血流感染診斷生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

摘要：目的 通過(guò)生物信息學(xué)與機(jī)器學(xué)習(xí)識(shí)別血流感染（blood stream infections， BSI）患者的相關(guān)診斷生物標(biāo)志物、發(fā)病機(jī)制及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平，尋找新的藥物靶標(biāo)。方法 從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中獲取了BSI相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。使用R語(yǔ)言進(jìn)行差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）篩選，然后進(jìn)行基因富集分析。使用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）篩選的關(guān)鍵模塊基因。通過(guò)使用兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)識(shí)別中心基因。在外部數(shù)據(jù)集中使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）和箱線圖模型來(lái)驗(yàn)證中心基因的診斷效能。通過(guò)CIBERSORT反卷積算法分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平。結(jié)果 本研究得到了330個(gè)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵模塊基因和DEGs的交集基因?；蚋患治鼋Y(jié)果顯示，免疫和炎癥相關(guān)通路被顯著富集。通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和外部數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證共得到8個(gè)潛在生物標(biāo)志物，ROC分析顯示，8個(gè)潛在生物標(biāo)志物曲線下面積（area under curve，AUC）均大于0.9。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析表明，所有診斷標(biāo)生物標(biāo)志物都可能與免疫細(xì)胞有著不同程度的相關(guān)性。結(jié)論 通過(guò)生物信息學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，確定了潛在生物標(biāo)志物，并構(gòu)建了BSI診斷模型。本研究可以為BSI患者提供潛在的外周血診斷生物標(biāo)志物，為BSI發(fā)病機(jī)制、新型治療靶點(diǎn)和新藥研發(fā)提供新的方向。

關(guān)鍵詞：血流感染；生物信息學(xué)；機(jī)器學(xué)習(xí)；診斷生物標(biāo)志物；免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Prediction of biomarkers for diagnosis of blood stream infections and analysis of immune cell infiltration

Abstract Objective Use bioinformatics and machine learning to find diagnostic biomarkers， pathogenesis， and immune cell infiltration levels that are relevant to people with blood stream infections （BSI） and look for new drug targets. Methods A BSI-related gene expression dataset was obtained from the High-Throughput Gene Expression Omnibus （GEO） database. Use the R language to screen differentially expressed genes （DEG）， and then perform gene enrichment analysis. Key module genes were screened using weighted correlation network analysis （WGCNA）. Identify central genes by using two machine learning algorithms. Use receiver operating characteristic （ROC） curves and box plot models in external datasets to validate the diagnostic efficacy of central genes. Analyze immune cell infiltration levels using the CIBERSORT deconvolution algorithm. Results This study obtained the intersection genes of 330 weighted gene co-expression network key module genes and DEGs. The results of gene enrichment analysis showed that immune and inflammation-related pathways were significantly enriched. A total of 8 potential biomarkers were obtained through machine learning and external database validation. ROC analysis showed that the area under the curve （AUC） of all 8 potential biomarkers was greater than 0.9. Immunocyte infiltration analysis indicates that all diagnostic biomarkers may have varying degrees of correlation with immune cells. Conclusion Through bioinformatics and machine learning methods， potential biomarkers were identified and a blood flow infection diagnosis model was constructed. This study can provide potential peripheral blood diagnostic biomarkers for patients with bloodstream infections and provide new directions for the pathogenesis of bloodstream infections， new treatment targets， and new drug development.

Key words Bloodstream infection; Bioinformatics; Machine learning; Prediction of biomarkers; Immune cell infiltration

血流感染（blood stream infections，BSI）是一種嚴(yán)重感染性疾病，是臨床多發(fā)病之一，指細(xì)菌、真菌等病原微生物通過(guò)受損的皮膚屏障侵入血液循環(huán)，在機(jī)體血液中繁殖并隨著血液循環(huán)播散于全身，引起全身播散性感染，進(jìn)而引起全身炎癥，臨床上常將敗血癥、菌血癥稱為血流感染[1-2]。它具有較高發(fā)病率和死亡率，有研究表明細(xì)菌性血流感染患者病情發(fā)展迅速，可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生感染性休克，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡[3]。因此快速檢測(cè)和及時(shí)使用抗菌及抗炎藥物對(duì)病情的進(jìn)一步發(fā)展有著重要的作用。據(jù)報(bào)道，全球每年約有150萬(wàn)BSI患者死亡。BSI作為全球第七大死因，10萬(wàn)人口中每年平均因BSI死亡高達(dá)29例，診斷后的病死率在13%至20%之間[4]。為了最大限度地提高BSI的治療效果，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療至關(guān)重要。

