豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因實時熒光定量PCR檢測方法的建立

收稿日期：2024-02-29

基金項目：甘肅省自然科學基金項目（21JR1RA221）；蘭州市科技計劃項目（2023-1-31）；中央高?；究蒲许椖浚?1920220050）

作者簡介：安樂樂（1997-），男，河南周口人，碩士研究生，主要從事病毒基因工程研究。（Tel）17836954272；（E-mail）1803180130@qq.com

通訊作者：趙永清，（E-mail）450883800@qq.com

摘要： 為建立一種快速、高效檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的實時熒光定量PCR方法，本研究根據GenBank公布的中國流行PRRSV病毒株基因序列，制備包含PRRSV ORF7基因的重組質粒標準品，同時，針對PRRSV保守區域ORF7基因序列設計特異性引物和探針，并優化引物和探針終濃度，建立PRRSV TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。以質粒標準品為模板構建檢測方法線性模型，評估靈敏度、重復性和特異性，并在疑似臨床樣品中初步應用。本研究建立的PRRSV TaqMan熒光定量PCR檢測方法線性關系良好，線性決定系數為0.997 5；病毒載量檢測限度為 "μL 3.32×10 拷貝；變異系數在組內和組間重復中均小于1.500%；僅與PRRSV發生特異性反應，未與其他病毒發生交叉反應。臨床樣品qPCR檢測陽性率為36.92%，高于PCR檢測陽性率（26.15%），陽性符合率為100%?；赑RRSV ORF7基因構建的TaqMan熒光定量PCR檢測方法線性關系良好、靈敏度高、重復性好、特異性強，可快速、高效檢測臨床樣品PRRSV，為PRRSV早期診斷、及時防控和流行病學調查提供了科學的技術支撐。

關鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征； ORF7基因； TaqMan實時熒光定量PCR； 早期診斷

中圖分類號： S855.3"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 000-4440（2024）09-1681-08

Establishment of real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of ORF7 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus

AN Lele LUO Xun YANG Xuanye HU Xinyan ZHAO Yongqing ，2

（1.Biomedical Research Center， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；2.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730100， China）

Abstract： To establish a rapid and efficient qPCR method for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV）， standard recombinant plasmid samples containing the ORF7 gene of PRRSV were prepared， according to the gene sequences of popular PRRSV strains in China annunciated by GenBank. Meanwhile， specific primers and probes were designed according to the ORF7 gene sequence of the conserved region of PRRSV， and the final concentrations of primers and probes were optimized to construct a real-time fluorescence quantitative PCR detection method for PRRSV TaqMan. The linear model of the assay was constructed by using the plasmid standard sample as the template to evaluate the sensitivity， repeatability and specificity， and the preliminary application was made in suspected clinical samples. The linear determination coefficient of the established TaqMan qPCR detection method for PRRSV was 0.997 5 and the linear relationship was good. The minimum detection limit of viral load was 3.32×10 "copies/μL. The coefficient of variation was less than .500% in both intra-group and inter-group replicates. It only reacted specifically with PRRSV， and did not cross-react with other viruses. The positive detection rate of qPCR in clinical samples was 36.92%， which was higher than that of PCR （26.15%）， and the positive coincidence rate was 00%. The TaqMan fluorescence quantitative PCR method based on PRRSV ORF7 gene had good linear relationship， high sensitivity， good repeatability and strong specificity. It can quickly and efficiently detect PRRSV in clinical samples， which provides scientific technical support for PRRSV early diagnosis， timely prevention and control as well as epidemiological investigation.

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome;ORF7 gene;TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR；early diagnosis

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染妊娠母豬會導致妊娠終止、胎兒死亡、木乃伊胎產生、畸形胎產生和弱仔產生等繁殖障礙，各日齡豬群感染后表現出以呼吸困難、咳嗽等呼吸道典型癥狀為主要特征的豬繁殖與呼吸綜合征[1]，其中最易感豬群是30日齡以下仔豬和妊娠母豬，且PRRSV僅感染豬群，對其他動物不發生感染。因豬繁殖與呼吸綜合征病毒病在臨床上可使病豬耳朵部位呈現藍紫色，故又稱“豬藍耳病”。1987年PRRSV在美國北卡羅來納州、艾奧瓦州等地首次被發現，1988年在加拿大暴發，1990年以來在德國、丹麥及歐洲其他國家相繼發現該病毒的存在[2]。1991年荷蘭學者Wensvoort等分離出Lelystad virus（簡稱LV株），1992年美國學者分離出ATCC VR-2332株，依照病毒代表株最初分離地域不同，將分離毒株分別命名為歐洲型株（Ⅰ型豬繁殖與呼吸綜合征）和北美洲型株（Ⅱ型豬繁殖與呼吸綜合征）[3]。PRRSV基因組為易發生變異的RNA，該RNA單股正鏈，不分節段，序列長度約15.4 kb[4]。PRRSV是網巢病毒目，歸屬動脈炎病毒科成員，是病毒科4個成員中基因組長度最大的，透射電鏡觀察病毒顆粒呈現球狀，具有表面纖突的囊膜結構，病毒顆粒直徑為45～65 nm，核衣殼直徑為25～35 nm，呈現二十面體對稱[5]。PRRSV基因組堿基易發生突變和缺失，變異區域主要集中在非結構蛋白Nsp2區域[6]，而編碼核衣殼N蛋白的ORF7基因高度保守，是PRRSV通用性檢測引物設計最佳靶基因的區域[7-8]。

