基于核心KASP標記的江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜構建

收稿日期：2024-04-27

基金項目：江蘇省自然科學青年基金項目（BK20210151）；江蘇省種質資源精準鑒定評價項目（005012691230229）

作者簡介：朱小品（1989-），女，河南商丘人，博士，助理研究員，主要從事水稻種質資源遺傳多樣性及種子休眠與萌發的生物學機理研究。（E-mail）zxp1028@126.com

通訊作者：顏 偉，（E-mail）yanwei@jaas.ac.cn

摘要： 為了建立江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜數據庫，本研究利用水稻10K液相芯片對314份來源廣泛的水稻種質資源進行SNP基因分型，篩選出一系列高多態性的SNP位點并開發出122個KASP標記。利用122個KASP標記對38份江蘇粳稻品種進行檢測，以多態性信息量（PIC）＞0.3，最小等位基因頻率（MAF）＞0.2，檢出率＞0.9為篩選標準，篩選出56個具有高效鑒別效率的核心KASP標記。遺傳距離相關性分析結果表明，基于56個核心KASP標記的江蘇粳稻品種的遺傳距離與基于122個高多態性KASP標記的的江蘇粳稻品種的遺傳距離相關系數為89.1%，呈極顯著正相關（P＜0.01），表明56個核心標記可以有效代替122個高多態性標記進行品種鑒定。進一步利用56個核心KASP標記對102份江蘇粳稻品種的遺傳多樣性進行分析，并構建了102份品種的DNA指紋圖譜和分子身份證二維碼，本研究結果為江蘇地區粳稻品種鑒定、選育和種質資源高效利用提供了參考。

關鍵詞： 水稻；KASP標記；DNA指紋圖譜；品種鑒定；遺傳多樣性分析

中圖分類號： S511.2 +2"" 文獻標識碼： A ""文章編號： 1000-4440（2024）09-1569-17

Construction of DNA fingerprint for japonica rice varieties in Jiangsu based on core KASP markers

ZHU Xiaopin， XU Tingting， MENG Shan， YANG Xue， YANG Xin， ZHU Yin， DI Jiachun， GUO Chunbin， WANG Ning， YAN Wei

（Institute of Germplasm Resources and Biotechnology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm/Jiangsu Key Laboratory for Agrobiology， Nanjing 210014， China）

Abstract： In order to establish the DNA fingerprinting database of japonica rice varieties in Jiangsu province， SNP genotyping was carried out in 314 rice germplasm resources by using GenoBaits rice 10K panel， a series of SNP loci with high polymorphism were screened and 122 KASP markers were developed. Thirty-eight japonica rice varieties in Jiangsu province were tested with 122 KASP markers， and 56 core KASP markers with high identification efficiency were selected with polymorphism information content （PIC）＞0.3， minor allele frequency （MAF）＞0.2， and detection rate ＞0.9 as screening criteria. The results of genetic distance correlation analysis showed that the correlation coefficient between the genetic distance of Jiangsu japonica rice varieties based on 56 core KASP markers and the genetic distance of Jiangsu japonica rice varieties based on 122 highly polymorphic KASP markers was 89.1%， showing a very significant positive correlation （P＜0.01）. The results indicated that 56 core markers could effectively replace 122 highly polymorphic markers for variety identification. The genetic diversity of 102 japonica rice varieties in Jiangsu province was further analyzed by using 56 core KASP markers， and the DNA fingerprints and molecular ID codes of 102 varieties were constructed. The results of this study provide a reference for the identification， breeding and efficient utilization of japonica rice germplasm resources in Jiangsu province.

