某規?；翀鲋履膛Ｈ榉垦淄Ｈ殒溓蚓姆蛛x鑒定和藥敏實驗

摘要：某規?；翀鋈榉垦最l發，為探究引起奶牛乳房炎情況及分析原因，并制定防控方案。本研究采集某規?；翀龌寂R床型乳房炎的奶樣，采用常規微生物學方法，通過分離培養、純化、生理生化鑒定、PCR鑒定以確定種屬，然后采用紙片法對分離菌的藥敏特性進行分析。試驗結果表明，分離到4株停乳鏈球菌，藥物敏感性試驗表明該菌株對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星高度敏感；對紅霉素中度敏感；而對大觀霉素、慶大霉素、四環素、復方磺胺甲噁唑、林可霉素耐藥。牧場根據藥敏試驗結果，結合臥床管理、環境改善、擠奶設備檢修等措施，很快控制了本次疫情。

關鍵詞：停乳鏈球菌；分離鑒定；奶牛乳房炎；藥敏試驗

停乳鏈球菌是一種革蘭陽性球菌，通常以鏈狀或成對出現[1]。它可以透過身體的創傷、扁桃體或臍帶等路徑入侵動物體內的血流，造成菌血癥或敗血癥[2]。奶牛乳房炎是奶牛養殖過程中的常見病多發病之一，嚴重威脅母牛的產奶量和質量，該病通常由致病菌感染引發。據文獻報道，引發奶牛乳房炎的病原微生物多達200余種，當中以細菌為主，包括葡萄球菌、大腸埃希菌等20余種。停乳鏈球菌是引起乳房炎的一種，其引發的乳腺炎發生率占總發生率的10%～50%[3]。臨床上，這種疾病常造成乳房腫脹和血奶的出現。目前市場上尚無良好的預防治療手段，因此，及時準確地了解養殖場奶牛乳房炎的病原菌特性非常重要。

該規?；翀龀６喟l乳房炎病例，并且由于抗生素治療后會導致牛奶的廢棄，從而會使奶產量降低，提高飼養管理成本。為此，本試驗采集該牧場牛奶樣品，選擇常規微生物學方法，分離鑒定乳房炎奶樣中的病原并進行藥敏檢測，最后給該牧場給一個綜合性的防控方案，以便盡快控制該牧場乳房炎的發生。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品。病料來自新疆某規?；翀觯杉?0余頭奶牛乳房炎奶樣。

2）試劑。試驗所需主要藥品和試劑見表1。

3）儀器。試驗所用儀器見表2。

1.2方法

1）樣品采集。在采集樣本之前，先選取癥狀典型的乳房炎奶牛，先對乳頭進行消毒，然后將前5～10 mL的牛奶丟棄，最后在無菌條件下取出約5 mL左右奶牛乳液至15" mL無菌離心管中，4 ℃保存備用。

2）細菌分離純化。為了確保獲得準確的結果，純化過程要保證無菌條件。將奶樣混勻，加300 μL到LB肉湯中，并放至搖床中培養12 h。然后將培養好的菌液按照四區劃線。在其中挑取合適菌落，置于液體培養基中，放置在搖床中培養24 h。經過革蘭氏染色后，通過重復這些步驟，純化目的菌。

3）形態學觀察。將菌液均勻涂在載玻片上，使用革蘭染色法，放至顯微鏡下觀察。

4）PCR鑒定。分離菌純化后，采用特異性引物，引物序列見表3，進行PCR反應。PCR反應體系見表4，反應程序見表5。

5）生化鑒定。在進行細菌分離和純化擴增之后，將取得的菌液接種于過氧化氫酶（CAT）、VP、水楊素、甘露醇、馬尿酸鹽水解酶、乳糖和精氨酸雙水解酶等酶系統中，并在37℃的溫箱中培養36～48 h，以觀察它們的生化特性。

6）藥敏試驗。將培養好的菌液使用紙片法進行藥敏試驗。取100 μL稀釋菌液涂布于瓊脂平板上，待菌液干燥后貼上藥敏試紙，于37 ℃恒溫箱培養24 h。記錄抑菌環直徑，藥敏試驗結果取平均值，據此判斷對不同藥物的敏感程度。所用常見10 類抗生素包括β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、酰胺醇類、喹諾酮類、磺胺類、大環內酯類、林可酰胺類、硝基呋喃類。

