扶正軟堅抗癌方調(diào)控Akt/MDM2/P53信號通路對肝癌HepG2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

［摘 要］ 目的：探討扶正軟堅抗癌方調(diào)控蛋白激酶B（Akt）/鼠雙微體2（MDM2）/P53信號通路對肝癌 HepG2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。方法：采用 0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方分別處理HepG2 細(xì)胞48 h， CCK-8 法檢測HepG2 細(xì)胞存活率，篩選扶正軟堅抗癌方濃度用于后續(xù)實驗。將HepG2 細(xì)胞分為對照組、低劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 2 g·mL－1）、中劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 4 g·mL－1）、高劑量扶正軟堅抗癌方組（0. 8 g·mL－1）、SC79 組（8 mg·L－ 1 SC79） 和高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組（0. 8 g·mL－ 1 扶正軟堅抗癌方+8 mg·L－1 SC79）。CCK-8 法檢測各組HepG2 細(xì)胞增殖活性，克隆形成實驗檢測各組HepG2 細(xì)胞克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HepG2 細(xì)胞凋亡率，Transwell 小室實驗檢測各組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，Western blotting 法檢測各組HepG2 細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、磷酸化Akt （p-Akt）、磷酸化MDM2（p-MDM2） 和P53蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：隨著扶正軟堅抗癌方濃度 （0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1） 的升高， HepG2 細(xì)胞存活率逐漸降低（Plt;0. 05）， 選取0. 2、0. 4 和0. 8 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方用于后續(xù)實驗。CCK-8 法檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）?？寺⌒纬蓪嶒灆z測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。Transwell 小室實驗檢測，與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高（Plt;0. 05）；與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高（Plt;0. 05）。Western blotting 法檢測，與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；SC79 組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）， Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）； 與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較， 高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05），Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯降低 （Plt;0. 05）。結(jié)論：扶正軟堅抗癌方抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機制與抑制Akt/MDM2 信號通路、上調(diào)P53 蛋白表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 扶正軟堅抗癌方； 蛋白激酶B； 鼠雙微體2； P53； 肝腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

［中圖分類號］ R735. 7 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

肝細(xì)胞癌作為原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，嚴(yán)重危害人們的健康［1］。大部分住院患者在診斷時已達(dá)到中晚期或不符合手術(shù)條件，因此手術(shù)切除是20%～30% 患者的首選治療方法［2］。此外，肝癌發(fā)病機制復(fù)雜，對臨床常用療法不敏感。即使是一線化療藥物聯(lián)合放療也會產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，包括正常組織的異常代謝和患者生活質(zhì)量降低。迄今為止，尚無廣泛接受的肝癌治療方法。因此，迫切需要探索與肝癌相關(guān)的機制，并開發(fā)更有效的治療措施。扶正軟堅抗癌方由人參、黃芪、當(dāng)歸、黃精、莪術(shù)、白花蛇舌草和山慈菇7 味中藥組成。其中單味藥即可抑制肝癌進(jìn)展， 如黃芪能抑制磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyqinositol-3-kinase， PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 通路發(fā)揮對肝癌細(xì)胞的抑制作用，白花蛇舌草提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3-4］。研究［5］ 顯示：抑制Akt/鼠雙微體2 （murine double minute 2，MDM2）通路且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本研究探討扶正軟堅抗癌方通過調(diào)控Akt/MDM2/P53 信號通路對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器 人肝癌HepG2細(xì)胞購自北京伊塔生物科技有限公司。扶正軟堅抗癌方（人參10 g、黃芪15 g、當(dāng)歸10 g、黃精10 g、莪術(shù)10 g、白花蛇舌草20 g 和山慈菇10 g） 購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，所有藥材加6 倍體積水浸泡1 h，加熱煎煮2 h 收集煎液， 將剩余藥渣繼續(xù)加6 倍體積水煎煮收集煎液，合并2 次煎液后低溫減壓濃縮為干浸膏，取0. 2 g 干浸膏溶解于1 mL 0. 1% 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 中， 采用0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 DMEM 培養(yǎng)液稀釋藥物。Akt 激活劑SC79 購自美國MCE 公司，CCK-8 試劑盒購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司， 兔源一抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3 （cysteinyl aspartatespecific proteinase-3，Caspase-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）-2、MMP-9、磷酸 化 Akt （phosphorylated Akt，p-Akt）、Akt、磷酸化MDM2 （phosphorylated MDM2， p-MDM2）、MDM2、 P53、 β -actin 及 辣 根 過 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase， HRP） 標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司。SAF-680T 型酶標(biāo)儀購自上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司， CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀購自上海貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司， DM6M LIBS 型光學(xué)顯微鏡購自德國徠卡公司， DYCZ-25D 型蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠。

