柳枝稷生長、生理和基因差異表達對供磷水平的響應

摘要： 【目的】探究柳枝稷 （Panicum virgatum L.） 在不同磷水平下的生理代謝及轉錄水平變化，以解析柳枝稷磷響應特征，挖掘磷高效利用基因?！痉椒ā恳浴甈athfinder’品種柳枝稷為供試材料，采用水培方法（Hoagland 營養液） 進行培養試驗。營養液設置4 個KH2PO4 供應水平：20、100、200、500 μmol/L （分別記為P20、P100、P200、P500）。在生長箱中培養45 天后，取樣測定柳枝稷生長和根系表型指標、抗逆酶活性，并進行葉片和根系轉錄組測序，分析不同磷水平下柳枝稷葉片和根系的響應差異。最后，從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選了部分基因進行qRT-PCR 分析，以證實轉錄組測序的準確性。【結果】隨著供磷水平的提高，葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD） 和過氧化氫酶（CAT） 活性呈先降低后增加的趨勢；根系總長度、根系總面積和根系活力呈先增加后減少的趨勢；葉片和根系中酸性磷酸酶活性和磷含量呈先增加后減少的趨勢。不同供磷濃度下，葉片和根系中各磷處理共同表達差異表達基因（DEGs） 分別有1091、1762 個。GO 富集注釋顯示，葉片中DEGs 富集在離子跨膜轉運、氧化還原酶上，根系則富集在特異DNA 序列結合、主動跨膜轉運和裂合酶上。兩器官共同富集的DEGs 主要定位于抗氧化酶、轉移酶、無機分子跨膜轉運蛋白上。KEGG 富集分析發現，柳枝稷葉片和根系中共有9 個共同代謝通路，其中氨基糖和核苷糖代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成、蔗糖和淀粉代謝通路DEGs 顯著富集，具體為：糖酵解和苯丙素生物合成途徑各有16 個DEGs，涉及磷吸收轉運基因共20 個。糖酵解途徑中關鍵酶基因 （AE、PGM、HK、PFK），苯丙素生物合成途徑中關鍵酶基因 （PAL、CCR、CAD、C4H、4CL） 和磷吸收轉運調控基因 （GPT2、PHT2;1、TPT、PPT1、PPT2、PPT3、PiC3、APC2）的差異化表達，引起柳枝稷葉片和根系對磷營養的代謝反應差異。【結論】適當提高供磷水平，可改善柳枝稷根系特征，降低葉片抗逆酶活性，提高葉片和根系中酸性磷酸酶活性，從而提高植株磷含量和干物質量。此外，糖酵解、苯丙素生物合成和磷吸收轉運相關的關鍵基因在葉片和根系中均表現出顯著差異表達。

關鍵詞： 供磷水平；柳枝稷；生理指標；轉錄組；糖酵解；苯丙素生物合成；磷吸收轉運

柳枝稷 （Panicum virgatum L.） 是一種多年生C4植物，原產于北美大草原，具有生長速度快、環境適應性強、生物質產量潛力高和投入需求相對較低的特點，被視為理想的生物能源作物和牧草作物[1?2]。磷是植物體內蛋白質、磷脂、脂肪酸、核苷酸和ATP 等重要有機物的組成元素，對于能量代謝、酶促反應、信號轉導等生命活動至關重要[3]。因此，研究柳枝稷在不同供磷水平下的生理和分子調控機制，不僅可以為能源物質生產和農業生產提供重要的資源，還有助于優化磷素的循環和利用。

