內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病常見病原微生物的PCR檢測分析

摘要：為研究內(nèi)蒙古通遼地區(qū)規(guī)模化肉牛養(yǎng)殖場犢牛呼吸道疾病的致病性微生物，從當(dāng)?shù)刂饕B(yǎng)殖場采集93例患呼吸道疾病犢牛的鼻拭子、肛拭子樣品，細(xì)菌分離鑒定和PCR檢測分析。共75份樣品檢出病原微生物，檢出率為80.65%，不同飼養(yǎng)方式犢牛的檢測結(jié)果顯示，散欄和全舍飼犢牛的檢出率分別為73.58%和87.80%。其中9份檢測出支原體感染，檢出率為9.68%；73份檢測出沙門氏菌感染，檢測率為78.49%；7份檢測出兩種病原微生物，混合感染占比為80.65%。內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病的主要病原微生物包括支原體和沙門氏菌，且全舍飼犢牛檢出率較散欄犢牛更高，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)應(yīng)當(dāng)通過綜合防控手段減少犢牛呼吸道疾病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：內(nèi)蒙古通遼地區(qū)；犢牛；呼吸道疾病；沙門氏菌；支原體；PCR檢測

通遼市是我國重要的肉牛生產(chǎn)基地，有“中國草原肉牛之都”的美稱，據(jù)統(tǒng)計，2022牧業(yè)年度全市肉牛存欄達(dá)367.29萬頭，同比增長10.47%，約占全區(qū)肉牛存欄總量的25%、全國的3%。為全力打造“全國肉牛產(chǎn)業(yè)第一重鎮(zhèn)”，通遼地區(qū)肉牛養(yǎng)殖模式不斷向著集約化、規(guī)模化的方向邁進(jìn)，但隨著牛只運(yùn)輸、交易頻繁，傳染性疾病的發(fā)病率也逐年提升，據(jù)部分養(yǎng)殖場（奈曼旗昂奶養(yǎng)殖基地、扎魯特旗百順養(yǎng)殖合作社、科左中旗巴彥塔拉潤來福養(yǎng)殖合作社等）和養(yǎng)殖戶（分布在科左中旗、科爾沁區(qū)、扎魯特旗、科左后旗）的調(diào)查數(shù)據(jù)表明，犢牛呼吸道疾病的發(fā)病率約為30%，其中遷延不愈或常規(guī)抗生素治療無效果的病例占發(fā)病犢牛一半以上，因發(fā)生犢牛呼吸道疾病而死亡的犢牛死亡率約為20%，這一疾病已對本地區(qū)的肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。本試驗對內(nèi)蒙古通遼地區(qū)患病犢牛進(jìn)行致病菌分離及鑒定，確定當(dāng)?shù)刂гw和沙門氏菌的流行情況，為治療提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗地點和樣品

2021年6月—2022年6月，在內(nèi)蒙古通遼地區(qū)主要養(yǎng)殖場，從200頭犢牛呼吸道疾病發(fā)病病例中進(jìn)行樣品采集，采集樣品前，對采集器械和人員消毒，采用無菌棉簽采集患病犢牛鼻腔深部的鼻液樣本、肛門內(nèi)的糞便樣本，共采集了93份鼻拭子和93份肛拭子作為試驗樣本，樣本放入裝有預(yù)冷PBS的離心管中，低溫采樣箱運(yùn)送至實驗室，4 ℃保存待測。

1.2 試驗材料

牛支原體固體培養(yǎng)基和SS瓊脂平板培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收膠、DNA Marker，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（LDBX-50 KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；全溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F 160），常州易晨儀器制造有限公司；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 5430 R），Sigma公司；Nikon YS-100型顯微鏡，日本Nikon公司；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

1.4 試驗方法

1）病原微生物分離純化。將臨床采集的鼻拭子、肛拭子樣品，無菌條件下分別接種于普通營養(yǎng)肉湯和牛支原體固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18～24 h。顯微鏡下觀察菌落生長形態(tài)，挑取形態(tài)典型的單個菌落進(jìn)一步純化擴(kuò)增培養(yǎng)。

2）病原微生物PCR鑒定。挑取上步純化后的待測病原微生物單菌落，分別接種于LB肉湯和牛支原體液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12～16 h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟，提取細(xì)菌總DNA，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩８鶕?jù)特有16Sr RNA基因序列特征，運(yùn)用通用引物序列（見表1）進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系如表2所示，PCR反應(yīng)運(yùn)行參數(shù)如表3所示。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，以DL2000 DNA Marker對照，將擴(kuò)增產(chǎn)物按DNA膠回收試劑盒說明書步驟操作回收后，送至上海生工生物有限公司測序。測序結(jié)果提交到NCBI，通過BLAST比對確定細(xì)菌種屬，選擇同源性大于98%的細(xì)菌菌種確定細(xì)菌種類。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 病原微生物檢出結(jié)果