1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)和扶正軟堅抗癌方濃度篩選 將HepG2 細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞， 以每孔1×104 個細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方分別處理HepG2 細(xì)胞48 h， 各孔中加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h 后， 采用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 處吸光度（A） 值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率= （實驗孔A 值－空白孔A 值）/（對照孔A 值－空白孔A 值）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率篩選合適的扶正軟堅抗癌方濃度用于后續(xù)實驗。

1. 3 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，分為對照組、低劑量扶正軟堅抗癌方組、中劑量扶正軟堅抗癌方組、高劑量扶正軟堅抗癌方組、SC79 組和高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組。低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞分別采用0. 2、0. 4 和0. 8 g·mL－1扶正軟堅抗癌方處理48 h，SC79 組HepG2 細(xì)胞采用8 mg·L－1 SC79 處理48 h［6］，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞采用0. 8 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方和8 mg·L－1 SC79 同時處理48 h， 對照組HepG2 細(xì)胞為正常培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞，不作任何處理。

1. 4 CCK-8法檢測各組HepG2細(xì)胞增殖活性 取HepG2 細(xì)胞， 以每孔1×104 個細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照“1. 3”中細(xì)胞分組進(jìn)行對應(yīng)處理后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm 處A 值，并計算細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞增殖活性= （實驗孔A 值－空白孔A 值） / （對照孔A 值－ 空白孔A 值） ×100%。

1. 5 克隆形成實驗檢測各組 HepG2 細(xì)胞克隆形成率 取 HepG2 細(xì)胞，以每孔 500 個細(xì)胞的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周后， 甲醇固定， 0. 1% 結(jié)晶紫染色， 觀察細(xì)胞克隆形成情況，計算各組HepG2 細(xì)胞克隆形成率?？寺⌒纬陕? 形成克隆細(xì)胞數(shù)/接種總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HepG2細(xì)胞凋亡率 將“1. 3” 中培養(yǎng)的各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 洗 滌， 再 用Annexin Ⅴ -FITC/PI 染 色。37 ℃ 下 避 光 孵 育25 min 后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1. 7 Transwell小室實驗檢測各組 HepG2細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞遷移實驗：采用不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整各組HepG2 細(xì)胞密度為5×104 mL－1 ， 取200 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，再向Transwell 下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。37 ℃ 孵育24 h，甲醛固定， 0. 5% 結(jié)晶紫溶液染色， 光學(xué)顯微鏡下觀察各組HepG2 細(xì)胞遷移情況， 采用Image J軟件計算遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗： 預(yù)先將Matrigel 基質(zhì)膠涂覆于Transwell 上室， 待其自然干燥后，取上述200 μL 細(xì)胞懸液加入到Transwell上室中，剩余步驟與細(xì)胞遷移實驗一致，計算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1. 8 Western blotting 法檢測各組 HepG2 細(xì)胞中PCNA、 Caspase-3、 MMP-2、 MMP-9、 p-Akt、p-MDM2和 P53蛋白表達(dá)水平 采用預(yù)冷的 RIPA裂解緩沖液提取HepG2 細(xì)胞總蛋白質(zhì)， 將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入一抗β-actin、PCNA、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-Akt、Akt、p-MDM2、MDM2 和 P53 均 為 1∶ 1 000。4 ℃下孵育過夜。次日，加入二抗，于室溫下孵育1 h。ECL 試劑顯色， 采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 25. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組HepG2 細(xì)胞增殖活性、克隆形成率、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中PCNA、Caspase-3、MMP-2 及MMP-9 蛋白和Akt/MDM2/P53 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度扶正軟堅抗癌方處理后HepG2細(xì)胞存活率 隨著扶正軟堅抗癌方濃度（0、0. 05、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、1. 60、3. 20 和6. 40 g·mL－1）的升高， HepG2 細(xì)胞存活率（99. 93%±0. 07%、96. 88%±0. 11%、86. 88%±0. 25%、79. 83%±0. 36%、71. 26%±2. 18%、62. 59%±2. 56%、43. 15%±2. 05%、39. 26%±1. 52% 和28. 87%±1. 16%） 逐漸降低（Plt;0. 05）。0. 20、0. 40 和0. 80 g·mL－1 扶正軟堅抗癌方處理下，HepG2 細(xì)胞存活率gt;50%，因此選擇0. 20、0. 40 和0. 80 g·mL－1扶正軟堅抗癌方作為低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組。用于后續(xù)實驗。

