加州鱸維氏氣單胞菌拮抗菌的篩選

基金項目 湖北省現代農業產業技術體系項目[（2023）-2]。

作者簡介 安相茹（1998—），女，河南洛陽人，碩士研究生，從事漁業發展研究。

通信作者 蘇應兵（1978—），男，湖北荊州人，碩士，副教授，從事水產動物病害防治研究。

收稿日期 2024-03-13

摘要 為篩選出對維氏氣單胞菌（Aeromonas Veronii）有拮抗效果的最優菌株，本試驗從湖北荊州太湖加州鱸池塘底泥中分離獲得一株細菌C2-1，對其進行全基因組測序，并研究其生防作用機制。結果表明，細菌C2-1為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），具有廣譜抑菌性，對希瓦氏菌（Shiva's bacteria）、溶血鏈球菌（Streptococcus hemolysis）等多種水產病原菌的抑菌直徑達18.57～25.28 mm。菌株C2-1具有較高的酸堿穩定性且對溫度適應范圍較為廣泛。掃描電子顯微鏡鏡觀察發現細菌C2-1的發酵產物對維氏氣單胞菌具有破壞效果。液質聯用（LC-MS）分析該細菌包含多種不同的脂肽類活性物質，如伊枯草菌素等。研究發現，貝萊斯芽孢桿菌C2-1是防治維氏氣單胞菌的潛力菌株，對維氏氣單胞菌具有較好的抑制作用，且應用前景良好。

關鍵詞 維氏氣單胞菌；貝萊斯芽孢桿菌；加州鱸；生物防治

中圖分類號 S947.9"" 文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）13-0042-07

Screening of antagonistic bacteria against Aeromonas veronii in Micropterus salmoides

AN Xiangru1""" SU Yingbing1""" ZHOU Yi2

（1College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434000， China;

2College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434000， China）

Abstract In order to select the best antagonistic strain against Aeromonas Veronii， a strain of bacteria C2-1 was isolated from the bottom mud of perch ponds in Tai Lake， Jingzhou， and whole genome sequencing， the biological control mechanism was studied. The results showed that the bacterial C2-1 was found to be Bacillus velezensis， with broad-spectrum antibacterial activity. Its antibacterial diameter against various aquatic pathogens such as Shiva's bacteria and Streptococcus hemolysis ranged from 18.57 to 25.28 mm. The antibacterial substances of strain C2-1 had high acid-base stability and a wide range of temperature adaptation. Electron microscopy revealed that the fermentation products of bacterial C2-1 had a destructive effect on Aeromonas veronii. LC-MS analysis showed that the bacterium contains various lipopeptide active substances， such as imidacloprid. It was found that Bacillus velezensis C2-1 was a potential strain for the control of Aeromonas veronii and had good inhibition effect on Aeromonas veronii.

Keywords Aeromonas veronii; Bacillus velezensis; Micropterus salmoides; biological control

水產養殖產量每年穩步增長，捕撈生產量保持相對穩定[1]，并能在有限的空間內生產大量產品，克服了捕獲野生物種的相關限制[2]。水產養殖業作為農業生產的重要組成部分[3-4]，在一定程度上滿足了人們對海產品可食用蛋白質和營養素日益增長的需求。海洋水產養殖在經濟發展中起著至關重要的作用[5]。水產養殖是較大的動物生產部門之一，消費魚類中超過50%的魚來自水產養殖[6]。為了滿足日益增長的消費需求，水產養殖逐漸向集約化養殖轉變，這在一定程度上可能增加漁業傳染病傳播風險[7]。部分水產養殖中可能存在過量使用抗生素防治水產疾病的現象，如在水產養殖環境和產品中能檢測到部分抗藥性基因（ARGs）和抗藥性細菌[8-9]，抗生素的使用對水生微生物種群產生較大選擇壓力[10]，可能對動物和人類健康以及生態安全造成風險[11]。

加州鱸（Micropterus salmoides）是重要的食用魚類之一，其肉味鮮美，肉質細嫩，營養價值高。為滿足市場需求，加州鱸的人工養殖規模不斷擴大，規?；B殖在一定程度上增加了加州鱸細菌性疾病的發生概率。常見病原體有維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophial）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等。為了控制水產養殖生產所面臨的疾病，采取了各種措施。其中，芽孢桿菌是應用較廣泛的益生菌之一，被認為是部分魚類腸道微生物區系中的天然成員。芽孢桿菌廣泛存在于陸地環境、水生環境和大氣環境中。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是革蘭氏陽性好氧菌，菌體呈桿狀，能形成芽孢，廣泛分布于自然界的水體、泥土和動物腸道[12]；與普通生防芽孢桿菌相似，貝萊斯芽孢桿菌具有溶菌、拮抗和誘導植物系統抗性等作用[13]。張德鋒等[12]、Zhang等[14]認為，通過拮抗、競爭作用和誘導系統耐藥來抑制病原菌，其中拮抗活性主要依賴于其產生的各種次生代謝物[15]，包括脂肽、聚酮和細菌素等，對水生動物疾病表現出良好的生物防治效果。貝萊斯芽孢桿菌表現出廣譜抗菌活性，是各種動植物疾病的重要生防劑[16]。例如，貝萊斯芽孢桿菌對馬鈴薯赤霉病[17]、蓮根腐病[18]和小麥赤霉病[19]等植物病害，以及對嗜水氣單胞菌引起的鯽魚[20]、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）引起的尼羅羅非魚[21]、哈維弧菌（Vibrio harveyi）引起的雜交石斑魚[22]和嗜水氣單胞菌引起的草魚[23]等感染，均有明顯生防效果。其中，貝萊斯芽孢桿菌FZB42菌株主要用于防治根際細菌和促進植物生長[16]。

