不同連作年限西紅花種植土壤微生物多樣性及網絡特征的差異

摘要［目的］探究不同連作年限西紅花種植土壤中細菌和真菌群落多樣性以及網絡結構特征。［方法］采用高通量測序技術分析不同連作年限西紅花種植土壤微生物群落的多樣性、組成以及網絡特征差異。［結果］不同連作年限西紅花種植土壤細菌和真菌的多樣性發生明顯變化，尤其是真菌的OTUs、Shannon、Simpson、Chao和ACE指數，隨著連作年限增加呈現明顯增加的趨勢。主坐標分析（PCoA）和非度量多維尺度分析（NMDS）結果表明，不同連作年限西紅花種植土壤中細菌和真菌群落組成均有明顯差異。放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸酐菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）為4個不同連作年限西紅花種植土壤中豐度前5位的細菌門。子囊菌門（Ascomycota）在4個連作年限中均為第一大真菌門（相對豐度gt;55%）。種植4年的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度低于種植1年、2年和3年。產油菌屬（Solicoccozyma）在連作4年西紅花土壤中豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）。細菌和真菌的共發生網絡分析表明，不同連作年限西紅花種植土壤細菌和真菌呈現不同的連接模式。［結論］該研究描繪了不同連作年限西紅花種植土壤微生物多樣性、組成以及網絡結構的差異，從微生物角度探討西紅花連作障礙機制，為解決西紅花的連作障礙提供參考。

關鍵詞西紅花；連作年限；土壤微生物；多樣性；網絡特征

中圖分類號R282.2"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0137-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.031

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

DifferencesofMicrobialDiversityandNetworkCharacteristicsinCrocussativus-PlantingSoilofDifferentContinuousCroppingYears

LIMeng-zhi1，FENGMao2，GAOLi1etal

（1.HenanKeyLaboratoryofZhangZhongjingFormulaeandHerbsforImmunoregulation，NanyangInstituteofTechnology，Nanyang，Henan473000;2.NanyangInstituteofTechnology，Nanyang，Henan473000）

Abstract［Objective］ToexplorethediversityandnetworkstructureofbacterialandfungalcommunitiesinsoilmicroorganismofCrocussativusindifferentyearsofcontinuouscropping.［Method］High-throughputsequencingwascarriedouttodeterminethediversity，compositionandnetworkstructureofbacterialandfungalcommunitiesinsoilmicroorganismofC.sativus.［Result］ThediversityofbacteriaandfungiinsoilofC.sativushadsignificantchanges，especiallytheOTUs，Shannon，Simpson，ChaoandACEindicesoffungi，whichshowedasignificantincreasetrendwiththeincreaseofcontinuouscroppingyears.TheresultsofPCoAandNMDSshowedthatthereweresignificantdifferencesinthecompositionofbacteriaandfungiinsoilofC.sativusindifferentyearsofcontinuouscropping.Atthebacterialphylumlevel，Actinobacteria，Proteobacteria，Acidobacteria，ChloroflexiandPlanctomyceteswerethetopfivephyla.Atthefungalphylumlevel，Ascomycota（55%）wasthemostabundantphylum.TherelativeabundanceofActinobacteriaandGemmatimonadeteswerelowerinsoilsofcontinuouscropping4yearthancontinuouscropping1，2and3year.TherelativeabundanceofSolicoccozymawassignifcantlyhigherinsoilsofcontinuouscropping4yearthancontinuouscropping1，2and3year（Plt;0.05）.ThereweredifferentconnectivitypatternsofbacteriaandfungiinC.sativus-plantingsoilofdifferentcontinuouscroppingyears.［Conclusion］Thestudydescribesthedifferencesofmicrobialdiversity，compositionandnetworkstructureinC.sativus-plantingsoilofdifferentcontinuouscroppingyears，andexploresthemechanismofC.sativuscontinuouscroppingobstaclesfromamicrobialperspective，providingreferenceforsolvingtheobstaclesofcontinuouscroppinginC.sativus.

KeywordsCrocussativus;Continuouscroppingyears;Soilmicroorganism;Diversity;Networkcharacteristic

西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭^［1］。西紅花主要在伊朗、西班牙、摩洛哥、土耳其、印度、希臘、意大利等地種植，目前在我國主要產地為上海、浙江、安徽和河南等?。ㄊ校?sup>［^2-3］。相關的研究表明，西紅花的柱頭具有較多的藥理作用，例如抗氧化、抗炎、抗抑郁、保護神經、保肝等，這些療效主要來源于藏紅花素、藏紅花苷和藏紅花醛3個主要活性成分^［4］。由于西紅花的化學成分具有重要的藥理作用，導致西紅花的重要性和需求顯著增加^［5］。然而，由于各種因素的影響，近幾十年來世界范圍內西紅花的生產和種植呈下降趨勢^［6］。西紅花的產量可能受到低溫、干旱、水澇以及病原菌的影響^［2］。