在供磷水平不足條件下，植物會表現出一系列適應性變化，這些變化涉及表型、生理生化和分子層面，最終影響植株的生長。磷缺乏會抑制葉片代謝過程，導致活性氧 （ROS） 過度積累，從而損傷DNA、蛋白質和脂質[4]。為了抵抗ROS 的破壞，植物會激活抗氧化系統，包括超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD） 和過氧化氫酶 （CAT） 等酶類[5]。根系作為吸收磷的主要器官，在供磷不足的環境下會增加根毛長度，擴大根系與土壤的接觸面積，從而提高磷的吸收和利用效率[6?7]。除了通過分析葉片和根系的生長發育來研究植物對磷水平變化的適應性外，轉錄組學也是解析植物磷調控機制的有效方法。研究人員在擬南芥 （Arabidopsis thaliana）[8]、玉米（Zea mays）[9]、水稻 （Oryza sativa）[10]和小麥 （Triticumaestivum）[11]葉片和根系中發現了多個響應磷水平變化的差異表達基因 （DEGs），這些基因參與調控糖酵解途徑、離子轉運、活性氧清除、信號轉導、苯丙素生物合成等過程。其中，糖酵解是植物細胞能量代謝的核心途徑，可確保植物在低磷環境下仍能合成必要的能量物質[12]。苯丙素生物合成途徑產生的次生代謝產物，如黃酮類、花青素、單寧和木質素等，不僅提高植物的抗氧化能力，還參與病害防御和脅迫信號傳遞，有助于植物在不利環境條件下生存和發育[13]。同時，Yan 等[14]通過對水稻 （Oryza sativa） 在磷充足和磷缺乏條件下的第一葉片 （上部） 和第四葉片（下部） 進行轉錄組分析發現，OsPHO1;3 基因在植物正常生長的無機磷酸鹽 （Pi） 再動員過程中發揮著重要作用。

已有大量研究探討了植物適應磷營養水平的表型變化以及生化和分子反應機制，但這些研究的材料絕大多數為模式作物，研究結果對特定作物的適應性機制的代表性缺少驗證。本研究選擇高地型柳枝稷作為研究對象，探究不同供磷水平下葉片和根系的表型和生理調控效應；通過轉錄組測序技術，采用FPKM （Fragments Per Kilobases per Millionreads）方法和P-adjust≤0.05 且|log2FC|≥1 標準，鑒定葉片和根系的差異表達基因 （DEGs） ，通過GO （geneontology） 功能富集分析和KEGG （Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes） 代謝途徑分析，對低磷水平下的DEGs 進行功能注釋，以揭示葉片和根系在分子層面上的適應性差異，為進一步探索柳枝稷耐低磷候選基因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2022 年4—10 月在寧夏銀川市寧夏大學試驗研究基地大棚溫室開展。以Hoagland 營養液為基礎，參考Ding 等[ 1 5 ]設置4 個營養液KH2PO4 水平：20 μmol/L （P20）、100 μmol/L （P100）、200 μmol/L（P200） 和500 μmol/L （P500）。供試材料為高地型柳枝稷 （Panicum virgatum L.） Pathfinder 品種，由北京市農林科學院草業與環境發展研究中心提供。

試驗采用無土盆栽試驗，培養基質為石英砂、蛭石和珍珠巖混合物 （體積比1∶3∶1）。柳枝稷種子經3% H2O2 消毒后育苗，三葉期幼苗移栽至準備好的花盆中，每盆4 株，每個處理3 次重復，共12 盆，于光照箱中培養45 天，生長條件為光周期12 h 光照/12 h 黑暗，光照強度600 μmol/（m2 ·s），晝夜溫度（25±2）℃/（20±2）℃，相對濕度60%～70%。每間隔5天澆1.5 L 含不同KH2PO4 配比的Hoagland 培養液，澆培養液前用2.0 L 蒸餾水浸潤花盆中培養基質，以保證營養充足以及磷濃度相對穩定。于第46 天上午9：30，各處理挑選3 株長勢均勻的柳枝稷幼苗測定生理指標，再采集3 株幼苗分為葉片和根系樣品，用超純水清洗3 次，用濾紙吸干植株表面水分后置于液氮中冷凍，在?80℃ 下保存，用于后續轉錄組測序。

1.2 植株生理指標測定

幼苗干物質量采用烘干稱重法測定，將幼苗分為地上部和地下部置于烘箱中，70℃ 烘干至恒重。根系形態采用全自動根系掃描分析儀STD1600 （Epson，Japan） 進行測定，然后使用分析軟件Win-RHIZO（Regent instrument，Canada） 對根系形態進行分析。根系活力采用TTC 法測定[16]。葉片SOD、POD 和CAT 活性分別采用NBT 法、愈創木酚法和TBA 法測定[ 1 7 ]。葉片和根系酸性磷酸酶活性采用試劑盒（Solarbio，貨號BC2130） 測定。葉片和根系全磷含量采用釩鉬比色法測定[18]。