免疫系統(tǒng)是人體的防御系統(tǒng)，旨在保護(hù)身體免受病原體（如細(xì)菌、病毒、真菌等）的侵害[5]。當(dāng)免疫系統(tǒng)檢測(cè)到病原體存在時(shí)，它會(huì)啟動(dòng)一系列免疫反應(yīng)，以試圖清除病原體并阻止感染的進(jìn)一步發(fā)展，全身免疫反應(yīng)在BSI的病因和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[6]。在BSI初期，免疫反應(yīng)包括免疫細(xì)胞的激活和炎性介質(zhì)的釋放，有助于清除病原體[7]。隨著B(niǎo)SI的進(jìn)一步發(fā)展，免疫系統(tǒng)受到抑制，表現(xiàn)為免疫細(xì)胞的功能和數(shù)量下降，病情逐步惡化[8]。

越來(lái)越多的研究表明，BSI的發(fā)病機(jī)制涉及免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和炎癥途徑的激活。特征識(shí)別受體是固有免疫細(xì)胞感知危險(xiǎn)的主要途徑，主要包括胞外模式識(shí)別受體：TOLL樣受體（TOLL-like receptor，TLR）和胞內(nèi)模式識(shí)別受體：NOD樣受體 （NOD-like receptor，NLR）。TLR能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）并參與免疫防御[9]。當(dāng)識(shí)別到入侵病原體時(shí)，通過(guò)與下游效應(yīng)器MyD88的相互作用，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）途徑[10]，調(diào)控白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而參與炎癥調(diào)控過(guò)程[11]。宿主免疫反應(yīng)和病原體抗原都會(huì)引發(fā)細(xì)胞損傷或誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）的釋放，加劇炎癥反應(yīng)[12]。NLR作為胞內(nèi)受體，能識(shí)別高度保守的細(xì)菌細(xì)胞壁成分肽聚糖以及DAMP，并誘NF- κB激活，促使炎癥反應(yīng)[13-14]。

目前，血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)[15]，但其耗時(shí)長(zhǎng)，需要3～5 d或更長(zhǎng)時(shí)間，時(shí)效性差，且可能存在標(biāo)本污染情況，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差[16]。此外，也有研究表明，中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值可用于預(yù)測(cè)血流感染[17]，并有助于區(qū)分不同的致病菌種類，但臨床上并沒(méi)有將其作為明確的感染診斷標(biāo)志，并且確切的閾值還存在爭(zhēng)議[18]。近年來(lái)一些臨床研究發(fā)現(xiàn)降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎癥因子水平對(duì)血流感染的早期診斷和病情判定具有一定的臨床價(jià)值[19-20]，但它們也存在一些缺點(diǎn)，C反應(yīng)蛋白存在于單核巨噬細(xì)胞中，濃度較低，難以檢測(cè)。此外，降鈣素原很容易因手術(shù)和免疫治療等其他因素而升高，限制了其作為血流感染生物標(biāo)志物的應(yīng)用。

高通量測(cè)序是研究疾病基因表達(dá)變化和識(shí)別潛在的疾病相關(guān)基因以發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療方法的有用方法[21]，隨著計(jì)算能力的提高，各種機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能技術(shù)被廣泛用于從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別患者疾病的特征基因[22-23]。因此，本研究通過(guò)對(duì)血流感染患者和健康人的基因表達(dá)水平進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，并利用機(jī)器學(xué)習(xí)方法確定了BSI的診斷生物標(biāo)志物。通過(guò)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析研究了診斷生物標(biāo)志物與22種免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，以更深入地了解血流感染發(fā)生過(guò)程中涉及的分子免疫機(jī)制[24]。此外，越來(lái)越多的研究表明，新型診斷生物標(biāo)志物不僅有可能作為BSI預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，而且有潛力作為BSI免疫治療的新型前瞻性靶標(biāo)[25]。