西紅花為多年生藥用植物，連續種植使病蟲害加重，導致西紅花的產量和品質下降，連作障礙明顯^［2］。土壤微生物在土壤功能中扮演重要角色，尤其是在調節植物生長、產量、品質等方面^［7］。土壤中微生物的數量、種類、多樣性以及群落結構對于維持土壤系統穩定和調節土壤生態系統功能至關重要^［8］。前人很多的研究結果證實，連作打破了土壤中微生物的群落結構，作為藥用植物三七（Panax notoginseng）^［9］、人參（Panax ginseng）^［10］、地黃（Rehmannia glutinosa）^［11］等產生連作障礙的一個重要原因。連作改變土壤微生物多樣性和組成，對土壤生產力和作物產量產生負面影響^［12］。然而，由于西紅花在我國種植歷史不長，目前鮮見西紅花不同連作年限土壤微生物多樣性、群落組成的研究。因此，全面解析不同連作年限西紅花土壤微生物多樣性、群落組成，對于解析西紅花連作障礙發生機制及預防其發生具有重要意義。該研究通過高通量測序獲得不同連作年限西紅花土壤微生物群落多樣性和組成，闡明不同連作年限西紅花種植土壤微生物的多樣性、組成以及網絡結構的差異，以期為解決西紅花連作障礙提供依據。

1材料與方法

1.1樣品采集

2021年10月20日（西紅花花期）在河南省南陽市臥龍區蒲山鎮馬營村西紅花種植基地采集土壤樣本。分別采集連續種植西紅花1年、2年、3年和4年的耕作層土壤，分別標記為CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y，每個種植年限選取3個種植小區，小區面積為4.0m×1.5m=6m2。采取五點取樣法用土鉆采集深度為0～20cm的耕層土壤放入無菌袋中，將5個點的土壤樣品混在一起，作為一個生物學重復，共獲得12個土壤樣本。將土壤樣本置于冰上運送到實驗室，-80℃保存備用。

1.2DNA提取與PCR擴增

取0.5 g土壤樣品，按照試劑盒（Fast DNA TM Spin kit for soil）操作流程進行，獲得土壤總DNA，用Nanodrop 2000對DNA樣本的濃度和純度進行檢測；使用1%的瓊脂糖凝膠對DNA質量進行檢測，檢測合格的NDA用于后續的PCR擴增。細菌16S的V3～V4區進行擴增，引物序列為341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT -3′）^［13］；真菌ITS的ITS2區進行擴增，引物序列為ITS3_KYO2（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′）^［14］。將上述引物分別合成帶有barcode標簽的特異性引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件參考文獻［15］進行。將純化后的擴增產物（擴增子）連接測序接頭，構建測序文庫，在廣州基迪奧生物科技有限公司的illumina Hiseq TM2500平臺上機測序。

1.3生物信息學分析

測序得到Raw reads，運用FASTP（version 0.18.0）過濾低質量的reads，利用FLSAH（version 1.2.11）將雙端reads拼接為tag。為了獲得高質量的clean tags，通過過濾條件將 raw tags 中的噪聲序列過濾，然后運用UPARSE（version 9.2.64）系統將相似度≥97%的clean tags 聚類成OTUs^［16］。運用UCHIME算法將所有嵌合體的tags去除^［17］。16S和ITS的代表性序列集合使用RDP Classifier 的Nave Bayesian assignment 算法分別依據SILVA 和ITS2數據庫進行物種注釋（設定置信度的閾值為0.8）^［18-19］。多樣性指數通過QIIME軟件（http：//qiime.org/index.html）計算?；贐ray-unifrac距離的主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）和基于Weighted-unifrac距離的非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling ordination，NMDS），通過R語言作圖。運用Linear discriminant analysis effect size（LEfSe，v1.9.0）篩選西紅花不同種植年限土壤中差異的微生物菌群^［20］?！肮舶l生”分析通過Python中的“SparCC”模塊實現，網絡圖的可視化和屬性測量利用交互平臺Gephi進行。

1.4統計分析

不同連作年限西紅花種植土壤微生物細菌和真菌測序結果、多樣性指數、群落組成（門和屬水平）顯著性差異用SPSS21.0分析軟件進行單因素方差分析，不同種植年限差異顯著性采用Duncan法計算（Plt;0.05）。