1.3 轉錄組測序及差異基因功能注釋分析

委托蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司進行轉錄組測序。采用天根多糖多酚試劑盒（QIAGEN，Germany） 從柳枝稷葉片和根系組織中提取RNA，隨后對RNA 樣品進行嚴格質控，主要利用Agilent2100 bioanalyzer 精確檢測RNA 完整性。文庫構建采用NEBNext? Ultra? Directional RNA Library Prep Kitfor Illumina?試劑盒。庫檢合格后，采用illuminaNovaSeq 6000 （illumina， USA） 進行雙端測序，獲得原始數據 （raw reads），通過質控軟件fastp （version0.19.7） 去除低質量的讀數，獲得高質量的序列數據（clean reads）。使用HISAT2 軟件將clean reads 與參考基因組 （Phytozome Panicum virgatum v4.1） 進行精確比對，獲取在參考基因組上的位置信息以及測序樣本特有的序列特征信息。計算每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的fragments （FPKM 值），分別使用差異基因Padj 數值BH 法和DESeq2 軟件計算P-adjust和Fold Change 值，以P-adjust≤0.05 且|log2FC|≥1為篩選標準，獲得不同處理下DEGs。然后對 DEGs進行GO 富集和 KEGG 富集功能注釋。

1.4 qRT-PCR 驗證

從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選6 個基因，采用qRT-PCR 方法對葉片和根系轉錄組測序結果進行驗證，利用Primer 3 plus 設計擴增引物（表1），以柳枝稷Actin 為內參基因。每個處理進行3 次生物學重復，采用2–ΔΔCt 方法計算差異基因相對表達量。

1.5 數據處理

利用Microsoft Excel 2019 和SPSS 20.0 進行數據處理和分析，采用單因素方差分析（ANOVA） 比較處理間差異，采用相關性分析和隨機森林模型分析植株磷變化的主控因子，采用Origin 2024 軟件以及R4.3.2 的ggplot2、pheatmap、rfPermute、psych、reshape2、patchwork、randomForest、rfUtilities、linkET、cols4all、dplyr 包等繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 供磷水平對柳枝稷生理特性的影響

供磷水平顯著影響柳枝稷葉片的抗氧化酶 （POD、SOD 和CAT） 活性 （圖1）。隨供磷水平的提高，葉片抗氧化酶活性均呈先減后增趨勢，POD、SOD 和CAT活性在P200 處理達到最低，較P20 處理分別顯著降低了54.15%、38.60% 和80.42%，P100 和P500 處理的葉片抗氧化酶活性差異不顯著?？偢L、總根面積和根系活力隨磷水平提高均呈先增加后降低的趨勢 （圖1），P200 處理下的總根長、總根面積和根系活力達到峰值，分別較P20 顯著提高了103.80%、82.55% 和160.21%。干物質量、磷含量和酸性磷酸酶活性同樣在P200 處理達到峰值（圖1），其幼苗地上部、地下部干物質量分別較P20 處理顯著增加77.73%、150.46%，葉片和根系酸性磷酸酶活性分別顯著增加42.77% 和278.49%，葉片和根系磷含量分別顯著增加23.81% 和15.56%。

進行柳枝稷磷含量與各指標之間的相關性分析及隨機森林模型分析，結果 （圖2） 顯示，葉片磷含量與葉片磷酸酶活性、總根面積極顯著正相關 （Plt;0.01），與葉片POD 活性顯著負相關 （Plt;0.05），地下部干物質量、地上部干物質量是顯著影響因素；根系磷含量與根系磷酸酶活性極顯著正相關 （Plt;0.01），與葉片POD 活性顯著負相關 （Plt;0.05），地下部干物質量、地上部干物質量和根系磷酸酶活性是顯著影響因素。綜上所述，供磷水平顯著影響柳枝稷的表型特征與生理特性，低磷脅迫顯著提高了柳枝稷葉片的抗氧化酶活性，且提高供磷水平有利于植株干物質積累，促進磷的吸收。

2.2 不同供磷水平下葉片和根系差異表達基因數目統計

和P20 處理比，隨磷水平升高葉片的差異表達基因 （上調、下調） 總數逐漸降低，而根系呈先增加后減少趨勢 （圖3）。葉片中，和P20 處理比，P100中上調基因3979 個，下調基因4334 個；P200 中上調基因2651 個，下調基因3393 個；P500 中上調基因4075 個，下調基因1669 個，檢測到各磷處理共同表達的差異表達基因有1091 個。根系中，和P20處理比，P100中上調基因1918 個，下調基因2157個；P200 中上調基因3418 個，下調基因4022 個；P500 中上調基因3484 個，下調基因3292 個，檢測到各磷處理共同表達的差異表達基因有1762 個。