1 材料與方法

1.1 RNA微陣列數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理

包含BSI患者和健康樣本的血液中全基因組基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）收集。使用R語(yǔ)言“sva”包對(duì)原始微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行批次效應(yīng)去除、背景校正、歸一化和對(duì)數(shù)變換處理[26]，并通過(guò)相應(yīng)的測(cè)序平臺(tái)注釋信息將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為基因Symbol，最后，獲得了包含108個(gè)樣本（89名BSI患者和19名健康人）的歸一化基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)（GSE64456）作為分析集[27]，包含94個(gè)樣本（51名BSI患者和43名健康人）的歸一化基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)（GSE33341）作為驗(yàn)證集[28]。本研究工作流程見(jiàn)圖1。

1.2 差異表達(dá)基因的鑒定

R（Version 4.3.1）軟件中的“l(fā)imma”包用于篩選BSI患者和健康人之間的差異表達(dá)基因[29]。以Plt; 0.05，|log2FC|gt;1作為篩選差異表達(dá)基因的閾值。

1.3 基因富集分析

通過(guò)分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（MSigDB，https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp），收集了京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因本體（gene ontology，GO）和HALLMARK基因集的基因列表?；蚣儺惙治觯℅SVA）是一種非參數(shù)無(wú)監(jiān)督的分析方法，用于評(píng)估基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)的KEGG基因集富集結(jié)果[30]??。使用R語(yǔ)言中的“ClusterProfiler”包進(jìn)行GO分析[31]，包括細(xì)胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process，BP）[32]。為了更直觀地了解高度富集的功能途徑的基因表達(dá)水平，使用基于HALLMARK基因集的基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）對(duì)所有基因進(jìn)行分析，GSEA[33]使用R語(yǔ)言“GSEABase”包分析，當(dāng)Plt;0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

本研究使用R語(yǔ)言“WGCNA”包構(gòu)建顯著性排名前10000個(gè)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[34]。首先，對(duì)樣本進(jìn)行聚類，以便發(fā)現(xiàn)可能存在的異常值。R語(yǔ)言 “pickSoftThreshold”函數(shù)用于計(jì)算軟閾值Power β，并根據(jù)無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)圖譜結(jié)構(gòu)R2大于0.8且平均連接度小于100為條件確定軟閾值Power β。然后將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（topology overlap matrix，TOM）來(lái)衡量基因的網(wǎng)絡(luò)連通性，同時(shí)降低噪音和假相關(guān)。通過(guò)采用平均層次聚類結(jié)合動(dòng)態(tài)樹(shù)剪切功能將具有相似表達(dá)模式的基因聚類成共表達(dá)模塊，設(shè)定共表達(dá)模塊最小基因數(shù)為30，用不同顏色表示聚類樹(shù)的分支，并計(jì)算基因共表達(dá)模塊與表型之間的相關(guān)性，將模塊與臨床特征聯(lián)系起來(lái)，確定與臨床表型高度相關(guān)的模塊。使用R語(yǔ)言“cor”函數(shù)計(jì)算模塊成員（module membership，MM）和基因顯著性（gene significance，GS），其計(jì)算公式如下：

式中，MM代表基因與模塊的相關(guān)性，GS代表基因與表型的相關(guān)性；x、y和z別代表基因表達(dá)量、模塊特征和表型；x、y分z別代表基因表達(dá)量平均值，模塊特征平均值和表型平均值，n代表樣本數(shù)量。

基因共表達(dá)模塊網(wǎng)絡(luò)中|MM|gt;0.8且|GS|gt;0.2的基因表明具有較強(qiáng)的模塊相關(guān)性和臨床相關(guān)性，被認(rèn)定為hub基因。利用Venny圖提取hub基因與DEGs的交集基因，用于下一步的機(jī)器學(xué)習(xí)篩選潛在診斷標(biāo)志物。