Key words： Oryza sativa L.；KASP marker；DNA fingerprint；cultivar identification；genetic diversity analysis

水稻是中國主要的糧食作物之一，近年來，得益于育種技術的進步，水稻品種更新換代的速度不斷加快，全國每年審定的水稻新品種有上千個（中國種業大數據平臺）。然而，隨著育成品種數的日益增多，品種同質化問題日益凸顯，而真正具有突破性的新品種則相對稀缺。建立快速、高效、低成本的品種分子鑒定體系，有助于保護、篩選、利用種質資源，推進水稻品種原始創新，同時有利于維護育種者的權益。

傳統的品種真實性鑒定基于田間的表型性狀，數據調查、整理分析需要消耗大量的精力，且該方法周期長，易受環境影響，難以實現大規模快速鑒定[1]。DNA分子標記特異性強、穩定性高，不易受外界環境影響，是品種鑒定和遺傳分析強有力的工具[2]。DNA分子標記經歷了幾代的發展，目前已有數十種，如RFLP標記、RAPD標記、AFLP標記、SSR標記、SNP標記等[3]。其中SSR標記和SNP標記是最經典且應用最廣泛的2類分子標記，被國際植物品種權保護聯盟（UPOV）確定為構建DNA指紋數據庫的推薦標記[4]。

SSR標記存在難以實現高通量、數據整合復雜以及可選用標記分布有限等問題，這些問題限制了SSR標記技術在現代育種工作中的進一步應用和發展。相比之下，SNP標記具有分布廣泛、分布均勻、二態性等優點，更易實現高通量位點和高通量樣品的檢測，適于數據整合和共享[5-7]。2021年《水稻品種真實性鑒定SNP標記法》通過了農業行業審定[8]。目前，SNP標記已在水稻、小麥、玉米、豆類、棉花等主要作物品種鑒定以及遺傳多樣性分析中被廣泛應用[9-13]。全基因組重測序和基因芯片掃描是高通量檢測SNP位點的重要方法，但這兩種方法的檢測成本高，檢測得到的數據量龐大，需要高性能計算機進行存儲和分析，同時對檢測人員的數據分析能力要求較高。

基于等位基因特異性PCR的競爭性擴增技術（Kompetitive allele-specific PCR，KASP）在SNP分型方面具有高精度、低成本和高效率的優勢，并且該技術可以根據檢測群體設計特定的組合標記，也可以根據特定功能位點開發功能分子標記，檢測位點和檢測樣本具有很大的靈活性[14]。陸海燕等[15]利用玉米全基因組高密度SNP基因分型數據，篩選并開發202個 KASP標記，群體遺傳距離相關性分析和群體結構分析結果表明，202個高多態信息含量（PIC）的KASP標記可用于玉米種質資源的研究。 孫正文等[13]利用棉花CottonSNP63K芯片篩選出393個核心KASP標記并構建品種特異的分子指紋圖譜，表明KASP分子標記在棉花遺傳改良中具有廣泛的應用前景。以上研究結果表明，篩選高效KASP標記進行品種鑒定和遺傳多樣性分析，可以在降低成本的同時保證檢測準確性和靈敏度，是一種更經濟、高效的方案。

本研究利用水稻10K液相芯片對314份來源廣泛的水稻種質資源進行全基因組掃描，通過層層篩選，獲得了56個高多態性的核心KASP標記。基于56個KASP核心標記對102份江蘇粳稻品種的遺傳多樣性進行分析，構建了江蘇粳稻品種的DNA指紋圖譜數據庫和品種分子身份證二維碼。本研究結果將為江蘇地區粳稻種質資源的科學管理、高效利用以及品種鑒定和品種創新提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料均來自江蘇省農作物種質資源中期庫，主要為江蘇地區的主要水稻品種，包括南粳系列、淮稻系列、徐稻系列、鎮稻系列、武運粳系列、武育粳系列、武香粳系列、鹽稻系列、鹽粳系列以及揚粳系列等102份江蘇地區種植的主要水稻品種，具體品種名稱和育成單位信息如表1所示。

1.2 SNP位點篩選及KASP標記開發

利用博瑞迪開發的10K液相芯片對314份水稻種質資源進行全基因組掃描，對得到的基因型數據進行過濾，以多態性信息含量（PIC）＞0.4篩選高多態性SNP位點，并根據SNP位點在染色體的分布情況，最終篩選出170個候選SNP位點，根據SNP位點側翼100～200 bp序列，使用網站http：//www.snpway.com/設計KASP引物，進行KASP標記篩選。KASP引物組合包含兩條特異性引物F1、F2和一條通用引物R，其中F1引物5′端連接與FAM熒光結合的特異性序列5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，用于檢測參考基因組上的等位基因；F2引物5′端連接與HEX熒光結合的特異性序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，用于檢測變異位點上的等位基因。