2.3 葉片和根系差異表達基因GO 富集功能注釋

從生物合成過程看，和P20 處理比，P100 處理的葉片差異表達基因（DEGs） 顯著富集于陽離子運輸、有機磷代謝、碳水化合物衍生物代謝、小分子生物合成、核苷酸、有機酸生物合成、氧化應激、細胞脂質代謝和有機磷生物合成等過程 （圖4），根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、氧化應激、有機酸生物合成、細胞脂質代謝、脂質生物合成、單羧酸代謝、單羧酸生物合成、脂肪酸代謝和脂肪酸生物合成等過程。從功能看，葉片DEGs 顯著富集于特異DNA 序列結合、離子跨膜轉運蛋白活性、無機分子跨膜轉運蛋白活性、抗氧化活性、裂合酶活性、氧化還原酶活性、過氧化物酶、主動跨膜轉運蛋白活性和陽離子跨膜轉運蛋白活性等條目，根系DEGs 顯著富集于?；D移酶活性、非氨基?；D移酶活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、主動跨膜轉運蛋白活性和三磷酸腺苷酶活性等條目。

和P20 比，P200 處理的生物學過程中，葉片DEGs 顯著富集于氧化應激和碳水化合物代謝等過程，根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、有機酸生物合成、單羧酸代謝和氧化應激等過程 （圖5）。分子功能中，葉片DEGs 顯著富集于調節過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、序列特異性DNA 結合、?；D移酶活性、非氨基?；D移酶活性、絲氨酸水解酶活性和裂合酶活性等條目，根系DEGs 顯著富集于調節?；D移酶活性、非氨基酰基轉移酶活性、裂合酶活性、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性和主動跨膜轉運蛋白活性等條目。

和P20 處理比， P500 處理的生物學過程中，葉片DEGs 顯著富集于氧化應激等過程，根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、碳水化合物衍生物代謝、有機酸合成、有機磷合成、單羧酸代謝、輔因子代謝、細胞脂質代謝和核苷酸代謝等過程 （圖6）。分子功能中，葉片DEGs 顯著富集于特異DNA 序列結合、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、非氨基酰基轉移酶活性和主動跨膜轉運蛋白活性等條目，根系DEGs 主要富集于?；D移酶活性、非氨基酰基轉移酶活性、裂合酶活性、電子傳遞活性、三磷酸腺苷酶活性、抗氧化活性和主動跨膜轉運蛋白活性等條目。

2.4 葉片和根系差異基因 KEGG 富集分析

根據KEGG 數據庫進行通路富集分析，解析差異表達基因對代謝通路的影響，揭示柳枝稷緩解低磷脅迫的分子機制 （圖7）。環境信息處理相關通路中，葉片和根系共有通路為植物激素信號轉導和植物?病原互作通路，其中植物激素信號轉導通路在葉片中顯著表達。遺傳信息處理相關通路中，葉片和根系中共有通路為內質網蛋白質加工通路，葉片和根系中均未達到顯著水平。代謝相關通路中，葉片和根系富集到的共同通路有氨基糖和核苷糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成以及蔗糖和淀粉代謝通路，其中氨基糖和核苷糖代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成、蔗糖和淀粉代謝通路在葉片和根系中顯著表達，而脂肪酸代謝和谷胱甘肽代謝通路主要在根系中顯著表達。

2.5 糖酵解和苯丙素生物合成代謝通路相關基因的表達分析

糖酵解是代謝的重要途徑之一，在能量代謝和生物合成中起著舉足輕重的作用。不同供磷水平下糖酵解途徑的相關基因差異表達，本試驗中共篩選出16 個差異表達基因 （圖8a）。由β-葡萄糖切入生成α-葡萄糖進入糖酵解途徑的變旋酶 （AE） 基因在葉片中的表達量高于根系；由1-磷酸葡萄糖切入糖酵解途徑的磷酸葡萄糖變位酶 （PGM） 基因主要在根系中表達。己糖激酶 （HK） 基因和6-磷酸果糖激酶 （PFK）基因在葉片中的表達量高于根系，三磷酸異構酶 （TPI）基因在葉片中表達量較高，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD） 基因在根系中表達量高于葉片，磷酸甘油醛激酶 （PGK） 基因LOC120664222、LOC120698254 分別在葉片的P20 處理以及根系的P500 處理中表達量較高。最后，糖酵解產物丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶（PDC） 和乙酰輔酶A 合成酶 （ACS） 進入三羧酸循環。

