“神剪手”CRISPR-Cas9的原理與應(yīng)用

人類擁有自己的免疫系統(tǒng)，當(dāng)病毒或者其它有害的物質(zhì)入侵機(jī)體后，自身的免疫系統(tǒng)就會(huì)發(fā)揮作用，通過(guò)天然免疫和適應(yīng)性免疫保證機(jī)體的健康。細(xì)菌亦是如此，也會(huì)被病毒入侵，它的體內(nèi)也有自己的防御系統(tǒng)，即CRISPR-Cas系統(tǒng)，它是細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中的獲得性免疫防御機(jī)制，相當(dāng)于人體的特異性免疫。自從該系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，許多科學(xué)家團(tuán)隊(duì)不斷地苦心研究，誕生了一項(xiàng)名為CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)。下面讓我們來(lái)共同了解一下這一技術(shù)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關(guān)聯(lián)基因）兩部分。CRISPR主要由前導(dǎo)序列、重復(fù)序列和間隔序列構(gòu)成。

CRISPR是指成簇的規(guī)律間斷的短回文重復(fù)序列，存在于DNA中的特定區(qū)域，包含基因組靶向序列和核苷酸重復(fù)序列。這兩種序列之間交替排列，形成了細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一部分。CRISPR相當(dāng)于一個(gè)資料庫(kù)，用來(lái)儲(chǔ)存病毒的資料，其中靶向序列可以儲(chǔ)存病毒的DNA序列，重復(fù)序列可以充當(dāng)隔板，將不同病毒的資料分隔開(kāi)來(lái)。當(dāng)再次遭遇相同的病毒入侵時(shí)，細(xì)菌便可以迅速識(shí)別并且破壞其DNA，起到“免疫”的效果。

CRISPR如果想要完全殺死病毒，還需要依靠整個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)。該系統(tǒng)的前導(dǎo)區(qū)是CRISPR序列的啟動(dòng)子，它的前端是Cas基因家族。Cas基因編碼的蛋白被稱為Cas蛋白。由于Cas蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用，Cas基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因。Cas蛋白它們充當(dāng)著剪刀的角色，每當(dāng)有病毒入侵的時(shí)候，它們就會(huì)出動(dòng)，切割病毒的DNA片段并將其帶回資料庫(kù)中儲(chǔ)存起來(lái)。根據(jù)Cas蛋白的相關(guān)作用，目前可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為三大類，Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，其對(duì)應(yīng)的蛋白分別為Cas3、Cas9和Cas10蛋白，其中CRISPR-Cas9系統(tǒng)被應(yīng)用的最多。

CRISPR-Cas9的作用機(jī)理可以大致分為三個(gè)階段：當(dāng)病毒首次侵入時(shí)，相關(guān)的Cas蛋白對(duì)外源DNA片段進(jìn)行選擇，通過(guò)識(shí)別原間隔序列臨近基序PAM區(qū)域切割下來(lái)一段特殊的DNA序列作為原間隔序列，并且在酶的作用下將該序列插入CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游，從而對(duì)該病毒的“身份”進(jìn)行儲(chǔ)存。接著，CRISPR序列在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pre-crRNA，并且與反式激活crRNA（tracrRNA）形成雙鏈RNA。這一雙鏈RNA與Cas9蛋白結(jié)合，在酶的作用下，將與入侵病毒類型對(duì)應(yīng)的間隔序列RNA切割下來(lái)，形成了crRNA。最后，crRNA、tracrRNA以及Cas9蛋白形成復(fù)合物。當(dāng)外源DNA出現(xiàn)時(shí)，這一復(fù)合物就會(huì)“監(jiān)視”整個(gè)序列，當(dāng)發(fā)現(xiàn)了與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列時(shí)，就會(huì)立刻進(jìn)行定位，將外源DNA解螺旋。與此同時(shí)，Cas9蛋白“閃亮登場(chǎng)”，對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行了“消滅”處理。

借助CRISPR-Cas9系統(tǒng)，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因敲除和基因敲入等。該編輯技術(shù)主要包含兩個(gè)環(huán)節(jié)：切割環(huán)節(jié)和修復(fù)環(huán)節(jié)。切割環(huán)節(jié)是通過(guò)人工的設(shè)計(jì)，將tracrRNA和crRNA融合為sgRNA，它們發(fā)揮著向?qū)У淖饔茫珻as9蛋白通過(guò)PAM到達(dá)靶點(diǎn)上游，將DNA的雙鏈解螺旋，與此同時(shí)，對(duì)DNA進(jìn)行切割，使其雙鏈斷裂。DNA雙鏈斷裂激活了DNA修復(fù)機(jī)制，就進(jìn)入了修復(fù)環(huán)節(jié)，即通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）的方式修復(fù)基因組DNA。NHEJ通過(guò)插入或者敲除幾個(gè)堿基，快速地將斷裂的DNA連接起來(lái)，很容易使切割位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，使靶標(biāo)基因失去功能，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除；HDR模式則實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)編輯，通過(guò)將DNA修復(fù)模板導(dǎo)入細(xì)胞，基因組斷裂部分就依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行同源重組修復(fù)（HDR），從而實(shí)現(xiàn)基因敲入。除此之外，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)還被用于基因抑制、基因激活、多重編輯、功能基因組篩選等。

然而，CRISPR-Cas9技術(shù)也存在一些挑戰(zhàn)和局限性，包括脫靶效應(yīng)（即Cas9在非目標(biāo)位點(diǎn)切割DNA）、編輯效率和特異性的優(yōu)化、以及在某些細(xì)胞類型和組織中的遞送問(wèn)題。我們期待在未來(lái)能夠有更安全、有效、精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)的誕生。