利用CTAB法提取水稻幼苗DNA，使用核酸微量測定儀進行DNA質量濃度測量和質量檢測，將DNA質量濃度稀釋至10～20 ng/μL。將稀釋的DNA轉到96孔PCR樣品板上，每板中2個孔加ddH2O作為對照（NTC）。KASP反應體系為：每孔0.8 μL DNA，每孔0.75 μL 2×KASP Master mix（LGC）+0.05 μL引物。KASP反應程序為：第一步，預變性94 ℃，15 min；第二步，變性94 ℃，20 s，復性/延伸61～55 ℃（每循環1次下降0.6 ℃），60 s，共10個循環；第三步，變性94 ℃，20 s，復性/延伸61～55 ℃，60 s， 26個循環。PCR反應結束后，利用IntelliQube（LGC）機器進行熒光數據讀取和分析。

1.3 數據分析

將102份水稻品種的基因型數據整理成HapMap格式，利用PowerMaker3.25軟件計算每個標記的最小等位基因頻率（MAF）、多態性信息量（PIC），利用TASSEL v5.0軟件的鄰接算法計算水稻品種間的遺傳距離，利用Figtree v1.4.3構建聚類圖。

在Excel中，根據基因分型結果，將每份材料的基因型進行數字化賦值，將 SNP 標記基因型分為AA、TT、CC、GG、 雜合、缺失6種情況，分別用1、2、3、4、0、9表示，在Excel中對基因型數據進行數字化賦值后，每份材料的基因型信息由一串56位數字構成，構建了每份材料的分子指紋數據，并利用在線軟件草料二維碼生成器（http：//cli.im/）將分子指紋數據生成分子指紋二維碼。

2 結果與分析

2.1 高多態性SNP位點篩選及KASP標記開發

利用博瑞迪開發的水稻10K液相芯片（GenoBaits rice 10K panel）對314份來源廣泛的水稻種質資源進行全基因組掃描，獲得了水稻基因組上分布的33 580個SNP位點。對獲得的總SNP位點進行過濾篩選，去除SNP缺失率＞10%，最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）＜0.05，樣本缺失率＞10%的位點，共篩選出20 260個高質量SNP位點，這些位點均勻分布在水稻基因組上。多態性信息量（PIC）可以衡量DNA分子標記在品種群體中的多態性，以PIC＞0.4為條件進行篩選，獲得了1 192個高多態性SNP位點作為候選位點。從1 192個候選SNP位點中篩選出位點前后100 bp均沒有其他變異位點的SNP位點，再結合染色體分布情況，最終篩選出170個高PIC的SNP位點用于KASP標記開發。170個SNP位點在基因組的分布情況如圖1A所示，SNP位點平均間隔2.2 Mb。

以Nip_MSU7.0為參考基因組，從基因組數據庫網站Jbrowse（https：//www.mbkbase.org/jbrowse/？data）下載170個高多態性SNP位點側翼100 bp的序列，利用KASP引物開發網站SNPWay（http：//www.gentides.cn/snpprimer/）設計KASP引物。為了檢驗KASP引物的有效性，選擇表1中前38份江蘇粳稻品種作為檢測群體，分析每個KASP標記的基因分型效果，圖1B中左上方和右下方聚集的點分別代表等位基因型和參考基因型，中間聚集的點代表雜合基因型，左下方的黑色點代表陰性對照（NTC）。最終從170個KASP標記中，篩選出122個準確性較高的KASP標記。

2.2 核心SNP位點篩選及KASP標記開發

為了進一步篩選在粳稻品種中高多態性的核心標記[16]。首先分析122個KASP標記對38份水稻種質資源的基因型分型結果，以最小等位基因頻率（MAF）＞0.20、多態性信息量（PIC）＞0.3、檢出率＞90%、雜合率＜5%為篩選標準，并結合KASP標記在染色體上的分布情況[15]，篩選出56個高PIC的SNP位點。56個SNP位點覆蓋了水稻基因組的12條染色體，平均間隔6.6 Mb（圖2A）。38份水稻種質資源中，這些位點PIC為0.34～0.50，平均值為0.47；利用這56個SNP位點開發出56個核心KASP標記（表2）。MAF為0.22～0.50，平均值為0.40（圖2B、圖2C）。