葉片及根系的苯丙素生物合成途徑共涉及到16個差異表達基因 （圖8b）。催化苯丙氨酸生成對香豆酸的苯丙氨酸裂解酶 （PAL） 基因LOC120642393 主要在柳枝稷葉片中表達，并在P200 和P500 處理中表達量較高；LOC120709328 和LOC120683054 基因主要在根系中表達，同樣在P200 和P500 處理中表達量較高。反式肉桂酸-4-羧化酶 （C4H） 基因和香豆酸輔酶A 連接酶 （4CL） 基因在葉片和根系中表達量無明顯差異。參與對香豆酸合成木質素過程的肉桂酰輔酶A 還原酶 （CCR） 基因、肉桂醇脫氫酶 （CAD）基因、Class Ⅲ型植物過氧化物酶 （CIII Prxs） 基因主要在柳枝稷葉片中表達，并主要以P20 處理下的基因表達量較高。

2.6 磷吸收、轉運及其調控相關基因的差異表達

共有20 個磷吸收、轉運及調控基因在葉片和根系中差異表達 （圖9）。其中，編碼G6P/Pi 轉運蛋白的GPT2 基因，編碼無機Pi 轉運蛋白的PHT2;1 基因，編碼磷酸三糖/Pi 轉運蛋白的TPT 基因，編碼磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）/Pi 轉運蛋白的PPT1、PPT2以及PPT3 基因在葉片中的表達量高于根系，而編碼線粒體Pi 載體蛋白的PiC3 基因和編碼鈣依賴性線粒體ATP-鎂/Pi 載體蛋白的APC2 基因在根系中的表達量高于葉片。

2.7 qRT-PCR 驗證

為驗證柳枝稷幼苗葉片及根系轉錄組測序結果中基因表達量的準確性，從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選了6 個基因進行不同供磷水平處理下的qRT-PCR 驗證 （圖10）。將qRT-PCR 結果與轉錄組測序數據比對發現，6 個差異表達基因變化趨勢表現與轉錄組數據基本一致。

3 討論

3.1 供磷水平對柳枝稷葉片和根系生理特性的影響

供磷水平對植物的生長和生理過程有著顯著影響。在供磷不足條件下，植物可以通過激活SOD、POD 和CAT 等抗氧化酶，增強植物的抗氧化能力，從而減輕活性氧 （ROS） 的損害[19?20]。本試驗發現，柳枝稷的SOD、POD 和CAT 活性顯著受到供磷水平的影響，與Su 等[21]研究結果相似。隨供磷水平的提高，柳枝稷葉片抗氧化酶活性呈現先降低后增加的趨勢，P200 處理下的POD、SOD 和CAT 的活性達到最低，較P20 處理分別顯著降低了54.15%、38.60%和80.42%。值得注意的是，P500 處理提高了抗氧化酶活性。根據前人研究推測，過高的磷水平增加了葉片中的丙二醛 （MDA） 和過氧化氫 （H2O2） 含量，刺激SOD、POD 和CAT 活性提高，加快自由基清除進度，進而減少脅迫對植株的損害[22]。

調整根系形態是植物適應磷水平變化的關鍵策略之一，根系總長度和根系表面積反映了植物根系的吸收能力[23]。Wang 等[24]發現，施磷顯著降低了低密度種植下的柳枝稷根平均直徑，而對比根長無顯著影響，導致根系較細，根系組織密度較高。在本試驗中，同P20 處理相比，P200 處理下的總根長、總根面積和根系活力分別顯著提高了103.80%、82.55%和160.21%。隨著磷水平提高，柳枝稷葉片和根系的酸性磷酸酶活性、磷含量以及干物質量呈現先上升后下降的趨勢，這與根系總長度、根系總面積和根系活力的變化規律相吻合。隨機森林模型分析發現，植株干物質量和磷酸酶活性是影響葉片和根系磷含量的重要因素。同時發現，根系中的酸性磷酸酶活性高于葉片，而磷含量則表現出相反的趨勢。這反映了柳枝稷對磷的重新分配，提高磷水平促使根系中的酸性磷酸酶分解磷并將其輸送到柳枝稷地上部分，參與如光合作用、碳分配、能量代謝、信號轉導和酶調節等關鍵代謝途徑，從而影響了葉片酸性磷酸酶的活性和磷含量。然而，過高的供磷水平并沒有進一步提高柳枝稷對磷素的吸收和利用。在實際生產中，柳枝稷通常比其他植物更能適應低磷土壤環境[25]。根據形態和生境偏好，柳枝稷分為低地生態型和高地生態型，高地生態型在較干燥和寒冷的地區生長良好，并且我國北方地區土壤中有效磷含量通常較低[26]。因此，探究高地生態型柳枝稷品種的表型、生理生化對供磷水平的響應，對北方地區發展可再生飼料資源和生物質能源資源具有重要意義。