2. 2 各組 HepG2細(xì)胞增殖活性 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞增殖活性明顯升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 3 各組 HepG2 細(xì)胞克隆形成率 與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞克隆形成率均明顯降低（Plt;0. 05）， 并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞克隆形成率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1 和表2。

2. 4 各組 HepG2 細(xì)胞凋亡率 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞凋亡率均明顯降低（Plt;0. 05）， 并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。見圖2 和表3。

2. 5 各組HepG2細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù) 與對照組比較，低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性，SC79 組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較， 高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高（Plt;0. 05）。見圖3 和4 及表4。

2. 6 各組HepG2細(xì)胞中PCNA、Caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-Akt、p-MDM2和 P53蛋白表達(dá)水平 與對照組比較， 低、中和高劑量扶正軟堅抗癌方組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性； Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05），并呈劑量依賴性；SC79 組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05），Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。與高劑量扶正軟堅抗癌方組比較，高劑量扶正軟堅抗癌方+SC79 組HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）， Caspase-3 和P53 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05）。見圖5 和表5。

3 討 論

2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)［7］ 顯示： 全球每年約有90. 6 萬例肝癌新發(fā)病例和83 萬例死亡病例。肝癌起病隱匿， 攝入真菌代謝物黃曲霉毒素B1、慢性乙型或丙型肝炎病毒感染及過度飲酒均為肝癌的主要危險因素［8］。肝癌具有放療和化療干預(yù)、早期手術(shù)治療和肝移植等多種治療策略，但其5 年生存率仍低于5% ［9］。因此，需要尋找新的有效抗腫瘤藥物。中醫(yī)藥在世界范圍內(nèi)被廣泛接受，主要原因是其在臨床治療和預(yù)防癌癥方面的有效性和安全性［10］。扶正軟堅抗癌方由人參、黃芪和當(dāng)歸、黃精、莪術(shù)、白花蛇舌草和山慈菇7 味中藥組成。其單藥或其中幾味藥組合治療癌癥的研究較多，如人參皂苷可抑制肝癌細(xì)胞增殖［11］， 黃芪和莪術(shù)配伍可抑制肝癌裸鼠腫瘤新生血管生成［12］， 當(dāng)歸多糖納米粒靶向給藥系統(tǒng)可有效治療肝癌并增強抗腫瘤活性［13］，山慈菇含藥血清可明顯抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［14］。扶正軟堅抗癌方的核心藥物具有扶正和抗癌等作用。本研究結(jié)果顯示：扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，PCNA 是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)在細(xì)胞復(fù)制過程中呈周期性變化，與細(xì)胞有絲分裂過程中DNA 含量的變化相吻合，并在細(xì)胞有絲分裂的S 期達(dá)到峰值［15］。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，可切割對細(xì)胞活性有重要作用的蛋白質(zhì)［16］。MMP-2 和MMP-9 的主要生物學(xué)功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，參與細(xì)胞遷移和侵襲等過程［17］。本研究結(jié)果顯示： 扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細(xì)胞中PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達(dá)，上調(diào)Caspase-3 蛋白表達(dá)，再次從蛋白質(zhì)水平上證實了扶正軟堅抗癌方對HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用， 提示扶正軟堅抗癌方可能成為治療肝癌的潛在有效藥物。研究［18］ 顯示：扶正抗癌方可抑制肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。扶正抑瘤湯在原發(fā)性肝癌根治切除術(shù)患者術(shù)后治療中應(yīng)用效果良好，可有效地延長患者生存期，降低術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，在扶正抗癌方的基礎(chǔ)上，再加以軟堅（即腫瘤包塊軟化，消散結(jié)節(jié)） 之功效，為肝癌的臨床治療提供了堅實的理論基礎(chǔ)［19］。