為驗證56個核心KASP標記對水稻品種的區分效率，利用122個高多態性的KASP標記和56個核心KASP標記對38份江蘇粳稻品種進行基因分型，計算品種間的遺傳距離。基于122個高多態性KASP標記，38份江蘇育成粳稻品種的兩兩遺傳距離為0.10～0.75，遺傳距離平均值為0.46，對38份粳稻品種的區分效率為100%。有696對粳稻品種間的遺傳距離小于0.7，占總對數的99%；有7對粳稻品種間的遺傳距離大于0.7，占總對數的1%（圖3A）。基于56個核心KASP標記，38份粳稻品種兩兩遺傳距離為0.09～0.75，遺傳距離平均值為0.47，對38份粳稻品種的區分效率為100%。有799對粳稻品種的品種間遺傳距離小于0.7，占總對數的98%；有11對粳稻品種的品種間遺傳距離大于0.7，占總對數的2%（圖3B），并且基于56個核心KASP標記的遺傳距離與基于122個高多態性KASP標記的遺傳距離呈極顯著線性相關（P＜0.01）（圖3C）。結果表明，56個核心KASP標記可以有效代替122個高多態性KASP標記進行品種鑒定，即56個核心KASP標記可以有效鑒定江蘇粳稻品種。

2.3 102份江蘇粳稻品種遺傳多樣性分析

利用56個核心KASP標記對102份江蘇粳稻品種進行基因分型，計算品種間的遺傳距離，利用鄰接法（Neighbor-joining method）構建該群體的聚類進化樹，結果顯示102份水稻品種可以被劃分為4個亞群，Pop1、Pop2、Pop3、Pop4（圖4）。Pop1亞群包含7份品種，其中有6份品種為武運粳3號衍生后代，主要為江蘇太湖和蘇南地區種植的品種，如南粳46、寧粳3號；Pop2亞群包含18份品種，主要為江蘇省蘇中及寧鎮揚丘陵地區推廣的品種，如揚育粳2號、武運粳24號；Pop3亞群包含20份品種，主要為江蘇省淮北地區大面積推廣品種，包括鹽粳和華粳系列；Pop4亞群包含57份品種，該亞群品種數目最多，其中桂花黃、秀水04、武育粳3號、鎮稻88為江蘇粳稻育成品種的早期骨干親本，系譜分析發現Pop4亞群主要為這些骨干親本及其衍生后代的粳稻品種。Pop4亞群中，徐稻3號（B66）、徐稻4號（B143）、徐稻7（B144）號、徐稻8號（B145）、連粳20（B87）、連粳6號（B100）、鎮稻99（B55）、寧粳4號（B101）等8份在江蘇淮北地區大面積推廣的粳稻品種均為鎮稻88（B35）的衍生后代；淮稻5號（B72）、淮稻6號（B44）、南粳51（B129）、南粳0212（B131）均和骨干親本武育粳3號有親緣關系。以上結果表明56個核心KASP標記能夠將不同品種的粳稻根據親緣關系進行聚類。

2.4 102份江蘇粳稻品種DNA指紋圖譜構建

根據56個核心KASP標記對102份江蘇粳稻品種的基因分型結果構建江蘇育成粳稻品種的特異DNA指紋圖譜數據庫。將 KASP標記基因型分為AA、TT、CC、GG、 雜合、缺失6種情況，分別用1、2、3、4、0、9表示，在Excel中對基因型數據進行數字化賦值后，每份材料的基因型信息由一串56個數字構成，如南粳9108的分子身份信息數字化表示為“14343411331142433413224421124142132331112343233222444243”，構建102份水稻品種的DNA指紋圖譜（表3）。對比102份粳稻品種的DNA指紋數據發現，56個KASP標記將102份粳稻品種分為102種特異單倍型，即可以將102份江蘇粳稻全部區分，區分效率達到100%。將分子身份證數據批量導入草料二維碼生成軟件（https：//console.cli.im/nedit？create_from=126）中，分別生成了102份水稻品種的分子身份證指紋圖譜二維碼，圖5展示了部分粳稻品種的分子身份證二維碼。