3.2 供磷水平對柳枝稷葉片和根系差異表達基因表達的影響

在柳枝稷適應不同磷供應水平的過程中，差異表達基因發揮了關鍵作用。與P20 相比，P100 及P200 處理中，葉片和根系的差異表達基因主要呈現下調趨勢，與Hou 等[27]和Shao 等[28]研究結果相似。而在P500 處理中，葉片和根系的差異表達基因則以上調為主，這表明過量的磷素可能會導致細胞內磷酸鹽水平失衡，影響細胞的能量代謝和信號傳導，柳枝稷通過上調一系列防御基因來減輕磷毒性的影響。通過GO 富集注釋分析得知，差異表達基因主要在分子功能上顯著富集。在葉片中，主要受影響的是離子跨膜轉運蛋白活性、無機分子跨膜轉運蛋白活性、酰基轉移酶活性、抗氧化活性、氧化還原酶活性、過氧化物酶活性等，這與葉片中SOD、POD和CAT 活性的變化相符合，表明柳枝稷可能通過調控抗氧化酶相關基因的表達來響應磷水平變化，與朱晨璐等[29]研究結果相似。在根系中，主要受影響的是?；D移酶活性、非氨基酰基轉移酶活性、抗氧化活性、特異DNA 序列結合、主動跨膜轉運蛋白活性、裂合酶活性、無機分子跨膜轉運蛋白活性等。KEGG 富集分析進一步揭示了柳枝稷葉片和根系中差異表達基因調控的生物代謝途徑，包括植物激素信號轉導、植物?病原互作、苯丙素生物合成、氨基糖和核苷糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解和糖異生、蔗糖和淀粉代謝通路等。通過這些調控機制，柳枝稷能夠在各種磷供應條件下維持正常的生長和發育。

3.3 糖酵解途徑相關基因在葉片及根系中差異表達

糖酵解代謝途徑是生物體碳代謝的中心途徑，連通了核酸代謝、蛋白質代謝、脂類代謝及次生代謝等多個代謝途徑[30?31]，磷水平變化直接影響糖酵解途徑，進而調控對磷的吸收和運輸[32?34]。本研究發現，有16 個基因在柳枝稷葉片和根系中表現出差異化表達。AE 基因在葉片中的表達量高于根系，而PGM 基因在根系中表達量更高。這一表達模式表明，在葉片中主要通過AE 催化β-葡萄糖生成α-葡萄糖；而在根系中主要通過PGM 催化1-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，從而參與糖酵解途徑，揭示了柳枝稷不同器官磷代謝反應和調控機制的差異。己糖激酶（HK） 和磷酸果糖激酶（PFK） 是糖酵解中的關鍵酶和限制酶，磷脅迫將抑制兩者基因的表達[35]。但本試驗研究發現，葉片內的HK 基因和PFK 基因的表達水平在不同磷水平下差異不明顯，后續糖酵解酶基因表達量總體高于根系。根據前人研究推測，供磷不足將降低HK 和PFK 代謝底物 （ATP） 的含量，而焦磷酸二酯 （PPi） 可以作為一種ATP 的替代能量供體，參與UDP-葡萄糖合成6-磷酸果糖的過程[36]。因此，為了適應磷水平變化，葉片提高了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因 （UGP） 和磷酸葡萄糖異構酶基因 （GPI） 的表達。在PPi 作用下，UGP 和GPI 將UDP-葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，從而維持柳枝稷葉片中糖酵解代謝途徑的進行。

