胡蘿卜開花抑制子基因DcFLC的克隆與表達模式

收稿日期：2023-09-26

基金項目：國家自然科學基金項目（32072563、32102369）；江蘇省自然科學基金項目（BK20211366）；江蘇高校優勢學科建設項目（PAPD）

作者簡介：劉珊珊（2000-），女，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。（E-mail）2022104058@stu.njau.edu.cn

通訊作者：熊愛生，（E-mail） xiongaisheng@njau.edu.cn

摘要： 開花是植物由營養生長向生殖生長轉變的重要標志。開花抑制子基因FLC是植物春化作用的關鍵調節基因。為了探明FLC基因在胡蘿卜花發育過程中的作用，本研究以黑田五寸胡蘿卜為試驗材料，克隆得到胡蘿卜DcFLC基因的編碼序列（CDS），并利用實時熒光定量PCR技術（RT-qPCR）分析盛花期黑田五寸胡蘿卜各組織及不同發育狀態花中DcFLC基因的相對表達量。結果表明，DcFLC基因的開放閱讀框（ORF）長度為660 bp，編碼219個氨基酸。DcFLC的相對分子量為2.454×10 4，理論等電點為9.15，是一個親水性蛋白質。基于FLC編碼的蛋白質氨基酸序列，胡蘿卜與擬南芥、結球白菜、油菜、蘿卜、杧果、白樺、可可、龍眼、葡萄、核桃等物種的遺傳距離較遠。盛花期胡蘿卜肉質根、葉片和葉柄中DcFLC基因的表達量高于莖和花中DcFLC基因的表達量；花中開花抑制子基因DcFLC的相對表達量隨著花的發育呈現先上升后下降再上升的變化趨勢。本研究結果為胡蘿卜FLC基因的利用和耐抽薹胡蘿卜品種選育提供依據。

關鍵詞： 胡蘿卜；開花抑制子基因DcFLC；表達分析；花發育

中圖分類號： S631.2"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 000-4440（2024）09-1731-08

Cloning and expression profiles of flowering suppressor gene DcFLC in Daucus carota

LIU Shanshan DUAN Aoqi TAN Shanshan DENG Yuanjie WANG Guanglong LIU Hui SUN Miao XU Zhisheng XIONG Aisheng

（1.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics amp; Germplasm Enhancement and Utilization/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210095， China;2.School of Life Science and Food Engineering， Huaiyin Institute of Technology， Huai’an 223003， China;3.School of Marine and Biological Engineering， Yancheng Teachers University， Yancheng 224002， China）

Abstract： Flowering is an important symbol of the transformation of plants from vegetative growth to reproductive growth. The flowering suppressor gene FLC is a key regulator of plant vernalization. In order to explore the role of FLC gene in the development of carrot flowers， the coding sequence （CDS） of DcFLC gene was cloned from Kurodagosun carrot， and the relative expression of DcFLC gene in different tissues and flowers with different developmental states of Kurodagosun carrot at full-bloom stage was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） in this study. The results showed that the open reading frame （ORF） of DcFLC gene was 660 bp in length， encoding 219 amino acids. The relative molecular weight of DcFLC was 2.454×10 and the theoretical isoelectric point was 9.15. It was a hydrophilic protein. Based on the amino acid sequence of the protein encoded by FLC， the genetic distance between carrot and Arabidopsis thaliana， Chinese cabbage， rapeseed， radish， mango， birch， cocoa， longan， grape and walnut was far. The expression of DcFLC gene in carrot fleshy roots， leaves and petioles was higher than that in stems and flowers at full-bloom stage. With the development of flowers， the relative expression of flowering suppressor gene DcFLC in flowers showed a trend of increasing first， then decreasing and then increasing. The results of this study provide a basis for the utilization of carrot FLC gene and the breeding of bolting-resistant carrot varieties.