3 討論

種質鑒定是種質保存和新品種審定的重要環節[17-19]，建立快速、準確的品種鑒定體系對種質鑒定具有重要意義。利用DNA指紋技術[20]可以實現品種的快速、準確鑒定，該技術在種質鑒定和產權糾紛中發揮重要作用。此外，通過DNA指紋鑒定技術，不僅可以有效鑒別出種質庫中的重復種質資源，還可以快速、準確地進行種質資源的鑒定與評價，大大提高種質資源的保存質量與利用效率[21]。

SSR和SNP分子標記為國內外公認的農作物DNA指紋鑒定技術，SSR標記的基因分型過程包括PCR擴增、凝膠電泳和銀染或熒光檢測等多個步驟，操作繁瑣且耗時較長，特別是在高通量檢測中，需要同時分析大量樣本，傳統SSR基因分型方法無法滿足這種需求[22]。SNP位點在基因組中分布廣泛，隨著測序技術的發展，SNP位點的檢測方法也越來越多樣。全基因組測序可以對品種進行準確鑒定，但重測序文庫的建立成本較高，且數據量龐大，對研究人員的數據分析能力要求更高[23]。芯片微陣列技術可以檢測全基因組SNP位點，但是其檢測成本較高，在品種鑒定中不夠靈活。與其他SNP檢測方法相比，KASP技術靈活性較高，且檢測成本低[24]。近年的研究結果表明，提取核心SNP位點可以實現對品種的有效鑒定[16]。魏中艷等[25]利用12個高多態性KASP標記與2個特異等位變異KASP標記組成了大豆核心標記組合GlySNP14，利用GlySNP14對599份大豆種質進行鑒定，其中100份大豆種質能被準確區分，表明確定核心KASP標記可以降低鑒定成本，同時保證鑒定的準確性。

由于同一種植區往往集中利用少數骨干優良親本進行育種，導致遺傳背景狹窄，育成品種同質化嚴重，因此需要建立特定區域育成品種的分子指紋圖譜，一方面可以鑒定種質的真實性，另一方面也可以為親本選擇提供指導[26-27]。江蘇地區作為中國主要的粳稻栽培區，具有悠久的種植歷史和豐富的種質資源。構建江蘇地區粳稻品種DNA指紋圖譜，有助于提高品種鑒定的準確率和效率，避免傳統鑒定方法中的主觀性和誤差，同時也有助于發掘和利用江蘇地區的優良種質資源，推動粳稻產業的可持續發展。

4 結論

本研究利用10k液相芯片對314份遺傳多樣性豐富的粳稻種質資源進行全基因組掃描結果，篩選出170個在12條染色體均勻分布、高多態性的SNP位點，其中根據122個SNP位點設計出122個KASP標記。以38個江蘇主要育成粳稻品種作為檢測群體，篩選出56個核心KASP標記。遺傳距離相關性分析結果表明，基于56個核心KASP標記的江蘇粳稻品種遺傳距離與基于122個高多態性KASP標記的江蘇粳稻品種遺傳距離呈極顯著線性相關（P＜0.01），表明56個核心KASP標記可以有效代替122個高多態性KASP標記進行品種鑒定，大大降低了檢測成本。利用56個核心KASP標記對江蘇102份主要育成粳稻品種進行品種檢測，發現56個標記組合在102份品種中可以形成102個特異的單倍型，說明102份材料能夠被完全區分，表明56個核心KASP標記可以有效區分江蘇區域的粳稻品種，同時56個核心KASP標記可以用于江蘇粳稻分子指紋數據庫構建。本研究結果對江蘇地區粳稻品種的高效鑒定和資源高效利用具有重要意義。

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（責任編輯：成紓寒）