3.4 苯丙素生物合成途徑相關基因在葉片及根系中差異表達

在植物體內，苯丙氨酸 （或酪氨酸） 經過脫氨基、羥基化、甲基化、氧化還原反應和聚合生成H木質素、G 木質素和S 木質素等木質素單體[37]，苯丙氨酸解氨酶（PAL） 和4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）是整個代謝途徑的關鍵酶和限速酶，PAL 在苯丙素生物合成途徑的前端催化苯丙氨酸轉化為肉桂酸，4CL 控制苯丙氨酸走向不同的代謝途徑[ 3 8 ]。另外，C4H、CCR、CAD 等基因在木質素的合成過程中也起著極為重要的調控作用，有的還參與緩解相關生物或非生物脅迫[ 3 9 ? 4 0 ]。本試驗發現16 個關鍵酶基因在柳枝稷葉片和根系的苯丙素生物合成途徑中呈現差異化表達。其中，PAL 注釋到3 個基因，LOC120642393 基因主要在柳枝稷葉片中表達，而LOC120709328 和LOC120683054 基因主要在根系中表達。CCR 和CAD 基因在葉片P20 處理中表達量較高，這與低磷脅迫下葉片抗氧化酶活性顯著提高相符合。C4H 基因和4CL 基因在葉片和根系中的表達量沒有明顯差異，表明其在柳枝稷整個植物體中都是苯丙素生物合成的重要調控點。煙草 （Tobacco）[41]、百日草 （Zinnia）[42]等植物中證實了Class Ⅲ型植物過氧化物酶 （CIII Prxs） 參與木質素合成。在CIII Prxs催化下，各種木質素單體被氧化形成木質素聚合物而使細胞壁硬化，或者通過其生長素氧化酶活性控制細胞伸長[43?44]。Vance 等[45]認為，磷脅迫將促進防御代謝物的生物合成，如細胞壁木質化的增加。本研究中，CIII Prxs 基因在葉片中的表達量高于根系，同時發現供磷水平會降低CIII Prxs 的表達量，這表明磷的供應水平可能通過調節關鍵酶基因的表達來影響柳枝稷的木質素合成和細胞壁結構。

3.5 磷吸收轉運及其調控相關基因在葉片及根系中差異表達

在高等植物中，磷以無機磷酸鹽 （Pi，即PO43?、HPO42 ?和H2PO4? ） 的形式從土壤中通過一個依賴于H+的共轉運過程獲得[ 4 6 ]。相關研究表明，PHT1～PHT4 基因編碼磷酸鹽轉運體，使磷酸鹽可以在植物組織和細胞器內進行轉運[47]；TPT 基因編碼磷酸三糖/Pi 轉運蛋白，催化TP、3-PGA 和Pi 在葉綠體包膜上進行嚴格的1∶1 交換，在光合作用中發揮著至關重要的作用[ 4 8 ? 4 9 ]；PPT 基因編碼PEP/Pi 轉運蛋白，可以將PEP 輸入質體[50]；GPT2 基因編碼質體G6P/Pi 轉運體，可以通過葉綠體和細胞質之間的G6P 分配信號以及光合作用相關蛋白質組的重置等機制，使光合作用適應輻照度增加[51?52]。據前人研究結果，PHT2;1 活性影響植物體內的Pi 分配，并調節Pi 饑餓反應，包括Pi 饑餓反應基因的表達和Pi在葉片內的轉運[53]。提高磷酸鹽或外源糖供應會上調GPT2 表達水平并促進淀粉積累[54?55]。本研究中，P20 處理降低了GPT2、PHT2;1、TPT、PPT1、PPT2和PPT3 基因在葉片的中表達，在P100～P500 處理下基因表達量遠高于根系。PiC 作為一種膜嵌入蛋白，主要負責將Pi 從細胞質轉運到線粒體基質中，以支持ATP 合成過程中的Pi 需求[56]。在本試驗中，PiC3 和APC2 基因在根系中的表達量則高于葉片。以上表明，葉片和根系在磷的吸收和轉運機制上存在明顯的組織特異性，通過調控不同基因在葉片和根系中的差異表達，進而調節Pi 轉運系統，以應對磷脅迫，保障柳枝稷幼苗在低磷環境下的磷吸收和轉運。

4 結論

磷水平對柳枝稷根系表型和根系活力具有顯著影響。供磷不足條件下，柳枝稷可通過激活葉片SOD、POD 和CAT 活性，增強其抗氧化能力。適宜磷水平可提高柳枝稷葉片和根系的酸性磷酸酶活性、磷含量。供磷水平變化會引起糖酵解途徑、苯丙素生物合成途徑和磷吸收轉運相關基因（PGM、HK、PFK、PAL、4CL、TPT、PPT 基因家族等） 在葉片和根系中的差異表達。

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