1996年，在中國大陸首次發現并成功分離出PRRSV毒株[9]，毒株血清型與北美洲型接近。迄今，中國國內發現并報道的PRRSV毒株，大多數血清型為北美洲型，關于歐洲型毒株的報道較少[10]。2006年，在江西省首次發現高熱、高致死率的高致病性PRRSV，對免疫力尚弱的仔豬和健康的育肥豬均能引起感染，此高致病性毒株的流行導致中國生豬養殖面臨極大的風險挑戰和經濟財產損失，并逐步發展成為中國流行毒株[11]。現如今科技發展迅速，生豬養殖越來越集中化、立體化、工業化，單位面積內豬數量龐大，豬與豬之間接觸緊密，PRRSV接觸傳染性較強，易發生大規?？焖賯鞑デ也豢煽?。因此，建立一種快速高效的特異性檢測方法不僅是解決PRRSV預防和控制的有效手段，更對中國獸醫公共衛生學具有深遠的意義。目前，由于存在大量亞臨床感染[12]，且不同豬群發病臨床癥狀也存在不同，因此需要更精準的實驗室方法進行臨床檢測，以更好地確定發病原因，從而積極科學有效地針對性治療和確定快捷處置方案。實驗室檢測方法多以PCR為主，也有血清學檢查，包括間接免疫熒光技術、血清中和試驗、酶聯免疫吸附測定和免疫過氧化物酶單層試驗。常規PCR存在無法定量分析、敏感性差、易發生中途開蓋污染等缺陷；酶聯免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗及其他血清學檢測技術存在操作繁瑣、時間周期長等缺點；實時熒光定量PCR（qPCR）技術具有相對定量和絕對定量、操作簡單快捷、重復性好、敏感性高、檢測速度快等優點[13]，在實驗室臨床檢測方法中更具優勢。

本研究基于PRRSV 保守基因ORF7設計多對引物探針，并對比試驗數據篩選出最佳熒光定量檢測性引物和探針，在熒光定量PCR（探針法）方法上構建一種能夠快速準確檢測PRRSV的實驗室方法，用標準曲線創建病毒載量拷貝數與循環數（Ct）之間的定量關系，采用質粒標準樣本作模板的試驗方案驗證檢測方法的靈敏度、重復性、特異性，并在臨床樣品上進行初步應用，為PRRSV早期診斷、預防控制和流行病學調查提供科學的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒株與臨床病料

PRRSV病料、偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病病毒（CSFV）、豬細小病毒（PPI）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬流感病病毒（SIV）等經過56 ℃、30 min滅活處理的陽性毒株樣本均由中國農業科學院畜牧獸醫研究所實驗室通過基因擴增測序鑒定和保存。65份病豬疑似臨床組織樣本（淋巴結、糞便等）分別從不同地區的養豬場采集，由本實驗室于56 ℃、30 min滅活處理后，于-80 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑與儀器

微生物培養皿（90 mm），50×TAE購自北京索萊寶科技有限公司；RNA反轉錄試劑[HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）]、熒光定量PCR探針法酶試劑（Taq Pro U + Multiple Probe qPCR Mix）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；克隆載體（pUC57，Ampicillin抗性）購自寶日醫生物技術有限公司；BeyoPure TM Ultrapure Water （PCR級， Sterile）購自碧云天生物技術有限公司； DH5α 大腸桿菌感受態細胞、SanPrep 柱式質粒小提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學有限公司。

SH-NanoOne超微量分光光度計購自杭州申花科技有限公司；GM-O5 PCR基因擴增儀購自杭州晶格科學儀器有限公司；qPCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.3 引物探針設計與合成

