伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的殘留和消除規律

摘要：為研究伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的殘留消除規律，500 μg/kg·bw，單次給藥，由背中線澆注伊維菌素澆潑溶液，分別于用藥后7、14、28、48 d用高效液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD）檢測牛肌肉、肝臟、腎臟、皮下脂肪以及給藥部位肌肉中伊維菌素的殘留量。HPLC-FLD方法的檢測限（LOD）為2 μg/kg，定量限（LOQ）為5 μg/kg。結果表明，以500 μg/kg背部澆淋后，伊維菌素在牛體內代謝緩慢，在肝臟組織中的殘留量遠高于其他組織。伊維菌素在組織中的殘留量：肝臟＞脂肪＞給藥部位＞腎臟＞肌肉。肝臟在給藥后7 d達到最大濃度306 μg/kg，除肝臟外，肌肉、腎臟、皮脂以及給藥部位肌肉均在給藥后28 d，組織濃度低于最高殘留限量；肝臟在第48天時，其濃度才低于最高殘留限量；根據WT1.4軟件分析，參照農業部235公告和歐盟關于IVM在牛組織中規定的MRL，測得各組織的休藥期分別為：肌肉21.2 d、肝臟42.1 d、腎臟21.5 d、皮脂39.9 d、給藥部位肌肉31 d。因此伊維菌素澆潑溶液的休藥期為43 d。

關鍵詞：伊維菌素澆潑溶液；透皮；高效液相色譜；熒光檢測器；殘留消除規律；休藥期

伊維菌素（ivermectin，IVM）是目前公認的具有廣譜、高效、低毒、低殘留的大環內酯類抗寄生蟲藥物，對家畜的胃腸道線蟲、外寄生蟲（蜱、虱、螨、蠅蛆等）有特殊的療效，在臨床上被廣泛使用。已有的研究表明，不同畜種、不同藥物劑型、不同給藥途徑使IVM的藥代動力學有明顯差異。IVM通過皮膚涂抹的滲透性極低，滲透是涂抹量的0.17%～0.55%[1]；通過口服或皮下注射，效果顯著，機體吸收很快，血液濃度在給藥后2 d基本達到峰值。給藥后7 d藥物清除率達到90%以上，給藥后28 d藥物在體內基本代謝完畢。IVM在犬體內排泄較快（半衰期為1.6～1.8 d）。牛、羊體內半衰期約為2.7 d；豬的半衰期長達4 d[2-3]。吸收后IVM廣泛分布于全身組織，其中肝臟濃度最高，其次為脂肪，最低為腦[4]。國內外許多文獻報道了口服、注射給藥在牛羊、豬組織中的殘留消除規律，對于伊維菌素澆潑透皮劑在牛組織中的殘留消除規律未見系統的報道。本研究采用“農業部1025號公告-5-2008高效液相色譜法”對牛組織中伊維菌素進行檢測[5]，得出肉牛背部澆潑伊維菌素透皮溶液后組織中伊維菌素濃度的變化規律，為伊維菌素澆潑溶液的臨床使用和食品藥物殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 設備與儀器

超高液相色譜儀（ACQUITY UPLC，配備二元并聯泵、色譜工作站、熒光檢測器、自動進樣器等，美國WATERS公司）；Avanti J-26高速冷凍離心機（美國BECKMAN COULTER公司）； XW-80A旋渦混合儀（上海青浦滬西儀器廠）； KS501digital軌道式搖床（德國IKA公司）；高速組織勻漿器；氮氣吹干濃縮儀；電子分析天平等。

1.2 試劑藥品與試劑

供試藥品：0.5%伊維菌素澆潑溶液，以伊維菌素（H２B1a+H２B1b）計算，批號201205001，內蒙古金河動物藥業有限公司，試驗前測定藥物的有效含量（以伊維菌素計）為0.5%。