1.5 診斷標(biāo)志物的篩選和驗(yàn)證

機(jī)器學(xué)習(xí)[35]是一種新型的算法分析工具，本研究使用兩種二分類機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選了BSI的診斷生物標(biāo)志物：隨機(jī)森林（random forest，RF）和支持向量機(jī)-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）。RF是一種基于決策樹(shù)的集成學(xué)習(xí)算法，通過(guò)建立多個(gè)決策樹(shù)來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。每個(gè)決策樹(shù)都是由不同的樣本和特征隨機(jī)抽取得到的，然后這些決策樹(shù)的結(jié)果通過(guò)投票的方式得到最終的預(yù)測(cè)結(jié)果[36]。SVM是一種基于邊界的分類方法，它可以用于篩選與目標(biāo)變量最相關(guān)的特征。SVM通過(guò)在特征空間中尋找最大間隔超平面來(lái)實(shí)現(xiàn)分類，可以在訓(xùn)練集上最大化超平面與分類邊界之間的距離[37]。本研究中使用R中的“randomForest” R包來(lái)實(shí)現(xiàn)隨機(jī)森林篩選，使用R中的“e1071”包構(gòu)建 SVM 模型篩選關(guān)鍵基因。然后選擇兩種機(jī)器學(xué)習(xí)分類模型的共有結(jié)果作為潛在診斷標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了評(píng)估已確定的生物標(biāo)志物的診斷效能，使用GSE33341外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集繪制受試者工作特征曲線圖，并計(jì)算AUC來(lái)衡量算法的預(yù)測(cè)能力。通過(guò)Wilcoxon秩和雙側(cè)檢驗(yàn)法，計(jì)算BSI組和健康組間潛在診斷生物標(biāo)志物表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，進(jìn)一步驗(yàn)證診斷生物標(biāo)志物的基因表達(dá)水平。

1.6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

CIBERSORT是一種用于分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)的反卷積算法，并利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)估算基因表達(dá)譜并估計(jì)混合細(xì)胞群中成員細(xì)胞類型的豐度[38]。使用R語(yǔ)言“cibersort”包進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，并使用原始的CIBERSORT基因特征文件LM22（定義了22種免疫細(xì)胞亞型）來(lái)計(jì)算正常和BSI患者中22種免疫細(xì)胞的比例[39]。然后，使用“ggplot2”包繪制箱線圖以可視化各BSI患者與正常組相比在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)方面的差異。使用Spearman方法計(jì)算了已識(shí)別的潛在診斷生物標(biāo)志物與22種免疫細(xì)胞之間的相關(guān)系數(shù)，并構(gòu)建了相關(guān)性熱圖可視化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因鑒定

從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)獲取包含BSI患者和正常樣本的血液中全基因組基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)，GEO數(shù)據(jù)集的相關(guān)信息如表1所示，通過(guò)R語(yǔ)言“sva”包合并GSE64456數(shù)據(jù)集中兩個(gè)芯片測(cè)序數(shù)據(jù)并消除批次效應(yīng)、背景校正、歸一化和對(duì)數(shù)變換，結(jié)果見(jiàn)圖2A，2B。以Plt;0.05，|log2FC|gt;1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從GSE64456數(shù)據(jù)集中得到705個(gè)DEGs，其中包括505個(gè)上調(diào)基因和200個(gè)下調(diào)基因，使用火山圖來(lái)可視化DEGs，見(jiàn)圖2C。