Key words： carrot;flowering suppressor gene DcFLC;expression analysis;flower development

植物的開花時間對新品種繁育十分重要[1]。植物開花受日長、溫度等外界環境條件和自身激素水平、營養水平、基因型等內部因素共同控制。外界途徑包括光周期途徑（Photoperiods pathway）、春化途徑（Vernalization pathway）和溫度途徑（Ambient temperature pathway）等；內在途徑包括赤霉素途徑（Gibberellin pathway）、年齡途徑（Aging pathway）、自主途徑（Autonomous pathway）、脫落酸途徑（Abscisic acid pathway， ABA pathway）和油菜素甾醇途徑（Brassinosteroids pathway， BR pathway）等[2-8]。這些途徑共同構成植物的開花調控網絡，調控植物的開花過程。調控過程中涉及的基因主要有FT[9]、SOC1[10]、FLC[11]等。

FLC作為高等植物特有的一類轉錄因子基因，屬于MADS家族基因，控制著植物的開花時間，是重要的開花抑制子基因[12]。Michaels等[13]研究發現AtFLC基因能調控擬南芥開花時間和春化過程， AtFLC基因高表達量的擬南芥植株開花時間明顯推遲，而AtFLC基因突變體則開花提前[13]。茶樹CsFLC基因在花器官發育過程中高表達，說明CsFLC基因可正向調節茶樹花的發育[14]。蕓薹屬葉菜類植物中的BrFRI基因能激活BrFLC基因，且BrFLC旁系同源基因的表達水平與冷處理后的開花天數呈正相關[15]。

胡蘿卜（Daucus carota）是傘形科胡蘿卜屬二年生草本植物，富含多種維生素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素以及可溶性糖、纖維素、蛋白質、礦物質等多種營養物質[16]，是全球十大蔬菜作物之一。栽培過程中，胡蘿卜易受長日照和早春低溫的影響而提前抽薹，從而導致肉質根木質化，降低胡蘿卜的品質和產量[17]。耐抽薹胡蘿卜品種的選育已成為胡蘿卜產業健康發展的重要基礎。加強胡蘿卜開花抑制子基因DcFLC表達特征的研究對該基因的利用和耐抽薹胡蘿卜品種選育有重要意義。

本研究從黑田五寸胡蘿卜品種中克隆得到MADS-box轉錄因子基因DcFLC，并對其進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR分析盛花期胡蘿卜各組織中DcFLC的相對表達量及不同發育狀態花中DcFLC基因的表達量變化特征，為耐抽薹胡蘿卜品種選育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以黑田五寸胡蘿卜品種為試驗材料， 2021年9月播種于南京農業大學人工氣候室。共種植5盆，每盆3株。人工氣候室內溫度設置為25 ℃（光期12 h）/20 ℃（暗期12 h），光照度300 μmol/（m 2·s）[18]。2022年1月胡蘿卜苗移至室外生長，5月胡蘿卜抽薹開花。胡蘿卜開花后20 d選取健壯且長勢一致的9棵胡蘿卜植株對葉片、葉柄、莖、根以及不同開放程度的花等進行取樣，且重復3次。其中，花序的開放程度如圖1所示。取樣后樣品立即用液氮速凍，并保存于-80 ℃冰箱。

1.2 DcFLC基因克隆

胡蘿卜總RNA提取和cDNA的合成按照多糖多酚植物RNA提取試劑盒（RNA simple total RNA Kit，上海浦迪生物科技有限公司產品）和反轉錄試劑盒（Prime Script RT reagent Kit，南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品）操作說明進行。根據擬南芥AtFLC的堿基序列在胡蘿卜數據庫[19]中檢索得到胡蘿卜DcFLC基因堿基序列。根據胡蘿卜DcFLC基因堿基序列，使用Primer premier 5.0軟件設計全長引物（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。使用Prime STAR Max Premix試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司產品]并根據試劑盒使用說明，采用30 μL體系進行PCR擴增。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，回收產物送通用生物（安徽）股份有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

基于NCBI數據庫，利用Blast工具獲得擬南芥、結球白菜、油菜、蘿卜、杧果、白樺、可可、龍眼、葡萄、核桃及胡蘿卜等物種FLC基因堿基及其編碼的氨基酸序列；利用BioXM 2.6軟件獲得胡蘿卜和其他物種FLC基因編碼蛋白質的相對分子量、等電點、酸性氨基酸比例和堿性氨基酸比例。使用NCBI的保守結構域數據庫（CDD）對DcFLC蛋白的保守結構域預測；利用DNAman 6.0完成不同物種FLC蛋白氨基酸序列的比對；利用Expasy在線網站（https：//web.expasy.org/protscale/）對DcFLC蛋白進行親疏水性分析；利用MAGE 7.0完成不同物種系統進化樹的構建[20]；使用SOPMA在線網站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS MODEL網站（https：//swissmodel.expasy.org/）分析DcFLC蛋白的二級結構和三級結構；使用STRING網站（https：//cn.string-db.org/）進行胡蘿卜DcFLC蛋白互作預測[21]。