伊維菌素對照品：伊維菌素（H２B1a+H２B1b），純度91.2%，批號K0191106，中國獸醫藥品監察所。

甲醇、乙腈為色譜純。三乙胺、冰醋酸、異辛烷等均為分析純。水為符合GB/T 6682規定的二級水。

1.3 試驗動物

選擇18頭健康的黃牛，公母各半，按常規飼養，自由飲水和采食，飼料為全價日糧，不含任何抗菌藥物。臨床觀察兩周表現健康。

1.4 給藥

將牛分為給藥組（16頭）與空白對照組（2頭），平均體重為411.3 kg（411.3±24.6 kg），試驗組隨機分為4組進行殘留消除試驗，每組4頭，給藥組單次背部澆淋伊維菌素澆潑溶液，給藥劑量為500 μg/kg·bw。空白組澆注生理鹽水，給藥方式同給藥組。

1.5 樣品采集

給藥組在給藥后第7、14、28、48天的時間點各宰殺一組牛，分別采集以下組織及部位：①肌肉 腿部肌肉，500 g；②肝臟 最大葉部位，500 g；③腎臟 雙腎縱切，各取一半；④給藥部位 以背中線為中心劃10×10cm方形，采10 cm×10 cm×6 cm（深）的肌肉樣本；⑤脂肪 皮下脂肪200 g。各樣品采集后立即做好標記、包裝，保存于-20 ℃冰箱，待測。

1.6 組織樣品中伊維菌素的檢測方法

1）樣品前處理。①試料制備：取出冷凍試料50 g，切碎、高速均質，勻漿備用。每種組織進行平行雙樣本測定。②處理：提取：稱取試樣2.5 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加8 mL乙腈，旋渦0.5 min，2 000 r/min離心2 min，取上清液。殘渣用8 mL乙腈重復提取一次，合并兩次提取液。凈化：取堿性氧化鋁柱，加2 g無水硫酸鈉。加10 mL乙腈預洗，將上清液過柱，收集濾液于雞心瓶中。接著用5 mL乙腈洗脫，收集于同一雞心瓶中，50 ℃下減壓濃縮至干。用0.5 mL乙腈溶解殘余物，旋渦0.5 min，使充分溶解，備用。取C18固相萃取柱，用5 mL乙腈預洗，將備用液過柱，收集流出液于5 mL刻度試管內，繼續用3 mL乙腈洗脫，收集于同一雞心瓶中，50 ℃下氮氣吹干，備用。熒光衍生化：加入衍生化試劑A液100 μL，旋渦0.5 min，再加衍生化試劑B液100 μL，旋渦0.5 min，密閉。于96 ℃衍生化反應100 min，加50 μL乙腈，過0.45 μm濾膜，進行HPLC熒光檢測。

2）各種溶液配制。伊維菌素標準儲備液：準確稱取的對照品0.0532 g于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，搖勻，即成500 μg/mL伊維菌素標準液，4 ℃冰箱保存，臨用前用流動相配成系列標準工作液。衍生化試劑：A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v），現用現配。B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v），現用現配。

1.7 液相色譜條件

色譜柱：Thermo CigODS（4.6 mm×250 mm，5μm），美國Thermo公司；流動相：甲醇：水（98：2，v/v）；流速為1 mL/min，進樣量為20 μL；熒光檢測器；激發波長為365 nm，發射波長475 nm；柱溫：30 ℃。

1.8 檢測限與定量限

按信噪比S/N≥3時為檢測限（LOD），S/N≥10時為定量限（LOQ）。所得檢測限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg，表明方法的靈敏度高，可滿足殘留檢測的要求。

1.9 標準曲線與線性范圍

在6個50 mL進口離心管中分別稱取1 g空白組織，依次加入工作液，制成含伊維菌素藥物濃度分別如下：5、10、20、50、100、200 μg/kg的組織樣品。按照組織樣品處理方法處理后，進樣分析。以測得的伊維菌素的峰面積（A）與藥物濃度（C）作線性回歸，求得標準曲線的回歸方程和相關系數。結果見表1。

1.10 回收率和變異系數測定

在1 g空白組織中加入伊維菌素標準工作液，制成含藥濃度為5、10、100 μg/g的腎臟、肝臟、肌肉、脂肪組織樣品。按照樣品處理方法處理后，進樣分析，每批次每個濃度設5個平行樣品，共3個批次。以其藥物峰面積與外標峰面積之比，求得低、中、高3種濃度的回收率，計算批內，批間變異系數（CV，%）。