本試驗從太湖鱸養殖池塘底泥中共分離出8株生防菌分離物，篩選出對維氏氣單胞菌表現抑菌活性的菌株C2-1，對其進行全基因組測序，并研究其生防作用機制，為防治水生動物疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株" 病原菌來自長江大學動物科學學院已分離鑒定的維氏氣單胞菌（登錄號QQ781151），拮抗菌從湖北荊州太湖加州鱸養殖池塘底泥中分離。

1.1.2 培養基" 采用LB液體培養基和LB固體培養基。

1.1.3 主要試劑及儀器" PCR產物純化試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自深圳華大基因股份有限公司；掃描電子顯微鏡（VEGA3 SBU），超高效液相色譜儀購自Eppendorf AG；電泳儀購自北京市六一儀器廠生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌的初篩和復篩" 采用打孔法進行初篩，將生長至對數期的維氏氣單胞菌無菌濾液80 μL涂于LB固體培養基上，干燥后用打孔器在同一平皿上等距離打4個孔，吸取從底泥中分離的菌株菌液50 μL加入孔中，28 ℃恒溫培養24 h，記錄抑菌直徑，同時對有抑菌圈的分離菌株采用初篩的方法進行復篩；拮抗菌的抑菌譜，同樣以初篩的方法處理所有的病原菌。

1.2.2 拮抗菌株的形態觀察和分子鑒定" （1）形態觀察。將菌株C2-1劃線于LB瓊脂平板，28 ℃恒溫培養48 h，觀察其形態、濕潤度等，并挑取單菌落，經革蘭氏染色后使用顯微鏡觀察菌體。（2）分子鑒定。按照Omega細菌基因組DNA提取試劑盒的步驟操作。將獲得的拮抗菌DNA作為模板，采用27F和1492R引物進行擴增，擴增后的PCR產物測序后使用BLAST進行比對分析，利用MEGAX構建發育樹。

1.2.3 拮抗菌株對病原菌菌絲生長的抑制作用觀察" 通過掃描電子顯微鏡觀察細菌的形態。樣品制備方法參考李川北等[24]的方法。

1.2.4 拮抗菌發酵液耐酸堿性及最適溫度測定" （1）菌株C2-1耐酸堿性測定。將拮抗菌在28 °C、130 r/min下培養2 d，收集上清液并于4 °C、10 000 r/min下離心20 min。離心后取上清液，經微孔過濾器（0.22 μm孔徑）過濾獲得C2-1無菌濾液，取無菌濾液按不同pH梯度處理1 h后，調整pH值為7.0，測定發酵上清液的拮抗活性。

（2）菌株C2-1最適溫度測定。將拮抗菌按（1）中方法處理后，取無菌濾液分別于30、40、60、80、90和100 ℃恒溫水浴1 h后，測定無菌濾液的拮抗活性。

1.2.5 菌株C2-1抑菌物質提取及抑菌活性測定" 抑菌物質提取和色譜分析參考鄭通文[15]的方法。

1.2.6 拮抗菌株對加州鱸的保護性評價" 拮抗菌株C2-1和病原菌維氏氣單胞菌分別設置106、107和108 CFU/mL濃度梯度。分為3個處理組，1個空白對照組。第一組腹腔注射100 μL（106、107和108 CFU/mL拮抗菌菌液）+100 μL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）的混合液；第二組注射100 μL（106、107和108 CFU/mL 拮抗菌菌液）+100 μL（LB）；第三組注射100 μL（106、107和108 CFU/mL病原菌菌液）+100 μL（LB），連續7 d觀察并記錄加州鱸的狀態。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過對池塘底泥中的多株細菌進行初次篩選和再次篩選，發現一株對維氏氣單胞菌具有明顯抑菌效果的菌株，命名為C2-1。圖1為C2-1株菌的初篩和復篩結果，其抑菌直徑分別為（24.32±0.40） mm和（25.28±0.56） mm。

2.2 菌株C2-1的抑菌譜

菌株C2-1對多種病原菌均有拮抗效果，C2-1對維氏氣單胞菌抑菌圈直徑達（25.28±0.56）mm，對愛德華氏菌（Edwardsiella）抑菌圈直徑達（20.11±0.17）mm，對希瓦氏菌（Shiva's bacteria）抑菌圈直徑達（21.53±0.21）mm，對溶血鏈球菌（Streptococcus hemolysis）抑菌圈直徑達（23.74±0.26）mm，對嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑達（16.02±0.12）mm，對金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抑菌圈直徑達（18.57±0.15）mm。抑菌效果如表1所示。

