性，對理解細胞中活性分子的復雜化學和生物過程更有幫助^[9-13]。熒光成像技術已廣泛應用于活體生物體的臨床檢測、分子生物學研究和小分子傳感。迄今為止，許多熒光探針已成功設計用于在生物體中檢測H₂O₂。這些熒光探針通常由香豆素、羅丹明、花青和bodipy等小分子發色團衍生物構成^[14-17]，在生物學研究中得到了顯著發展。

通過對近幾年有關H₂O₂熒光探針設計及合成文獻的查閱，綜述了基于不同熒光團檢測H₂O₂ 的熒光探針設計合成和生物應用。

1" 基于半菁類H₂O₂熒光探針

穩定的半菁熒光團不僅表現出近紅外熒光，而且具有近紅外吸收，可以最大限度地減少生物標本中的不良背景噪聲，半菁骨架賦予探針出色的線粒體靶向能力，從而能夠靈敏地檢測線粒體H₂O₂ ^[18]。基于上述考慮，WANG等^[19]將4-硝基-α-酮酰胺基團引入半菁中，設計出NIR-H₂O₂觸發熒光探針，在H₂O₂的存在下，Mito-H₂O₂反應迅速，水溶性好，熒光強度增強。此外，Mito-H₂O₂已成功應用于細胞和小鼠中外源性和內源性H₂O₂的成像，細胞毒性可忽略不計。

ZHANG等^[20]構建了一種用于檢測H₂O₂的新型近紅外熒光探針，并成功應用于體內內源性H₂O₂成像。值得注意的是，探針1是通過將4-（溴甲基）苯硼酸頻哪醇酯作為傳感單元連接到IR-780半菁骨架而設計的，該骨架具有出色的性能，如超過700 nm的NIR熒光發射。探針 1 對H₂O₂具有令人滿意的靈敏度，檢測限低至 0.14 μmol·l^-1（S/N= 3），這歸因于導致苯硼酸頻哪醇酯氧化從而釋放熒光團 2 的反應機制。此外，探針1對H₂O₂表現出優于其他物質的優異選擇性。利用這些特性，探針被證明是細胞滲透性的?；贜-乙酰半胱氨酸和魚藤酮的結果，探針1能夠清楚地看到活HepG2細胞和小鼠中內源性產生的H₂O₂。該探針作為一種可靠的化學工具，其優越的性能使其在探索H₂O₂在生物系統中發揮的作用具有巨大的潛在應用前景。

2" 基于萘酰亞胺類H₂O₂熒光探針

萘酰亞胺衍生物是對環境敏感的獨特熒光基團。這些化合物具有良好的光穩定性、較大的斯托克斯位移和高熒光量子產率。硒嗎啉可以以特定的REDOX方式與H₂O₂反應。2022年，MA等^[21]設計合成了一種新的水溶性H₂O₂熒光探針MNG。探針MNG主要由2部分組成，即具有PET機理的萘酰亞胺衍生物和作為識別基團的硒嗎啉。在PBS緩沖液（10 mmol·L^-1、pH=7.4、1%DMSO）中，探針上的硒嗎啉能夠定性和定量檢測H₂O₂。探針遵循硒嗎啉中的Se（Ⅱ）轉化為Se（Ⅳ）的機制，從而改變探針MNG的光譜。值得注意的是，MNG可以連續檢測H₂O₂和谷胱甘肽（GSH），因此它可以在體內實現氧化還原過程成像。此外，該課題通過模擬計算和質譜法驗證了高斯09程序中探針連續氧化還原響應的氧化還原過程。研究證明該探針具有很高的生物相容性。此外，它可以檢測MCF-7細胞和阿根廷血鰭中的H₂O₂。