Akt/MDM2/P53 信號通路失調(diào)與多種惡性腫瘤有關(guān)，Akt 磷酸化可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子MDM2 的穩(wěn)定和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而引發(fā)腫瘤抑制因子P53 的泛素化和降解［20］。近年來，靶向Akt/MDM2/P53 通路被認(rèn)為是對抗人類惡性腫瘤的一種有效治療方式，如抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲［21］，抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［22］， 提示抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示： 與對照組比較，SC79 組HepG2 細(xì)胞中p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)水平升高，P53 蛋白表達(dá)水平降低，HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強，細(xì)胞凋亡能力減弱，證實Akt/MDM2/P53 通路參與HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。此外，扶正軟堅抗癌方可呈劑量依賴性地抑制HepG2 細(xì)胞中p-Akt 和p-MDM2 蛋白表達(dá)，上調(diào)P53 蛋白表達(dá)，提示扶正軟堅抗癌方可能通過調(diào)控Akt/MDM2/P53 通路抑制HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究在高劑量扶正軟堅抗癌方作用的基礎(chǔ)上聯(lián)合Akt 激活劑SC79 干預(yù)HepG2 細(xì)胞， 結(jié)果顯示： SC79 可減弱高劑量扶正軟堅抗癌方對HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，提示扶正軟堅抗癌方可能通過抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)， 從而抑制HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述， 扶正軟堅抗癌方可能通過抑制Akt/MDM2 通路的激活且上調(diào)P53 蛋白表達(dá)， 從而抑制HepG2 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲， 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究僅在體外細(xì)胞水平上驗證了扶正軟堅抗癌方對肝癌HepG2 細(xì)胞進(jìn)展的抑制作用， 未選取不同肝癌細(xì)胞株來驗證實驗結(jié)果，本課題組后期將會進(jìn)一步深入探索。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：婁靜參與研究設(shè)計、實驗操作和論文撰寫，趙雷、朱巖潔和袁帥強參與實驗操作、數(shù)據(jù)收集及整理，王菲、張杭洲、徐嬌嬌和余曉珂參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析及論文修改，侯留法參與實驗設(shè)計及研究指導(dǎo)。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ ZENG L P ， QIN Y Q ， LU X M ， et al.

4-methoxydalbergione elicits anticancer effects by

upregulation of GADD45G in human liver cancer

cells［J］. J Healthc Eng， 2023， 2023： 6710880.

［2］ GRETEN T F， LAI C W， LI G F， et al. Targeted and

immune-based therapies for hepatocellular carcinoma［J］.

Gastroenterology， 2019， 156（2）： 510-524.

［3］ 姚 紅， 任晉宏， 侯宇芯， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子

對接探討黃芪抗肝癌的作用機制研究［J］. 天然產(chǎn)物研

究與開發(fā)， 2021， 33（6）： 1020-1031.

［4］ 劉皎皎， 李粉萍， 楊躍青， 等. 白花蛇舌草提取物對肝

癌細(xì)胞JNK/p38MARK通路及細(xì)胞學(xué)行為的影響［J］.

安徽醫(yī)藥， 2022， 26（8）： 1496-1500.

［5］ QI J N， LI J， BIE B B， et al. MiR-3， 178 contributes to

the therapeutic action of baicalein against hepatocellular

carcinoma cells via modulating HDAC10［J］. Phytother

Res， 2023， 37（1）： 295-309.

［6］ ZHAO Y， CAI J， SHI K H， et al. Germacrone induces

lung cancer cell apoptosis and cell cycle arrest via the

Akt/MDM2/p53 signaling pathway［J］. Mol Med Rep，

2021， 23（6）： 452.