2結果與分析

2.1不同連作年限對西紅花種植土壤微生物多樣性的影響

對于細菌，CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y分別獲得2665、2929、3168、3040個OTUs；對于真菌，CC1Y、CC2Y、CC3Y、CC4Y分別獲得311、378、470、482個OTUs（表1）；隨著連作年限的延長，耕作土壤中細菌和真菌的OTUs數量總體呈現增加的趨勢，說明連作使土壤中細菌和真菌的種類增加。對4個不同連作年限土壤細菌和真菌的alpha多樣性進行統計分析，結果發現（表2），連續種植2、3、4年的西紅花土壤Chao指數、ACE指數和Shannon指數均顯著高于種植1年西紅花土壤（Plt;0.05），連續種植2、3、4年的西紅花土壤Simpson指數高于種植1年西紅花土壤。基于Bray-curtis距離的細菌和真菌PCoA分析結果（圖1a）表明，不同連作年限西紅花土壤微生物群落組成有顯著差異（細菌R2=0.77，P=0.001，真菌R2=0.56，P=0.002）。同樣基于Weighted-unifrac距離的NMDS分析結果（圖1b）顯示，連作顯著驅動了西紅花種植土壤中細菌和真菌微生物群落的變化（細菌R2=0.73，P=0.001，真菌R2=0.60，P=0.002）。

2.2不同連作年限西紅花種植土壤微生物群落組成分析

細菌門水平上的豐度分析（圖2a1）表明，不同連作年限土壤中前5位的優勢菌門相同，分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸酐菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）。不同連作年限細菌豐度門水平的差異分析（表3）表明，種植4年的土壤中放線菌門（Actinobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度低于種植1年、2年和3年；厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）在種植2年、3年和4年的土壤中高于種植1年的土壤。細菌屬水平的豐度分析（圖2b1和表3）發現，Gaiella在種植4年的土壤中豐度顯著低于種植1年、2年和3年（Plt;0.05）；芽生球菌屬（Blastococcus）和土壤紅色桿形菌屬（Solirubrobacter）的豐度隨著連作年限的增加呈現降低的趨勢。

真菌群落門水平上的豐度分析（圖2a2）發現，子囊菌門（Ascomycota）在4個連作年限中均為第一大菌門（相對豐度gt;55%）；4個連作年限真菌門水平上的豐度差異分析（表4）表明，土壤中毛霉菌門（Mucoromycota）的豐度隨著西紅花連作年限的增加而降低；擔子菌門（Basidiomycota）在連作4年土壤中的豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）。在屬水平上，被孢霉屬（Mortierella）為4個連作年限土壤中真菌的優勢菌屬（圖2b2）；產油菌屬（Solicoccozyma）在連作4年西紅花土壤中的豐度顯著高于其他年限（Plt;0.05）（表4）。以上結果說明，隨著西紅花種植年限的增加驅動了土壤中微生物群落組成的變化。

2.3不同連作年限西紅花種植土壤細菌群落的LEfSe分析

對西紅花不同種植年限土壤微生物群落進行LEfSe分析，進一步篩選不同種植年限土壤中的生物標記物。通過細菌LEfSe分析共獲得63個差異群落，其中連作1年、2年、3年、4年分別為11、13、14和25個差異群落（圖3）。其中，放線菌門（Actinobacteria）、紅色桿菌綱（Rubrobacteria）、紅色桿菌目（Rubrobacterales）、弗蘭克氏菌目（Frankiales）、紅色桿菌科（Rubrobacteriaceae）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、芽球菌屬（Blastococcus）等群落在連作1年的土壤中富集。酸微菌綱（Acidimicrobiia）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）、甲基球菌目（Methylococcales）、梭菌目（Clostridiales）、微球菌目（Micrococcales）、微桿菌科（Microbacteriaceae）、間孢囊菌科（Intrasporangiaceae）、壤霉菌屬（Agromyces）等群落在連作2年的土壤中富集。變形菌門（Proteobacteria）、索力氏菌綱（Solibacterales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、紅環菌科（Rhodocyclaceae）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、褚氏桿菌屬（Chujaibacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）等群落在連作3年的土壤中富集。疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、浮霉菌綱（Planctomycetacia）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、酸桿菌目（Acidobacteriales）、纖線桿菌目（Ktedonobacterales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、芽胞桿菌科（Bacillaceae）等群落在連作4年的土壤中富集。