2021年，ZHOU等^[22]利用芐基硼酸作為H₂O₂反應部分（一種眾所周知的H₂O₂反應性部分）構建了熒光探針NPT- H₂O₂用于H₂O₂的選擇性檢測。在不存在H₂O₂的情況下，它會發出明亮的藍光，但在存在H₂O₂時，它會發射明亮的黃光，從而實現H₂O₂的比率檢測。此外，由于吡啶基團是弱堿性的，它可以作為溶酶體靶向基團主動靶向溶酶體。相反，NPT-H₂O₂對H₂O₂表現出優異的傳感性能：它表現出對H₂O₂的熒光目標調節比率反應；一個很大的斯托克斯位移具有雙阱分辨通道（425、550 nm）；快速響應時間（lt;1 min）和對其他分析物的高選擇性。此外，對于在活細胞中和組織中的H₂O₂熒光成像，由于藍色通道和黃色通道之間有明顯的比率信號，從而獲得了大的信號背景比，證明了新構建的比率探針NPT-H₂O₂成功應用于生物系統中H₂O₂的檢測和成像。

3" 基于苯并咪唑類H₂O₂熒光探針

MA等^[23]設計并合成了基于ICT機制的熒光探針BBS，探針對H₂O₂的響應在464 nm 處顯示出增強的熒光信號，可用于檢測在生理環境中的H₂O₂。熒光強度與H₂O₂（0～40 μmol·L^-1）濃度呈良好的線性關系，檢測限為132 μmol·L^-1。在Gaussian 09程序上，利用紫外-可見光譜、滴定光譜和密度泛函理論對探針BBS的響應機理進行了驗證和分析。結果表明，BBS可用于活細胞的生物成像。MCF-7細胞成像研究表明，探針BBS具有良好的生物學適應性和通透性，可以高效、準確地分散在細胞質中，并且BBS可有效檢測內源性和外源性H₂O₂。

2022年，TANG等^[24]設計了一種新型的基于苯并噻唑的熒光化學傳感器（TZ-BO），該傳感器具有ESIPT發光機制，用于檢測H₂O₂作為典型的活性氧（ROS）。該探針分子TZ-BO中的硼酸懸鏈線既是ESIPT的阻斷基團，也是H₂O₂的反應基團。合成的探針TZ-BO具有斯托克斯位移大、靈敏度高、選擇性好、對H₂O₂反應速度快等優點。研究了該探針通過熒光信號檢測水介質中H₂O₂和細胞中外源H₂O₂的能力。實驗結果表明，TZ-BO探針在H₂O₂濃度為0～60 μmol·L^-1的良好線性范圍內（R²=0.994），能靈敏地檢測H₂O₂，檢測限為1.0×10^-6 mol·L^-1。最重要的是，具有低細胞毒性的探針TZ-BO可以有效地檢測HeLa細胞中的外源性H₂O₂。該探針為相關生理和病理研究中監測H₂O₂的真實濃度水平提供了一種很有前途的工具。

4" 結束語

總結了幾種基于不同熒光團的H₂O₂小分子熒光探針，目前識別H₂O₂的反應性有機小分子熒光探針的研究主要基于苯基硼酸酯的氧化機理、Baeyer-Villiger氧化重排反應和磺酸鹽裂解機理。有機小分子熒光探針檢測痕量H₂O₂主要應用于生物醫學領域。研究人員對染料基質結構和具有優異熒光性能的多個活性位點進行了修飾，以識別H₂O₂。反應機理影響熒光信號的變化，最終達到檢測的目的。開發具有雙重檢測功能的優秀熒光探針受到了廣泛關注。

總之，熒光探針不僅能用于檢測H₂O₂還能檢測其他的活性氧物種，如次氯酸^[25]，探索合成性能優異、成本低、靈敏度高、特異性好、反應時間短、檢測實時的多功能熒光探針是未來的研究目標。

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Research Progress of Fluorescence Probes for Detecting H₂O₂

WANG Chunmei， XIAO Bin， HAN Zhenghao

（Yunnan Normal University， Kunming Yunnan 650500， China）

Abstract：" Endogenous H₂O₂ in cells is mainly produced by the process of mitochondrial electron transfer chain during aerobic respiration in cells. It not only plays the role of cytotoxic agent in oxidative stress in cells， but also is an important messenger molecule.The fluorescence probe method has the advantages of high sensitivity and selectivity， fast response， simple operation， good biocompatibility， and real-time imaging. The use of fluorescence probes to detect endogenous H₂O₂ related to many human diseases is still a basic technology. In this article， the research progress of small molecule fluorescence probes for detecting H₂O₂ was reviewed.

Key words：" H₂O₂; Mitochondrion; Fluorescence probe