參考GenBank 發布的PRRSV（OR805486）相對保守區域ORF7基因，按照Taq Man復合熒光引物探針設計和常規PCR引物設計原則，利用Oligo7.60設計1對標準品上下游引物（PRRSV-F1/PRRSV-R1） 、1對熒光定量PCR上下游引物（PRRSV-F2/PRRSV-R2）及探針（PRRSV-P），PCR引物及探針序列見表1，熒光定量PCR引物及探針序列位置信息見圖1，其中探針序列2端進行特殊熒光基團修飾（5′端為FAM，3′端為BHQ-1）。引物及探針合成由擎科生物科技股份有限公司完成。

1.4 重組質粒標準品構建

使用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取病料中PRRSV基因組并反轉錄，以cDNA為模板，使用常規引物擴增獲取ORF7目的基因，使用SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒回收目的基因并純化。按照TaKaRa DNA連接試劑盒說明書配置目的基因ORF7，然后和pUC57克隆載體反應體系進行連接，用連接產物轉化E.coli DH5α Competent cells，37 ℃培養。挑取單個菌斑進行抗性培養，陽性菌斑培養液進行菌液基因擴增鑒定和基因測序鑒定[由生工生物工程（上海）股份有限公司完成]。使用SanPrep 柱式質粒小提試劑盒抽提陽性菌液獲取質粒，質粒命名為pUC57-PRRSV-ORF7。陽性質粒pUC57-PRRSV-ORF7作為質粒標準品和后續試驗的陽性模板，放置于-20 ℃備用。

1.5 病料核酸提取及反轉錄

取滅活處理后的PRV、CSFV、PCV2、PPI、SIV陽性血清樣本和65份病豬滅活臨床組織樣本，利用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取基因組RNA和DNA，其中豬瘟病毒和豬流感病毒基因組RNA易降解，無法長期穩定保存，故需要用商業化反轉錄試劑盒反轉錄處理，獲取高穩定性產物cDNA。所有病毒基因組于-20 ℃條件下保存。

1.6 熒光定量PCR反應體系優化

以1 μL質粒標準品pUC57-PRRSV-ORF7為反應模板，反應總體系為20 μL，對引物終濃度、探針終濃度進行優化。反應程序：污染消化（37 ℃ 2 min），預變性（95 ℃ 30 s），循環反應（95 ℃ 0 s，60 ℃ 30 s），循環40次。引物終濃度和探針終濃度如表2所示，以循環數低、熒光強度高和穩定性好來綜合考量確定該qPCR檢測方法引物和探針的最佳終濃度。

1.7 標準曲線的建立

將質粒標準品pUC57-PRRSV-ORF7進行10倍倍比稀釋，以1 μL 0 3～10 8拷貝質粒標準品作為反應模板，使用方法1.6最優引物探針終濃度進行qPCR擴增，每組3個重復，Ct取平均值，由陽性質粒拷貝數和Ct平均值繪制該qPCR檢測方法的標準曲線。

1.8 靈敏性試驗

以1 μL 0 0～10 8 拷貝質粒標準品作為反應模板，以去離子水作為陰性對照，使用最優引物探針終濃度進行qPCR擴增。同時以常規PCR方法[14]檢測質粒標準品，作為靈敏性試驗的對照組，其中選用質粒標準品拷貝數1 μL 0 0 拷貝作陽性對照。分析熒光定量PCR和常規PCR檢測的最小病毒載量拷貝數，通過數據對比說明該qPCR檢測方法在靈敏度上的優勢。

1.9 重復性試驗

以1 μL 0 3～10 7 拷貝質粒標準品作為反應模板，以去離子水作為陰性對照，使用上述最優反應條件進行qPCR擴增，對建立的檢測方法進行重復性驗證，每個質?？截愒O組內重復試驗和組間重復試驗各3次。以組內和組間重復試驗算術平均值和標準差來計算變異系數（CV），評價該qPCR檢測方法的重復性及穩定性。

1.10 特異性試驗

以豬繁殖與呼吸綜合征病毒病料基因組和方法1.5提取的PRV、CSFV、PPI、PCV2及SIV基因組作為反應模板，同時以去離子水作為陰性對照，使用上述最優反應條件進行特異性試驗，通過觀察是否出現“S”形擴增曲線來檢驗該qPCR檢測方法的特異性。

1.11 臨床樣本的檢測

以方法1.5提取的65份病豬臨床組織樣本基因組及反轉錄的cDNA作為反應模板，同時以去離子水作為陰性對照，使用上述建立的qPCR檢測方法進行擴增。同時用方法1.8中常規PCR方法對65份基因組cDNA進行檢測。