2.2 基因富集分析

本研究通過(guò)對(duì)根據(jù)log2FC排序的所有基因進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），以研究生物信號(hào)通路，在HALLMARK基因集中分析識(shí)別出顯著富集（p.adjustlt;0.001）的前6個(gè)途徑：NF-κB介導(dǎo)的TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)（TNFA Signaling Via NFKB）、IL6-JAK-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)（IL6-JAK-STAT3 Signaling）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、缺氧（hypoxia）、補(bǔ)體（complement）、IL2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)（IL2 STAT5 Signaling），見(jiàn)圖3A。為了深入地了解DEGs在BSI進(jìn)展中的生物學(xué)功能，本研究進(jìn)行了GO功能和KEGG通路富集分析。在基因本體（GO）富集分析中顯示DEGs在生物過(guò)程（BP）中顯著富集于免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)信號(hào)通路（immune response-regulating signaling pathway）、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cytokine production）、免疫反應(yīng)的激活（activation of immune response）；在分子功能（MF）上顯著富集于：免疫受體活性（immune receptor activity）、細(xì)胞因子受體活性（cytokine receptor activity）、模式識(shí)別受體活性（pattern recognition receptor activity）；顯著富集的細(xì)胞成分（CC）有特殊顆粒（specific granule）、三級(jí)顆粒（tertiary granule）、分泌顆粒膜（secretory granule membrane），見(jiàn)圖3B。在基因集變異分析中，對(duì)各通路進(jìn)行歸一化評(píng)分，得到KEGG通路的GSVA評(píng)分，使用R語(yǔ)言“LIMMA”包對(duì)評(píng)分進(jìn)行差異分析，多條KEGG通路被顯著富集（p.adjustlt;0.001）：TGF-β信號(hào)通路、抗原處理和呈遞、原發(fā)性免疫缺陷、B細(xì)胞受體信號(hào)通路等，見(jiàn)圖3C～D。

2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)顯著性排名前10000的基因組成的89個(gè)BSI樣本和19個(gè)健康樣本進(jìn)行聚類分析，未觀察到異常值。然后，根據(jù)無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)圖譜結(jié)構(gòu)R2大于0.8且平均連接度小于100為條件，確定軟閾值Power β為11，以確保無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)具有生物學(xué)意義。通過(guò)平均層次聚類結(jié)合動(dòng)態(tài)樹(shù)剪切功能，將10000個(gè)基因分為6個(gè)模塊。通過(guò)對(duì)模塊和表型之間關(guān)系的仔細(xì)分析，揭示了橙色模塊（MEorange）和BSI表型之間最強(qiáng)的負(fù)相關(guān)聯(lián)系（cor=-0.9， P=8e-35），黑色模塊（MEblack）和BSI表型之間最強(qiáng)的正相關(guān)聯(lián)系（cor=0.88， P=7e-32），并選擇相關(guān)性最強(qiáng)的橙色模塊進(jìn)行進(jìn)一步分析，并根據(jù)|MM|gt;0.8且|GS|gt;0.2對(duì)模塊基因進(jìn)行篩選。最確定了1644個(gè)與BSI顯著相關(guān)的關(guān)鍵基因，見(jiàn)圖4。

2.4 診斷標(biāo)志物的篩選和驗(yàn)證

利用Venny圖比較DEGs和關(guān)鍵模塊基因的交集基因，共篩選出330個(gè)重疊基因，見(jiàn)圖5E。通過(guò)了兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)識(shí)別潛在生物標(biāo)志物：圖5A～B展示了SVM篩選出的重要性排名前20的關(guān)鍵基因；圖5C～D展示了RF篩選出的重要性排名前20的關(guān)鍵基因；最終得到從SVM篩選出的重要性排名前15的基因和RF篩選出的重要性排名前15的基因的11個(gè)交集基因，其中在驗(yàn)證集GSE33341中找到的8個(gè)基因（OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9）被認(rèn)定為潛在診斷生物標(biāo)志物，見(jiàn)圖5F。為了驗(yàn)證潛在診斷標(biāo)志物的診斷功效，在GSE13904驗(yàn)證集中，本研究使用R語(yǔ)言“rms”包繪制了潛在診斷生物標(biāo)志物的諾莫圖模型，用于BSI輔助診斷，8個(gè)潛在生物標(biāo)志物中，TLR5提供了最大的分類貢獻(xiàn)，而MMP9分類貢獻(xiàn)最小，見(jiàn)圖6A。通過(guò)決策曲線分析（Decision Curve Analysis，DCA）分析對(duì)諾莫圖復(fù)合診斷模型預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)為了減少檢測(cè)成本，逐步建立去除貢獻(xiàn)最小的生物標(biāo)志物的復(fù)合診斷模型，當(dāng)生物標(biāo)志物低于6個(gè)時(shí)，模型診斷效能開(kāi)始下降，最終構(gòu)建了包含OPLAH、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1和HK3在內(nèi)的6個(gè)生物標(biāo)志物的復(fù)合診斷模型，結(jié)果顯示，對(duì)比單個(gè)生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)效能，諾莫圖復(fù)合診斷模型提供了更好的臨床診斷效能，可有效對(duì)BSI患者和健康人進(jìn)行鑒別，見(jiàn)圖6B。通過(guò)構(gòu)建箱線圖可視化，BSI組潛在生物標(biāo)志物的表達(dá)量顯著高于健康組（P lt;0.001），見(jiàn)圖6C，通過(guò)進(jìn)行 ROC 曲線分析來(lái)檢查8個(gè)中心基因的診斷敏感性和特異性。結(jié)果表明，8個(gè)基因的AUCOPLAH=0.954、AUCRETN=0.959、AUCDYSF=0.954、AUCTLR5=1.000、AUCCKAP4L=0.953、AUCCEACAM1=0.973、AUCHK3=0.992、AUCMMP9=0.926，其中AUCTLR5=1.000，ROC曲線表明潛在生物標(biāo)志物具有高度診斷敏感性和特異性，同時(shí)具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，見(jiàn)圖6D。