［7］ SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global

cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of

incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185

countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021， 71（3）： 209-249.

［8］ KULIK L， EL-SERAG H B. Epidemiology and

management of hepatocellular carcinoma ［J］.

Gastroenterology， 2019， 156（2）： 477-491.e1.

［9］ HUANG D P， YANG B W， YAO Y Y， et al.

Autophagic inhibition of caveolin-1 by compound

Phyllanthus urinaria L. activates ubiquitination and

proteasome degradation of β-catenin to suppress

metastasis of hepatitis B-associated hepatocellular

carcinoma［J］. Front Pharmacol， 2021， 12： 659325.

［10］KUOK C， WANG Q， FONG P， et al. Inhibitory effect

of hernandezine on the proliferation of hepatocellular

carcinoma［J］. Biol Pharm Bull， 2023， 46（2）： 245-256.

［11］蘇杰琳， 張斯琳， 趙嘉琪， 等. 人參皂苷CK調(diào)節(jié)HIF-1ɑ

介導(dǎo)的糖酵解抑制人肝癌細(xì)胞增殖作用機制的

研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥， 2021， 32（7）：1623-1626.

［12］臧文華， 胡久略， 唐德才， 等. 黃芪、莪術(shù)聯(lián)合順鉑對人

肝癌裸鼠CD147、iNOS表達(dá)的影響［J］. 時珍國醫(yī)國藥，

2020， 31（4）：785-788.

［13］ZHANG Y， CUI Z， MEI H， et al. Angelica sinensis

polysaccharide nanoparticles as a targeted drug delivery

system for enhanced therapy of liver cancer ［J］.

Carbohydr Polym， 2019， 219： 143-154.

［14］程清波， 楊艷萍， 王 瀅， 等. 山慈菇對肝癌細(xì)胞凋亡

和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響［J］. 中醫(yī)學(xué)報， 2021， 36（10）：

2202-2207.

［15］HU T， NIU Y F， FU J F， et al. Antisense lncRNA

PCNA-AS1 promotes esophageal squamous cell

carcinoma progression through the miR-2467-3p/PCNA

axis［J］. Open Med， 2022， 17（1）： 1483-1494.

［16］EOM J W， LIM J W， KIM H. Lutein induces reactive

oxygen species-mediated apoptosis in gastric cancer AGS

cells via NADPH oxidase activation［J］. Molecules，

2023， 28（3）： 1178.

［17］WANG C M， WANG Y Y， LIU C R， et al.

Kinetochore-associated protein 1 promotes the invasion

and tumorigenicity of cervical cancer cells via matrix

metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9［J］.

Bioengineered， 2022， 13（4）： 9495-9507.

［18］趙培西， 唐仕浩， 趙斌， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討扶

正抗癌方治療肝癌的作用機制［J］. 臨床醫(yī)學(xué)研究與

實踐， 2022， 7（2）：16-20.

［19］尹全金， 王 巖， 徐 磊， 等. 扶正抑瘤湯對原發(fā)性肝

癌根治切除術(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)及血管腫瘤標(biāo)志物水平的

影響觀察［J］. 遼寧中醫(yī)雜志， 2022， 49（8）： 133-135.

［20］LIN S D， YU L C， NI Y Q， et al. Fibroblast growth

factor 21 attenuates diabetes-induced renal fibrosis by

negatively regulating TGF- β-p53-Smad2/3-mediated

epithelial-to-mesenchymal transition via activation of

AKT［J］. Diabetes Metab J， 2020， 44（1）： 158-172.

［21］WANG C J， TU H J， YANG L， et al. FOXN3 inhibits

cell proliferation and invasion via modulating the AKT/

MDM2/p53 axis in human glioma［J］. Aging， 2021，

13（17）： 21587-21598.

［22］PARK Y S， NAM G H， JO K J， et al. Extract from

zanthoxylum piperitum induces apoptosis of AGS

gastric cancer cells through akt/MDM2/p53 signaling

pathway［J］. Chin J Integr Med， 2021， 27（10）： 752-759.