紫錐菊提取物對雞腸道黏膜免疫功能的影響

摘要：為了探究紫錐菊提取物對雞腸道黏膜免疫功能的影響，通過測定腸道黏膜免疫指標SIgA、CD4、CD8和細胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）的含量，進行評估紫錐菊提取物的免疫效能，同時測定免疫器官指數和小腸V/C值。試驗結果表明，紫錐菊提取物對于雞腸道黏膜免疫功能具有明顯的促進作用，尤其紫錐菊提取物濃度在8 g/kg時，效果更加明顯。紫錐菊提取物還可以促進免疫器官指數提升，促進腸道吸收營養物質，進而提升雞的生長速度。

關鍵詞：紫錐菊；腸道黏膜免疫；細胞因子；免疫器官指數

紫錐菊（echinacea purpurea），又稱“松果菊”，屬于多年生菊科草本植物，紫錐菊作為一種免疫調節劑近年來在國際上受到普遍的重視，是被世界公認的天然抗菌、抗病毒藥用植物。紫錐菊可增強機體特異性免疫和非特異性免疫，促進淋巴細胞和巨噬細胞發育，刺激機體細胞因子分泌和抗體的產生。有研究報道表明紫錐菊可以增強豬、幼犬、水貂的免疫功能和生長性能[1-4]，提高家禽疫苗的免疫效果[5]，而紫錐菊對于家禽腸道黏膜免疫的研究較為缺乏，腸道黏膜免疫是黏膜免疫系統的重要組成部分，腸道黏膜含有豐富的淋巴組織和免疫細胞，腸道上皮固有層 T 細胞多為 CD4+，多數具有活化的效應 T 細胞或記憶性 T 細胞的功能[6]，由此可見，腸道黏膜免疫對機體免疫系統功能的正常維持至關重要，為動物機體抵抗病原微生物發揮著重要的作用。本研究中，闡述了紫錐菊提取物對雞腸道黏膜免疫功能的影響，推動中獸藥對黏膜免疫系統的探究。

1 材料

紫錐菊提取物由廣東梅州職業技術學院博士工作站制備；4%多聚甲醛通用型組織固定液購自蘭杰柯科技有限公司；酶標儀購自美國 BioTek 公司；洗板機購自美國賽默飛公司；組織切片機購自益迪醫療設備有限公司；低溫組織破碎勻漿儀購自上海凈信事實業發展有限公司；Chicken Interferon γ（IFN-γ）ELISA Kit（CH50001）、Chicken Interleukin 2 （IL-2）ELISA Kit （CH50013）、Chicken Interleukin 4 （IL-4）ELISA Kit （CH50006）、Chicken Cluster Of Differentiation 4 （CD4） ELISA Kit （CH50083）、Chicken Cluster Of Differentiation 8 （CD8）ELISA Kit （CH50095）、Chicken secretory immunoglobulin A（SIgA） ELISA Kit （CH50008）購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

2 方法

2.1 實驗分組與設計

將1日齡雞苗100只隨機分為4組，低劑量組、中劑量組、高劑量組、空白對照組，每組25只，三個實驗組飼喂不同濃度含量的紫錐菊提取物，濃度分別為2、4和8 g/kg，空白對照組飼喂生理鹽水。各組分別在給藥后第7、14、 21和28天隨機選取5只雞進行體重稱重，剖殺后摘取脾臟、法氏囊免疫器官稱重。分別采集十二指腸、空腸、回腸樣品約4 cm（采集位置：距離幽門口 2～3 cm 處采集十二指腸；空腸于空腸中段采集；距離回盲口 2～3 cm處采集回腸），取樣完畢后將樣品分為兩份，一份是將各段小腸儲存于4%多聚甲醛固定液中備用，用于制備石蠟切片，另一份是將各段小腸儲存無菌EP管中置于-80 ℃保存備用。