2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

通過(guò)CIBERSORT算法，分別計(jì)算了健康人和BSI患者中22種免疫細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，與健康樣本相比，BSI患者中初始B細(xì)胞、靜息樹(shù)突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils）、靜息自然殺傷細(xì)胞、靜息CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫細(xì)胞豐度顯著下降（Plt;0.001），活性樹(shù)突狀細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞免疫細(xì)胞豐度顯著升高（Plt;0.001）。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，潛在生物標(biāo)志物與多種免疫細(xì)胞表現(xiàn)出顯著程度的相關(guān)性，其中靜息CD4+記憶T細(xì)胞表現(xiàn)為最強(qiáng)負(fù)相關(guān)，中性粒細(xì)胞表現(xiàn)為最強(qiáng)正相關(guān)，見(jiàn)圖7。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示了潛在生物標(biāo)志物對(duì)免疫微環(huán)境和免疫活性的影響。

3 討論

血流感染的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及生物過(guò)程多，大量研究表明，在BSI致病微生物中革蘭陰性菌占主導(dǎo)地位[40-41]，BSI通常是在免疫力下降、皮膚黏膜屏障被破壞或免疫功能受損等情況下，原本不能致病的微生物引發(fā)的感染和免疫抑制造成的[42]。持續(xù)的過(guò)度炎癥反應(yīng)和免疫抑制，以及難以恢復(fù)健康狀態(tài)的機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)是其病理生理過(guò)程的重要特征。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)，病原體首先被內(nèi)在免疫系統(tǒng)識(shí)別，引發(fā)炎癥反應(yīng)清除入侵的病原體，但失衡的促炎、抗炎反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞因子紊亂和免疫抑制，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)受損，造成嚴(yán)重的組織損傷和器官功能障礙，最終導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡[43]。在本研究中，致力于鑒定BSI特異性地診斷生物標(biāo)志物，提高BSI診斷效率，并研究了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)BSI的影響，有助于識(shí)別免疫治療新型靶標(biāo)并為免疫治療新藥研發(fā)提供思路。