2 結果與分析

2.1平板培養結果

經過24 h的培養，細菌呈現出了圓柱狀，表面光滑，凸出，呈β溶血環狀（圖1）。

2.2 形態學觀察結果

挑取菌落，純菌培養，經過革蘭氏染色，顯微鏡下呈陽性，成雙，單個，短鏈排列，見圖2。

2.3 PCR鑒定結果

4株分離菌擴增片段大小與目的條帶405bp大小一致（圖3），經GenBank對比，該基因與NCBI數據庫上多數停乳鏈球菌基因同源率高達98%以上，因此確定該菌為停乳鏈球菌。

2.4 生化鑒定結果

4株分離株的生理生化特性經過CAT、CAMP、VP等實驗測定，該分離菌與停乳鏈球菌生化特性相同，試驗結果見表6。

2.5" 藥敏試驗

4株分離菌如表7所示，菌株均對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星敏感度高；對羅紅霉素敏感度中等；對大觀霉素、慶大霉素、四環素、復方磺胺甲噁唑、林可霉素表現出耐藥性。

3 分析與討論

奶牛乳房炎是奶牛生產中常見的疾病，嚴重影響著乳品質量和養殖效益[5]。本研究針對該規?；翀鲋信Ｈ旱娜榉垦走M行了病原菌的分離與鑒定。通過結果，可以更好地了解該疾病的病原菌種類和感染情況，為制定針對性的防治措施提供依據。

停乳鏈球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一，其對奶牛乳房組織的侵害能力較強，容易引發炎癥反應，并且具有非常強的傳染性和環境性的特性[6]。盡管目前尚無商品化的有效預防疫苗。但是通過藥敏試驗和一定的預防手段，可以控制和減少停乳鏈球菌乳房炎的發生。停乳鏈球菌通過多種代謝途徑對抗生素產生耐藥，對一些常見的抗菌藥物產生耐藥的機制主要是由于攜帶大量耐藥基因[7]。藥敏試驗表明該牧場致奶牛乳房炎主要致病菌停乳鏈球菌對該菌株對青霉素、氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、敏感度高；對羅紅霉素敏感度中等；對大觀霉素、慶大霉素、四環素、復方磺胺甲噁唑、林可霉素表現出耐藥性。耐藥性的出現可能與抗生素的濫用或者誤用有關，因此，合理使用抗生素并制定科學的防控策略是防止停乳耐藥性進一步擴散的關鍵。通過了解鏈球菌的藥敏特性對于選擇合適的治療方案至關重要。通過藥敏試驗結果，為該牧場提供合理、科學用藥，取得了較好的效果。

綜上所述，本研究通過分離、鑒定和藥敏試驗對該規模化牧場中奶牛乳房炎致病菌進行了初步研究，為控制乳房炎提供了重要的數據支持。

參考文獻：

[1] 楊移斌，楊秋紅，劉永濤，等.俄羅斯鱘源停乳鏈球菌停乳亞種分離、鑒定及藥敏特性研究[J].中國預防獸醫學報，2017，39（9）：717-721.

[2] 張瑞華，高善頌，龐天津，等.狐貍源停乳鏈球菌類馬亞種的分離鑒定和耐藥性分析[J].中國獸醫雜志，2022，58（12）：31-35.

[3] AN R， GAO M， MENG Y， et al. Infective mastitis due to bovine-associated Streptococcus dysgalactiae contributes to clinical persistent presentation in a murine mastitis model[J]. Veterinary Medicine and Science，2021，7（5）：1600-1610.

[4] 刁巧虹. 奶牛乳房炎常見致病菌檢測方法的建立[D].華南農業大學，2020.

[5] 苗艷濱.奶牛乳房炎診斷與治療的研究[J].現代畜牧科技，2024（3）：99-101.

[6] 牟小青，楊峰，武小虎，等.牛源停乳鏈球菌研究進展[J].中獸醫醫藥雜志，2023，42（1）：34-40.

[7] 陳娟.ErmB 導致大環內酯耐藥的機制研究[D].華中農業大學，2017.