2.3 菌株C2-1的形態觀察和分子鑒定

2.3.1 形態鑒定" C2-1菌株在LB培養基上的菌落較濕潤，呈不透明且具有黏性（圖2A），其形狀接近圓形，表面粗糙并帶有凸起。顯微鏡下觀察菌株呈短桿狀（圖2B）。通過革蘭氏染色觀察，確認該菌株為革蘭氏陽性菌。

2.3.2 分子鑒定" 將菌株C2-1測序序列提交至NCBI數據庫進行比對，發現菌株C2-1與貝萊斯芽孢桿菌相似性達到98.88%。通過構建發育樹，發現C2-1與貝萊斯芽孢桿菌歸為一支（圖3），故將C2-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），登錄號為OR574410。

2.4 菌株C2-1對維氏氣單胞菌絲生長抑制作用

通過掃描電鏡觀察菌絲特征（圖4）發現，對照組菌絲體飽滿，而菌株C2-1處理組菌絲體側端呈現球狀褶皺，處理后菌絲扭曲且凹陷。

2.5 菌株C2-1耐酸堿性和最適溫度測定

溫度升高時，菌株C2-1發酵上清液的抑菌活性出現明顯變化。在60 ℃以下，抑菌活性保持較高水平，高于60 ℃時，抑菌活性有所下降。C2-1在pH中性情況下抑菌效果最佳，隨pH值的升高或降低其抑菌活性均下降。測定結果如表2所示。

2.6 菌株C2-1抑菌物質的提取

液相色譜-質譜（LC-MS）分析結果顯示，C2-1的抑菌物質中包含多種有機化合物。匹配度高的有表面活性素、伊枯草菌素、草菌素、桿菌霉素、多黏菌素B1和多黏菌素B2等。由表3可知，表面活性素的質荷比為1"036.674"3，其出峰時間位于26.93～26.95"min。伊枯草菌素的分子質量的質荷比為1"044.536"0，出峰時間位于21.80～21.81"min。草菌素的出峰時間在21.82～21.83"min，分子質荷比為1"199.641"9；桿菌霉素的出峰時間在30.33～30.34"min，分子質荷比為1"032.524"8；多黏菌素B1的出峰時間在28.60～28.76"min，分子質荷比為1"203.757"2；多黏菌素B2的出峰時間在21.77～21.81"min，分子質荷比為1"189.741"6。

2.7 菌株C2-1對加州鱸的保護性評價

2.7.1 菌株C2-1的拮抗性檢驗" 腹腔注入100 μL（106、107和108 CFU/mL 的拮抗菌菌液）+100 μL（106、107和108 CFU/mL的維氏氣單胞菌液）的混合液，加州鱸死亡率分別為10％、20％和30%。注射100 μL（106、107和108 CFU/mL的拮抗菌菌液）+100 μL（LB）死亡率均為0。注射100 μL（106、107和108 CFU/mL的維氏氣單胞菌液）+100"μL（LB），死亡率均為100%。由表4可知，菌株C2-1對加州鱸有較好的保護作用。

2.7.2 病原菌鑒定" 解剖僅注射維氏氣單胞菌死亡的魚，從其肝臟、鰓等部位分離并純化得到的病原菌，提取病原菌DNA并測序，鑒定方法同1.2.2分子鑒定。鑒定結果顯示，病原菌與注射的維氏氣單胞菌（QQ781151）系列相似性達99.58%，即分離得到的病原菌為維氏氣單胞菌。

3 結論與討論

本研究從太湖鱸養殖池塘底泥中分離生防菌株，篩選得到一株對維氏氣單胞菌表現抑菌活性的菌株，命名為C2-1，其抑菌圈直徑達21.62～24.32 mm。菌株C2-1的抑菌物質具有很高的酸堿穩定性和熱穩定性；掃描電子顯微鏡觀察發現菌株C2-1的發酵產物對維氏氣單胞菌的膜結構具有損壞效果；LC-MC分析表明菌株C2-1包含多種脂肽類化合物，如伊枯草菌素等。該研究結果與程心怡等[25]報道的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）J2-2的無菌濾液對維氏氣單胞菌的抑制作用結果相似。通過對菌株C2-1進行形態學觀察和分子生物學鑒定，該菌初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。掃描電鏡中拮抗菌株作用于病原菌體表面出現的溶解現象，推測是貝萊斯芽孢桿菌產生的抑菌物質如脂肽類抗生素等物質引起[26-28]。

本試驗從加州鱸池塘底泥中分離獲得C2-1菌株，經鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，對維氏氣單胞菌有明顯抑菌作用，其直徑可達（25.28±0.56）mm，對希瓦氏菌、溶血鏈球菌等多種水產致病細菌也有較好的抑制效果。貝萊斯芽孢桿菌可以產生多種脂肽類物質，對魚類安全可靠，在加州鱸水產養殖中具有較大的應用潛力。

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（責編：何 艷）