2 結果與分析

2.1 重組質粒標準品制備

以反轉錄產物cDNA為模板，使用擴增ORF7基因的上下游引物PRRSV-F1/PRRSV-R1進行常規PCR擴增，獲得ORF7基因，基因大小為372 bp（圖2）。將PCR擴增產物切膠回收并純化，連接轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞，經氨芐青霉素篩選后挑取單克隆菌斑進行37 ℃過夜擴大培養。使用菌液進行PCR鑒定，目的基因條帶大小為372 bp（圖3），將陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定，對比測序序列與目的基因ORF7序列，結果一致，證明重組質粒pUC57-PRRSV-ORF7構建成功。抽提陽性質粒并用SH-NanoOne儀器進行濃度檢測，重組質粒質量濃度為112.316 ng/μL，理論拷貝數為1 μL 3.32×10 0 拷貝。

2.2 Taq Man熒光定量PCR反應體系優化

在退火溫度60 ℃反應條件下，在合理的引物探針濃度范圍（100～600 nmol/L）內，設置6個不同濃度的處理，每個處理3個重復，對TaqMan熒光定量方法進行終濃度優化。引物終濃度在100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L、400 nmol/L、500 nmol/L、600 nmol/L的條件下，循環數分別為17.736±0.356、17.561±0.383、17.247±0.149、17.492±0.475、17.366±0.594、17.474±0.403，每個濃度的擴增曲線的重復性、穩定性均較佳且無非特異性擴增（圖4），在引物終濃度為300 nmol/L時，循環數（17.247±0.149）最低，穩定性最好，故優化得到最佳引物終濃度為300 nmol/L，最佳探針終濃度為150 nmol/L。

2.3 標準曲線的建立

以1 μL 3.32×10 2拷貝、1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝、1 μL 3.32×10 8拷貝的質粒為模板，每組3個重復，用最佳引物探針終濃度進行qPCR擴增反應，采用循環數平均值建立標準曲線模型。如圖5所示，標準曲線的回歸方程為Y=-3.398 9x+38.114 0，使用GraphPad Prism8.0.1軟件進行數據分析，在線性回歸模型擬合度中的決定系數（R 2）為0.997 5，用公式[擴增效率（E）=10[（-1/斜率）-1]]計算擴增效率，為96.89%。結果表明標準曲線具有良好的擬合性，線性關系良好。

2.4 靈敏性試驗

以1 μL 3.32×10 0拷貝、1 μL 3.32×10 拷貝、1 μL 3.32×10 2拷貝、1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝、1 μL 3.32×10 8拷貝的質粒作為反應模板，同時設置陰性對照（ddH2O），在優化的最佳引物探針終濃度條件下進行qPCR擴增反應，通過比較TaqMan qPCR方法和常規PCR方法的質?？截悢底钚≈祦眚炞C方法的靈敏度。結果（圖6）顯示，常規PCR方法可以檢測最小病毒載量拷貝數為1 μL 3.32×10 3 拷貝；圖7顯示， TaqMan qPCR方法可以檢測最小病毒載量拷貝數為1 μL 3.32×10 "拷貝。二者對比，TaqMan qPCR方法靈敏度更高，是常規PCR方法的100倍，具備更好的實驗室檢測優勢。

2.5 重復性試驗

以1 μL 3.32×10 3拷貝、1 μL 3.32×10 4拷貝、1 μL 3.32×10 5拷貝、1 μL 3.32×10 6拷貝、1 μL 3.32×10 7拷貝的質粒作為反應模板，每組3個重復作為組內重復試驗，在不同時間段進行3次試驗作為組間重復試驗，在優化的最佳引物探針終濃度條件下進行TaqMan qPCR擴增，對組內和組間重復試驗數據進行分析來評估TaqMan qPCR方法的重復性。由表3可知，該方法組內變異系數為0.460%～1.124%，組間變異系數為0.607%～1.366%，組內、組間變異系數均小于1.500%，因此該TaqMan qPCR方法具有良好的重復性和穩定性，表明該檢測方法具備合理性和可重復性。

2.6 特異性試驗

使用優化反應條件檢測PRV、CSFV、PPI、PCV2、SIV基因組和PRRSV病料基因組，以去離子水作為陰性對照，觀察分析擴增曲線來驗證TaqMan熒光定量PCR方法的特異性。由圖8可知，僅有PRRSV出現擴增曲線，說明本檢測方法與豬身上常見的病毒核酸未發生交叉反應，特異性較強。