本試驗對內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病病例進(jìn)行病料采集，經(jīng)分離培養(yǎng)、純化和PCR檢測分析后，在送檢的樣品中有75例檢出病原微生物，檢出率80.65%，包括52份舍飼犢牛樣品和41份散欄飼養(yǎng)犢牛樣品，散欄和全舍飼犢牛的檢出率分別為73.58%和87.80%（表4）。9份檢鼻拭子樣品中檢測出支原體感染，檢出率為9.68%；73份肛拭子樣品中檢測出沙門氏菌感染，檢測率為78.49%；7份檢測出兩種病原微生物，混合感染占比為80.65%（表5）。

2.2 PCR檢測結(jié)果

試驗采集樣品通過PCR檢測，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別出現(xiàn)439和1 500 bp的特異性DNA條帶（見圖1）。

3 分析與討論

牛的肺部和鼻咽處的微生物群在成分上相似度很高，因此，采集鼻拭子后進(jìn)行分析能夠很好地了解牛呼吸道內(nèi)微生物群或病原感染的情況[1]。由上文可知，致病性微生物感染是引發(fā)通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病的主要因素。本試驗檢測93份鼻拭子樣品，其中75份樣品檢出病原微生物，檢出率80.65%，在飼養(yǎng)方式方面，散欄和全舍飼犢牛的檢出率分別為73.58%和87.80%，說明以全舍飼方式飼養(yǎng)的犢牛在該地區(qū)呼吸道疾病發(fā)病過程更嚴(yán)重，結(jié)合養(yǎng)殖場現(xiàn)場流調(diào)觀察，這可能是由于全舍飼方式飼養(yǎng)牛群的活動空間較為狹小，牛群過于集中，再加上糞便污物等沒能得到及時處理，導(dǎo)致病原微生物傳播率高。

除環(huán)境因素和飼養(yǎng)管理的影響外，約90%以上犢牛呼吸道疾病主要由多種病原微生物單獨(dú)或混合感染引起，且由于通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病的臨床表現(xiàn)以遷延不愈且常規(guī)抗生素治療效果不明顯為主，進(jìn)而推測本地區(qū)導(dǎo)致犢牛呼吸道疾病的病原可能不是細(xì)菌或?qū)ΤＲ?guī)抗生素已產(chǎn)生耐藥性。王峰等[2]在榆樹地區(qū)分離得到牛支原體流行株，對諾氟沙星、阿奇霉素、阿莫西林、洛美沙星以及紅霉素等5種抗生素耐藥；孟凡艷等[3]在塔城地區(qū)某奶牛場分離得到3株支原體，均對替米考星、環(huán)丙沙星、吉他霉素、泰洛星表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。本試驗通過分離鑒定和PCR檢測分析結(jié)果顯示，93份鼻拭子樣品中9份檢測出支原體感染，檢出率為9.68%；73份檢測出沙門氏菌感染，檢測率為78.49%；7份檢測出兩種病原微生物，混合感染占比為80.65%。提示在養(yǎng)殖中混合感染更普遍。

筆者認(rèn)為，犢牛呼吸道疾病的發(fā)生除病原微生物的感染外，還和轉(zhuǎn)群調(diào)運(yùn)、混合飼養(yǎng)、環(huán)境衛(wèi)生條件差、毒素攝入、天氣驟變等諸多誘發(fā)應(yīng)激的因素有關(guān)。故犢牛呼吸道疾病的防治一方面需大力控制環(huán)境中的病原微生物菌群，另一方面需積極避免犢牛應(yīng)激反應(yīng)，提高犢牛抵抗力。中藥中含有多糖、生物堿、有機(jī)酸、揮發(fā)油等有效成分，存在抑制有害微生物、提高機(jī)體免疫力，調(diào)節(jié)犢牛呼吸道菌群失調(diào)等作用。結(jié)合多年獸醫(yī)臨床經(jīng)驗，在犢牛在轉(zhuǎn)群調(diào)運(yùn)后或季節(jié)交替時，可使用黃芪多糖、電解多維等藥物提高機(jī)體的免疫力，以達(dá)到預(yù)防疾病的目的。此外，麻杏石甘散、甘膽口服液等藥物在治療犢牛呼吸道疾病中也有一定的積極效果，可減少治療中抗生素的使用，值得在基層肉牛產(chǎn)業(yè)進(jìn)行推廣。

4 小結(jié)

綜上所述，導(dǎo)致通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病的病原微生物有支原體和沙門氏菌，其中散欄飼養(yǎng)的犢牛發(fā)病率略低于全舍飼犢牛，80.65%的發(fā)病犢牛為支原體、沙門氏菌混合感染，因而造成了通遼地區(qū)犢牛呼吸道疾病的臨床表現(xiàn)以遷延不愈且常規(guī)抗生素治療效果不明顯為主。在防治方面，應(yīng)當(dāng)從提高機(jī)體抵抗力、減少環(huán)境中病原微生物兩個方面入手，不斷提升飼養(yǎng)管理水平，減少犢牛呼吸道疾病的發(fā)生與傳播。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳婭婷.甘膽口服液和麻杏石甘散對患BRD犢牛上呼吸道菌群的影響[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

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[3] 孟凡艷，王旭，吳桐忠，等.塔城地區(qū)某奶牛場牛支原體的分離鑒定及藥敏試驗[J].畜牧與獸醫(yī)，2023，55（3）：74-78.