本研究中，通過(guò)對(duì)BSI患者和健康人之間的基因表達(dá)譜進(jìn)行綜合分析，總共發(fā)現(xiàn)了705個(gè)DEGs，其中505個(gè)基因上調(diào)，200個(gè)基因下調(diào)。通過(guò)對(duì)所有基因進(jìn)行GSEA分析，與BSI顯著相關(guān)的前6個(gè)Hallmark基因集是NF-κB介導(dǎo)的TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)、IL6-JAK-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、缺氧、補(bǔ)體和IL2-STAT5信號(hào)傳導(dǎo)。隨后的基因本體（GO）富集分析中顯示DEGs在生物過(guò)程（BP）中顯著富集于免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)信號(hào)通路、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)的激活；而基于KEGG數(shù)據(jù)集的GSVA分析顯示于TGF-β信號(hào)通路、抗原處理和呈遞、原發(fā)性免疫缺陷、B細(xì)胞受體信號(hào)通路有一定的相關(guān)性。這些富集結(jié)果都普遍揭示了免疫和炎癥在BSI中的重要影響。補(bǔ)體是一種血清蛋白質(zhì)，主要存在于血清及組織液中，可被抗原-抗體復(fù)合物或微生物所激活而具有酶活性，進(jìn)而介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[44]。大量研究表明，缺氧與多種生物過(guò)程有關(guān)，可調(diào)節(jié)一系列下游基因的表達(dá)，參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)/死亡、細(xì)胞增殖、糖酵解、免疫反應(yīng)、微生物感染、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程，缺氧可以增強(qiáng)終末耗竭性T細(xì)胞上相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而制造出一種免疫抑制微環(huán)境，來(lái)抑制其他T細(xì)胞的功能[45]。這些結(jié)果表明，過(guò)度的炎癥和免疫抑制對(duì)BSI的不良預(yù)后有著顯著相關(guān)。

二分類機(jī)器學(xué)習(xí)RF具有很好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，但是當(dāng)數(shù)據(jù)集過(guò)小或噪聲較大時(shí)隨機(jī)森林可能會(huì)過(guò)度擬合[46]。SVM可以用于特征選擇，去除不必要的特征，從而降低過(guò)擬合的風(fēng)險(xiǎn)，兩種機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合有利于提高預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性[47]。在DEGs的基礎(chǔ)上，結(jié)合了WGCNA和上述兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)篩選和識(shí)別BSI診斷生物標(biāo)志物，并鑒定出8個(gè)基因，包括OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9。與健康人相比，以上潛在診斷生物標(biāo)志物在BSI患者中的表達(dá)均顯著上升。目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道這些生物標(biāo)志物參與了多種疾病。Toll樣受體5（TLR5）是位于細(xì)胞表面模式識(shí)別受體（PRR），參與先天免疫和炎癥反應(yīng)的激活，在識(shí)別到細(xì)菌鞭毛蛋白等病原體相關(guān)分子模式（PAMP）后，通過(guò)與下游效應(yīng)器MyD88的相互作用，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK），導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)[48]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子（CEACAM1）在免疫反應(yīng)、胰島素作用中發(fā)揮共抑制受體的作用，并在血管生成過(guò)程中充當(dāng)激活劑。受到細(xì)菌感染后在T細(xì)胞、自然殺傷（NK）和中性粒細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[49]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）可能在細(xì)胞外基質(zhì)的局部蛋白水解和白細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。細(xì)菌感染患者的血清MMP9水平已被證明比健康對(duì)照者高得多，MMP9在BSI中可能充當(dāng)新的炎癥調(diào)節(jié)因子[50]。5-氧代脯氨酸酶（OPLAH）能催化5-氧代-L-脯氨酸裂解形成 L-谷氨酸，同時(shí)將 ATP 水解為ADP和無(wú)機(jī)磷酸鹽；有研究表明，受大腸埃希菌感染的HT-29細(xì)胞中檢測(cè)到OPLAH顯著上調(diào)，這可能與感染后造成的氨基酸代謝紊亂有關(guān)[51]。抵抗素（RETN）是由位于19號(hào)染色體上的基因編碼的一種富含半胱氨酸的多肽激素，可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的釋放，并參與BSI的發(fā)病機(jī)制[52]。Dysferlin蛋白（DYSF）參與Ca2+觸發(fā)的突觸囊泡-質(zhì)膜融合過(guò)程，在骨骼肌和心肌細(xì)胞的肌膜修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮作用，這可能與BSI誘發(fā)的相關(guān)肌肉損傷有關(guān)[53]。人細(xì)胞骨架關(guān)聯(lián)蛋白4（CKAP4）可通過(guò)Dickkopf-1信號(hào)誘導(dǎo)NF-kB通路參與炎癥反應(yīng)[54]。己糖激酶（HK3）催化己糖磷酸化為6-磷酸己糖來(lái)介導(dǎo)糖代謝的初始關(guān)鍵步驟，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的比例隨著HK3表達(dá)的升高而顯著增加[54]。ROC分析進(jìn)一步證實(shí)了其在區(qū)分BSI和健康人的診斷價(jià)值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9作為BSI患者新型生物標(biāo)志物的潛力，對(duì)這些潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證與探索，有望成為有效的新型免疫治療靶點(diǎn)。