2.7 臨床樣本的檢測

為了驗證所建qPCR方法臨床應用的可行性，以65份病豬臨床組織樣本的核酸作為反應模板，用建立的qPCR方法在臨床樣本中進行初步檢驗。結果顯示：TaqMan熒光定量PCR方法陽性檢出率為36.92%（24/65），高于常規PCR方法陽性檢出率（26.15%=17/65），qPCR陽性樣品經測序鑒定，符合率為100%，并且PCR方法檢出的17份陽性樣品均包含在qPCR方法檢出的24份陽性樣品中，論證了2.4節qPCR方法的高靈敏性，表明建立的qPCR檢測方法具有更好的臨床適用性和更好的實驗室檢測優勢，可以對大批量臨床樣本和低病毒載量的樣本進行有效檢測。

3 討論與結論

PRRSV唯一的易感動物是豬，該病毒傳播途徑廣泛，可以通過動物直接接觸方式或排泄物、組織器官等接觸方式進行傳播；還可以空氣作為媒介以氣溶膠的形式傳播；也能由精液攜帶方式進行傳播。某些鳥類、蚊子也可以攜帶病原進行傳播[15-16]?；疾∝i可以通過糞便、尿液、精液、唾液和乳腺分泌物等載體向環境排出豬繁殖與呼吸綜合征病毒。1993年，在中國臺灣分離出豬繁殖與呼吸綜合征病毒；1995年底，在中國大陸發現豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性豬場，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所郭寶清等率先在北京地區分離出4株豬繁殖與呼吸綜合征病毒（CH-1a、CH-1b、CH-1c和CH-1d）[17-18]，均屬于北美洲型毒株[19]，從而證實在中國大陸存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒。2006年4月，高致病性PRRSV毒株首次在江西省被發現和報道，感染豬的主要特征是體溫高、發病率高及死亡率高，且各品種、各種年齡階段的豬群均能感染發病[20]。根據現有的調查數據[21]初步統計，PRRSV發病率在50%以上，死亡率在20%～100%，給中國養豬業造成了巨大的經濟損失。隨著PRRSV疫苗的大規模普及應用，該病毒感染在國內得到顯著控制，但亞臨床感染逐漸增加，僅依據臨床癥狀很難準確斷定疾病類型，無法對早期感染豬進行有效隔離和針對性治療。因此，找到更方便、靈敏、安全、準確、特異的PCR檢測方法成為必需。張宇鑫等[22]利用四重PCR方法檢測PRRSV，該方法檢測下限為1μL 6.5×10 4 拷貝；王方洲等[23]建立RT-PCR方法檢測PRRSV；王新港等[24]建立雙重PCR方法檢測PRRSV，該方法檢測下限為2.48×10 4 ng。與常規PCR方法檢出率低、無法定量病毒載量、操作時間長、中間操作環節易污染的缺陷相比較，熒光定量PCR優勢較明顯，具備靈敏度高、準確性好、中間操作污染環節減少、絕對或相對定量及實時監測優勢，目前被廣泛應用于各種疾病的快速診斷和流行病學調查[25]中。張杰等[26]利用染料法建立熒光定量 PCR 方法檢測PRRSV，該方法檢測下限為1×10 0.5 TCID50（半數組織培養感染劑量）病毒。使用TaqMan探針法建立的針對PRRSV感染的檢測方法，與染料法SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR相比，探針法的特異性更強，準確性和靈敏性更高，檢測結果更具有說服力。

本研究基于ORF7基因高保守性，以ORF7為靶基因完成特異性引物和探針設計，改善引物和探針終濃度以達到最佳反應條件，建立適用于PRRSV早期感染診斷的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法標準曲線Y=-3.398 9x+38.114 0，線性決定系數（R 2）為0.997 5，擴增效率為96.89%，可以穩定檢出的最小病毒載量值為1 μL 3.32×10 "拷貝，靈敏度是常規PCR方法的100倍，組內和組間變異系數均小于1.500%，重復性和穩定性良好，同時對PRRSV、PRV、CSFV、PPI、PCV2和SIV進行檢測，僅有PRRSV出現擴增曲線，常見的感染豬的其余病毒核酸檢測結果均呈現陰性，可見此檢測方法與豬身上其他常見病原核酸不存在交叉反應，特異性較強。使用該qPCR檢測方法對采集的65份病豬臨床樣本核酸進行檢測，陽性率為36.92%，符合率為100%，具有良好的臨床適用性。

綜上所述，本研究基于PRRSV ORF7基因構建的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，靈敏性高、重復性好、穩定性高、特異性強，且適用于大批量臨床樣本檢測，為豬群PRRSV早期快速診斷、及時防控、流行病學調查提供了科學的技術支撐。

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（責任編輯：陳海霞）