2.2 免疫器官指數測定

在給藥后第7、14、21和28天，每組隨機選擇 5 只雞進行稱重，稱重前禁食12 h，稱重后剖殺，摘取脾臟、法氏囊兩種免疫器官并及時稱重，防止因水分蒸發丟失所造成結果誤差。通過稱量脾臟和法氏囊的重量，計算出脾臟和法氏囊的免疫指數，計算公式如下：免疫器官指數（%）=免疫器官平均質量（g）/平均體質量（g）。

2.3 ELISA方法測定SIgA、CD4、CD8和細胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）的含量

將每次采集的小腸組織（十二指腸、空腸、回腸）混合后按要求使用低溫組織破碎勻漿儀進行研磨破碎，制備成10%小腸組織勻漿液，將小腸勻漿液收集于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，收集上清液于離心管內，隨后根據ELISA試劑盒操作說明進行操作，測定腸道組織中細胞因子（IFN-γ、IL-2 、IL-4） ，分泌型免疫球蛋白 A （SIgA） 和CD4、CD8的含量。

2.4 腸道切片制備及蘇木精-伊紅染色

選取小腸的空腸制作石蠟切片，按照說明書進行HE（hematoxylin-eosinstaining）染色（武漢塞維爾，G1001），用OLYMPUS 玻片掃描系統掃描HE切片全片，儲存圖像備用。

2.5 小腸形態學測量

用OlyVIA 軟件查看HE 切片圖像，選取結構層次清晰，染色均勻區域拍照，選取10根較為完整的小腸絨毛并用 Digimizer 圖像分析軟件測量小腸的絨毛高度及隱窩深度。絨毛高度是指絨毛頂端到絨毛隱窩交界處的距離，隱窩深度是指相鄰絨毛間的凹陷深度，并根據上述測量結果計算V/C值=絨毛高度/隱窩深度。

2.6 數據的統計分析

應用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行分析，數據以“平均值±標準差”表示，組間比較采用t檢驗分析，Plt;0.05表示差異顯著，Pgt;0.05表示差異不顯著。

3 結果

3.1 紫錐菊提取物對雞免疫器官指數的影響

口服紫錐菊提取物后通過稱量體重及免疫器官的質量初步反映各組雞的發育狀況及免疫功能強弱。圖1、圖2顯示中劑量組和高劑量組在不同時間點免疫器官指數均高于空白對照組（Plt;0.01），脾臟器官指數中顯示，高劑量組在不同時間點均高于中劑量組（Plt;0.01），低劑量組在給藥后第7、14、21天與空白對照組對脾臟器官指數的影響差異不明顯（Pgt;0.05）。法氏囊器官指數中顯示，在給藥后第28天時，低、中、高劑量組與空白對照組對法氏囊器官指數的影響差異顯著（Plt;0.05）。結果表明紫錐菊提取物有效促進機體及免疫器官發育。

3.2 SIgA、CD4、CD8和細胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ）的含量

腸道黏膜層中的 SIgA 是黏膜免疫功能的保障，也是主要的效應分子。圖3所示，各組的腸黏膜 SIgA 含量均呈現持續上升的趨勢，在給藥后第14、21、28天時，低、中、高劑量組SIgA含量水平高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.01），給藥后第28天時，高劑量組SIgA含量水平與中劑量組差異不顯著（Pgt;0.05），數據表明，紫錐菊提取物能夠有效增加腸道黏膜層中SIgA抗體的分泌。

IFN-γ、IL-2、IL-4是腸道黏膜中重要的細胞因子，對機體免疫系統起到

重要作用。圖4所示，在給藥后第21、28天時，低、中、高劑量組IFN-γ含量水平高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.01）。圖5所示，在給藥后第21、28天時，中、高劑量組IL-2含量水平高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.01），而低劑量組在給藥后第7、14、21天時，IL-2含量水平與空白對照組差異不顯著（Pgt;0.05）。圖6所示，在給藥后第28天時，低、中、高劑量組IL-4含量水平高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.01），而在給藥后第7天時，高劑量組IL-4含量水平高于其余各組，差異顯著（Plt;0.01）。數據表明，中、高劑量組的紫錐菊提取物能夠有效增加腸道黏膜免疫中IFN-γ、IL-2、IL-4三種細胞因子含量。