1.4 胡蘿卜DcFLC基因的表達模式分析

以胡蘿卜DcActin 基因（GenBank No. XM_ 017371101.1）作為內參基因[22]，采用BioRad CFX96 Real-time System和BioRad CFX Manager進行胡蘿卜樣本的實時熒光定量PCR分析，所用引物序列如表1。實時熒光定量 PCR 總體系為20.0 μL，包括ddH2O 7.2 μL、SYBR Premix Ex Taq 0.0 μL、正向引物和反向引物各0.4 μL及2.0 μL稀釋15倍后的cDNA模板。擴增程序按照SYBR Premix Ex Taq酶的使用說明書設置。采用 2 -△△Ct 方法計算胡蘿卜DcFLC基因的相對表達量[23]，使用SPSS 27和GraphPad Prism軟件進行基因數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜DcFLC基因的克隆與序列分析

克隆得到的胡蘿卜DcFLC基因通過瓊脂糖凝膠電泳后，檢測得到單一明亮的目的條帶（圖2）。胡蘿卜DcFLC基因編碼蛋白的開放閱讀框（ORF）長度為660 bp，編碼219個氨基酸（圖3）。DcFLC蛋白包含MADS-MEF2-like和K-box兩個結構域，屬于典型的MADS-box家族蛋白（圖4）。胡蘿卜DcFLC蛋白氨基酸序列的親疏水性如圖5所示。DcFLC的大部分氨基酸為親水性氨基酸。

DcFLC的氨基酸殘基數為219，相對分子量為2.454×10 4，理論等電點為9.15，酸性氨基酸和堿性氨基酸比例分別為24%和18%。擬南芥、結球白菜、油菜、蘿卜、杧果、白樺、可可、龍眼、葡萄、核桃等物種FLC蛋白的氨基酸殘基數為163～210，相對分子量為1.837×10 4～2.449×10 4，理論等電點為6.27～10.35。酸性氨基酸比例22%～28%，堿性氨基酸比例17%～20%（表2）。上述不同物種FLC蛋白氨基酸序列總體相似度為58.12%（圖6）。

2.2 胡蘿卜DcFLC蛋白的二級結構及三級結構

胡蘿卜DcFLC蛋白的二級結構中α螺旋（Al-pha helix）占比高達60.73%，延伸主鏈（Extended strand）、β轉角（Beta turn）和無規則卷曲（Random coil）占比分別為12.33%、4.57%和22.37%。DcFLC蛋白的三級結構主要由螺旋和折疊組成（圖7）。

2.3 胡蘿卜DcFLC蛋白的互作

胡蘿卜DcFLC蛋白潛在的互作關系如圖8所示。從圖中可以看出，DcFLC與調節胡蘿卜開花的SVP、GI、FT和FRI等轉錄因子存在相互作用。SVP（Short vegetative phase）是植物中MADS-box轉錄因子家族成員，通過脫落酸（ABA）代謝調控植物開花過程。DcFLC蛋白可通過與SVP轉錄因子互作，實現對胡蘿卜開花的調控。

2.4 胡蘿卜DcFLC蛋白的系統進化樹

不同物種FLC蛋白氨基酸序列系統進化樹如圖9所示。從圖中可以看出，擬南芥、結球白菜、油菜和蘿卜等十字花科植物FLC蛋白遺傳距離較小，聚為一類。胡蘿卜DcFLC蛋白與其他植物FLC蛋白之間遺傳距離相對較遠，單獨形成一支，說明胡蘿卜DcFLC蛋白的功能與其他植物可能存在差異。