最后，在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析及其與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析中，活性樹(shù)突狀細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞在BSI患者中高度浸潤(rùn)，而幼稚B細(xì)胞、靜息樹(shù)突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞、靜息CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞豐度較低。各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的變化可能與BSI的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[55]。免疫抑制和免疫失調(diào)：幼稚B細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減少可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的抑制和失衡。這些細(xì)胞在調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答中起著重要作用。它們的減少可能降低了免疫的效力，使患者更容易受到感染，同時(shí)也可能影響免疫對(duì)病原體的記憶和識(shí)別能力；炎癥和免疫激活：活性樹(shù)突狀細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的增加可能反映了免疫系統(tǒng)的激活和炎癥狀態(tài)。這些細(xì)胞在感染和炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們參與吞噬病原體、釋放炎癥介質(zhì)以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致組織損傷和炎癥性疾病；免疫記憶受損：幼稚B細(xì)胞和CD4+記憶T細(xì)胞的減少可能影響免疫系統(tǒng)對(duì)之前感染的記憶。免疫記憶對(duì)于快速識(shí)別和抵御再次暴露的病原體至關(guān)重要。缺乏足夠的記憶細(xì)胞可能導(dǎo)致對(duì)相同病原體的再次感染出現(xiàn)較弱的免疫反應(yīng)；細(xì)胞免疫的增強(qiáng)：嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增加可能反映了細(xì)胞免疫的增強(qiáng)。這些細(xì)胞對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體以及炎癥反應(yīng)具有重要作用。然而，過(guò)度的中性粒細(xì)胞激活也可能引發(fā)組織損傷。這些分析結(jié)果揭示了在BSI患者中免疫細(xì)胞的復(fù)雜調(diào)節(jié)和相互作用。免疫細(xì)胞的增加和減少可能是機(jī)體對(duì)抗感染的努力，但同時(shí)也可能導(dǎo)致免疫平衡的紊亂和炎癥反應(yīng)的加劇。這些結(jié)果有助于更深入地理解免疫系統(tǒng)在感染狀態(tài)下的變化，為設(shè)計(jì)更有效的治療和免疫調(diào)節(jié)策略提供線索。然而，進(jìn)一步的研究仍然需要，以更全面地解析這些變化對(duì)機(jī)體免疫和疾病進(jìn)程的影響。

然而，本研究存在一些局限性。通過(guò)生物信息學(xué)分析，可對(duì)血流感染進(jìn)行診斷，但針對(duì)不同病原菌感染導(dǎo)致的血流感染無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，后續(xù)研究中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)免疫浸潤(rùn)模式及相關(guān)基因的深入研究，有望找出不同病原菌感染導(dǎo)致的血流感染的獨(dú)特浸潤(rùn)模式，得到新的依據(jù)幫助快速診斷疾病。其次，本研究結(jié)果是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算算法，可能無(wú)法完全反映實(shí)際情況。結(jié)果沒(méi)有使用細(xì)胞、動(dòng)物或臨床樣本來(lái)驗(yàn)證研究結(jié)論，需要在進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中來(lái)證實(shí)生物標(biāo)志物在BSI中的作用。

4 結(jié)論

通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選出的OPLAH、RETN、DYSF、TLR5、CKAP4、CEACAM1、HK3和MMP9關(guān)鍵基因可作為BSI的診斷生物標(biāo)志物，并且它們與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)，預(yù)計(jì)上述免疫細(xì)胞將對(duì)BSI的發(fā)展產(chǎn)生重要影響，對(duì)這些免疫細(xì)胞和生物標(biāo)志物進(jìn)行深入研究將有助于識(shí)別免疫治療靶點(diǎn)并優(yōu)化BSI的免疫調(diào)節(jié)治療。

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