2 結果與分析

2.1 伊維菌素澆潑溶液在牛組織殘留消除

依據上述建立的方法，對試驗動物在第7、14、28、48天時間點采集的肌肉、肝臟、腎臟、脂肪、給藥部位肌肉5種組織進行了雙樣本檢測，各組織中伊維菌素的測定結果見表2。

2.2 伊維菌素澆潑溶液在牛組織中的休藥期

農業部235公告關于伊維菌素在牛各個組織中的最高殘留限量（MRL）規定如下：肌肉為10 μg/kg，脂肪為40 μg/kg，肝為100 μg/kg。腎臟MRL沒有具體規定，參照歐盟關于伊維菌素在鹿體內的最高殘留限量，暫定為20 μg/kg[6-7]。根據計算機軟件WT1.4計算，各種組織的休藥期（95%置信限）見圖1～圖5。

3 討論

3.1 伊維菌素在牛組織中的分布

從檢測的5種組織所得到的最高濃度點為：肝臟306 μg/kg（7 d）、皮脂194 μg/kg（7 d）、給藥部位肌肉115 μg/kg（7 d）、腎臟89.3 μg/kg（7 d）、肌肉68.8 μg/kg（7 d）。從上述結果來看伊維菌素在動物組織中以肝臟的濃度最高，殘留時間最長，其次是皮脂、給藥部位肌肉、腎臟、肌肉。

試驗結果表明：以500 μg/kg背部澆淋后，伊維菌素在牛體內代謝緩慢，肝臟在給藥后7 d達到最大濃度306 μg/kg，除肝臟外，肌肉、腎臟、皮脂以及給藥部位肌肉均在給藥后28 d，組織濃度低于最高殘留限量；肝臟在第48天時，其濃度才低于最高殘留限量。

3.2 關于伊維菌素澆潑溶液在牛體內休藥期的評價

農業部235公告關于伊維菌素在牛各個組織中的最高殘留限量（MRL）規定如下：肌肉為10 μg/kg，脂肪為40 μg/kg，肝為100 μg/kg；腎臟MRL沒有具體規定，參照歐盟關于伊維菌素在鹿體內的MRL，暫定為20 μg/kg[4]。

根據WT1.4軟件，參照農業部235公告和歐盟關于伊維菌素在牛組織中規定的MRL，測得伊維菌素澆潑溶液以500 μg/kg背部澆淋給藥，給藥1次，各組織的休藥期分別為：肌肉21.2 d、肝臟42.1 d、腎臟21.5 d、皮脂39.9 d、給藥部位肌肉31 d" （表3）。

4 結論

根據表3結果，內蒙古金河動物藥業有限公司研制的伊維菌素澆潑溶液（0.5%）的休藥期為43 d。

參考文獻：

[1] 徐楷，王巧玲.獸用伊維菌素研究進展[J].國外畜牧學（豬與禽），2011，31（1）：85-86.

[2] 孫慶申，趙凱.伊維菌素的研究進展[J].畜牧獸醫科技信息，2008（4）：7-9.

[3] 何繼紅.阿維菌素類藥物多殘留分析方法的研究[D].中國農業大學，2005.

[4] LEE CHIU S H， TAUB R， SESTOKAS E， et al. Comparative in Vivoand in Vitro Metabolism of Ivermectin in Steers， Sheep， Swine， and Rat[J]. Drug metabolism reviews， 1987， 18（2-3）：289-302.

[5] 農業部1025號公告-5-2008，動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測 酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法[S].

[6] 農業部發布動物性食品中獸藥最高殘留限量（續）[J].中國獸藥雜志，2003 （3）：5-11.

[7] COMMISSION REGULATION （EU） No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin[EB/OL]. https：//eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do？uri=CONSLEG：2010R0037：

20110714：EN：PDF，2010-01-20/2022-05-09.

收稿日期：2023-08-30

作者簡介：徐先達（1993— ），內蒙古人，碩士，獸醫師，從事獸藥技術服務工作。172467548@qq.com。