2.5 DcFLC基因在胡蘿卜盛開期不同組織以及不同發育狀態花中的表達

胡蘿卜盛花期不同組織及不同發育狀態花中DcFLC基因的表達量如圖10所示。盛花期胡蘿卜肉質根、葉片和葉柄中DcFLC基因的表達量較高，莖和花中的表達量較低。隨著花的發育，花中DcFLC表達量呈現先上升后下降再上升的趨勢，在花序發育的第3、第4階段表達量較高，第5階段表達量最低，第3階段DcFLC表達量是第5階段的4.5倍。

3 討論與結論

FLC作為調控植物開花的關鍵基因，與植物發育密切相關。本研究從黑田五寸品種中克隆得到胡蘿卜DcFLC基因，并對其進行生物信息學分析。結果表明DcFLC基因編碼的蛋白質中大部分氨基酸為親水性氨基酸，胡蘿卜與擬南芥、油菜、結球白菜等物種FLC基因編碼的蛋白質的氨基酸構成中酸性氨基酸占比高于堿性氨基酸。MADS家族蛋白有兩種結構類型，Ⅰ型（SRF）和Ⅱ型（MEF2），在Ⅱ型MADS-box中存在1個特有的K-box結構[24]。胡蘿卜DcFLC蛋白具有典型的MADS-box結構域，屬于MADS家族，同時還具有K-box結構，屬于MADS家族中的Ⅱ型分支。MADS-MEF2-like結構位于2～80氨基酸位點，K-box結構位于103～176氨基酸位點，與擬南芥、結球白菜和油菜等植物相似[25-26]。FLC蛋白進化關系表明胡蘿卜DcFLC與其他物種FLC不在同一分支上，親緣關系較遠。同一科植物的FLC因子聚在同一分支上，如擬南芥、大白菜、油菜和蘿卜等十字花科植物，表明同科植物FLC氨基酸序列同源性比較高。蛋白質互作預測結果表明FLC與SVP和GI之間存在較為明顯的互作關系。Mateos等[27]研究證實，擬南芥AtSVP蛋白與AtFLC蛋白可形成復合物，抑制擬南芥開花基因的啟動和表達。

本研究結果表明，盛花期胡蘿卜DcFLC基因主要在葉片與葉柄中表達，莖和花中表達量相對較低；不同發育狀態花中DCFLC表達量呈先增加后減少再增加的特征，其中在花序發育的第3、4階段表達量較高。盛花期胡蘿卜DcFLC基因在花中表達量相對較低，原因可能是胡蘿卜抽薹開花后，開花抑制因子基因DcFLC的表達水平受到其他基因的抑制而逐漸降低。Michaels等[28]研究發現，擬南芥莖尖與根尖AtFLC的表達量較高。結球白菜根、莖、葉片和花等器官中BcFLC均有表達，且抽薹前BcFLC基因的表達量高于抽薹后[29]。營養生長期菊花葉片中CmFLC-like1基因的表達量較高，根系中較低[30]。不同杧果品種或同一杧果品種不同組織中MiFLC基因均有表達，且營養器官中表達量較高，花中表達量較低[31]。FLC在擬南芥及其異源多倍體中表達方式也存在多樣性，擬南芥異源多倍體的花期差異可能與多個FLC位點的表達多樣性和拷貝數相關[32]。

AtFLC基因作為擬南芥開花抑制因子基因參與開花途徑的調控[33-34]。當AtFLC表達水平較低時，擬南芥春化途徑加快，開花基因的表達水平提高，從而花期提前[35]。自主開花途徑同樣能調節AtFLC的表達水平，從而影響擬南芥生長發育進程[34]。低溫脅迫能抑制菊花CmFLC表達水平，且低溫持續時間越長，抑制效果越明顯[30]。芍藥PoFLC基因轉到擬南芥植株后，異源過表達，轉芍藥PoFLC基因的擬南芥植株營養生長期更長，葉片與莖等營養器官更健壯，且抽薹、開花時間明顯晚于野生型植株，表明PoFLC在延遲開花上發揮著重要作用[36]。本研究通過對胡蘿卜DcFLC基因進行克隆以及表達特性分析，明確了胡蘿卜DcFLC蛋白與其他轉錄因子的互作關系，但DcFLC基因對胡蘿卜開花的調控機制尚有待進一步研究。

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（責任編輯：石春林）