2.4不同連作年限西紅花種植土壤真菌群落的LEfSe分析

通過真菌LEfSe分析共獲得42個生物標記物，其中連作1年、2年、3年、4年分別為12、7、12和11個生物標記物（圖4）。毛霉門（Mucoromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、毛霉綱（Mucoromycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）、被孢霉目（Mortierellales）、毛霉菌目（Mucorales）、根霉科（Rhizopodaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、根霉屬（Rhizopusa）、被孢霉屬（Mortierella）在連作1年的土壤中富集。錐毛殼目（Coniochaetales）、錐毛殼科（Coniochaetaceae）等群落在連作2年的土壤中富集。纖毛亞門（Ciliophora）、旋毛綱（Spirotrichea）、酵母菌綱（Saccharomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、散毛目（Sporadotrichida）、雙足囊菌科（Dipodascaceae）、地霉屬（Geotrichum）等群落在連作3年的土壤中富集。擔子菌門（Basidiomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、銀耳綱（Tremellomycetes）、絲黑粉菌目（Filobasidiales）、盤菌目（Pezizales）、微囊菌目（Microascales）、小囊菌科（Microascaceae）、糞殼菌科（Sordariaceae）、產油菌屬（Solicoccozyma）等群落在連作4年的土壤中富集。

2.5不同連作年限西紅花種植土壤細菌和真菌群落的網絡結構分析

細菌共發生網絡分析（圖5A和表5）表明，細菌共發生網絡中的網絡直徑、平均路徑長度、中間中心性和度中心性拓撲特征指數在連續種植4年的西紅花土壤中高于種植1年、連續種植2年和連續種植3年的西紅花土壤；細菌共發生網絡中的群落數量隨著連續種植年限的增加呈現持續遞減的趨勢；細菌共發生網絡中的節點數目、邊條數目和正相關條數目在連續種植4年的西紅花土壤中均低于種植1年、連續種植2年和連續種植3年的西紅花土壤。真菌共發生網絡分析（圖5B和表5）表明，連續種植4年的西紅花土壤中的網絡節點數目高于種植1年、連續種植2年和連續種植3年的西紅花土壤；真菌共發生網絡中正相關條數目，在第1年種植西紅花的土壤中遠高于連續種植2年、3年和4年的西紅花土壤；真菌共發生網絡中的網絡直徑和平均路徑長度在第1年種植西紅花的土壤中低于連續種植2年、3年和4年的西紅花土壤。以上結果表明，西紅花不同連作年限的土壤中細菌和真菌群落呈現不同的連接模式。

3結論與討論

土壤微生物多樣性在保持土壤健康和品質中起關鍵作用，同時可作為土壤健康的一個重要的生物學指標^［21］。在該研究中連續種植3年和4年的西紅花種植土壤中真菌多樣性指數Shannon、Simpson、Chao和ACE指數高于連續種植1年和2年的土壤；隨著連作年限的增加土壤中真菌OTUs的數據呈現增加的趨勢。Dong等^［22］研究表明，藥用植物西洋參隨著連作年限的增加，耕作土壤中的真菌多樣性呈現增加的趨勢。另外，Dong等^［23］研究表明，在三七的連作體系中，土壤微生物中真菌多樣性與三七死苗率密切相關。該研究土壤中真菌多樣性隨著西紅花連作年限的增加呈現增加的趨勢，說明西紅花連作改變了土壤的微生態環境，與西紅花連作障礙的發生有一定的關聯。

連作體系改變了土壤微生物群落的組成，從而影響土壤的健康和質量^［24］。該研究中不同連作年限西紅花種植土壤細菌群落組成具有明顯差異。放線菌門（Actinobacteria）的豐度隨著種植年限的增加呈現降低的趨勢。芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的豐度在連作4年的土壤中顯著低于連作1年、2年和3年。該研究中隨著連作年限的增加，有益菌放線菌門和芽單胞菌門的豐度呈降低趨勢，推測有益菌豐度的降低，使得土壤抵抗性降低，土壤中病原菌數量增加，從而造成西紅花連作障礙。

該研究中通過網絡分析探究不同連作年限西紅花種植土壤中微生物群落的互作模式。細菌網絡的某些拓撲性質，例如節點數目、邊條數目、正相關條數目、群落數量等，隨著連作年限增加呈現降低的趨勢。真菌網絡中的正相關條數目在連作2、3、4年的土壤中少于連作1年的土壤，網絡直徑和平均路徑長度在連作2、3、4年的土壤中大于連作1年的土壤。Lax等^［25］研究表明，土壤微生物中高度的網絡連接可以啟動植物免疫系統，加速激活抵御病原菌。該研究中隨著連作年限的增加，土壤中細菌和真菌的網絡連接呈現降低的趨勢，推測隨著西紅花連作年限的增加，土壤中微生物群落間的連接度降低，導致抵抗病原菌的能力降低，從而造成連作障礙的原因之一。

該研究運用高通量測序技術分析西紅花不同連作年限土壤中細菌和真菌微生物群落的多樣性、組成以及網絡結構的差異，從土壤微生物的角度，為西紅花連作障礙的機制及問題的解決提供理論依據。

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