腸道黏膜免疫系統含有豐富的CD4、CD8，對于機體免疫系統起到積極作用。圖7所示，在給藥后第21、28天時，中、高劑量組CD4含量水平高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.01），而低劑量組在給藥后第7、14天時，CD4含量水平與空白對照組差異不顯著（Pgt;0.05）。圖8所示，只有高劑量組在給藥后第21、28天時，CD8含量水平遠高于其余各組，差異顯著（Plt;0.01）。數據表明，紫錐菊提取物能夠增加腸道黏膜免疫中CD4含量，而高劑量組能夠顯著增加CD8含量。

3.3 小腸形態學測量結果

空腸是小腸中吸收物質的主要部位，本試驗選取空腸段作為數據測量，而絨毛高度和隱窩深度的比值經常與動物的生長速度呈正相關，隱窩深度可反映腸道干細胞活性和功能。圖9所示，在給藥后第21、28天時，低、中、高劑量組V/C值高于空白對照組，差異顯著（Plt;0.05），數據表明，紫錐菊提取物對雞的生長起到良好的促進作用。

4 討論

腸道黏膜免疫是由免疫細胞和腸道相關淋巴組織參與構成機體免疫防御的第一道防線，當腸道黏膜受到抗原刺激后，其黏膜內的免疫細胞和淋巴組織產生免疫應答并分泌細胞因子和免疫球蛋白，以抵御腸道內病原微生物的入侵[7]。本試驗主要通過測定SIgA和幾種常見細胞因子水平來說明紫錐菊提取物對于腸道黏膜免疫的影響。SIgA在腸道黏膜免疫中具有免疫排斥、抗原呈遞和與腸道共體相互等作用，同時SIgA在維持腸道黏膜免疫、預防腸道感染方面發揮著關鍵的作用[8-10]，實驗數據表明，在飼喂紫錐菊提取物7天之后，SIgA抗體水平明顯地提升。

IL-2可以調節T細胞發育和誘導CD8+和CD4+ T細胞增殖的細胞因子，具有增加細胞溶解活性、促進抗體產生、B細胞增殖等功能[11-13]。IL-4是Th2分泌的細胞因子，具有刺激活化B細胞和T細胞增殖、CD4+ T細胞分化成Th2細胞的功能，在調節體液免疫和適應性免疫中具有重要作用[14-15]。實驗數據表明，紫錐菊提取物對于腸道黏膜免疫中IL-2、IL-4分泌具有促進作用，尤其飼喂8g/kg濃度對于IL-4含量提升效果更加明顯。本次實驗選擇測定的細胞因子主要是促進免疫系統功能，對于IL-6、IL-10反映炎性指標的細胞因子未涉及，下一步將人為制造高溫應激環境，探索紫錐菊提取物對于炎性因子的影響。

紫錐菊提取物對于免疫器官指數也有明顯作用，免疫器官指數越高，相應的免疫功能越高，試驗中選擇測定脾臟和法氏囊的器官指數，而忽略胸腺，主要因為雛雞胸腺較小，腺體周圍組織較難清除，影響結果。實驗數據表明，紫錐菊提取物對于家禽免疫功能具有明顯的促進作用，這與李全成[16]研究飼料中添加紫錐菊提取物可以提高仔豬平均日增重，降低料肉比，同時還可以提高仔豬血清中免疫球蛋白的含量，提高免疫機能相吻合。

關于小腸形態學測量中，絨毛長度（V）和隱窩深度（C）都是小腸生長和營養吸收的重要指標，V/C比值反映了小腸的功能狀態，V/C比值的降低表明營養吸收較少，動物生長較緩慢。數據表明，紫錐菊提取物能明顯提高小腸吸收能力，促進動物生長。

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