大黃酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)EA.hy926 細(xì)胞凋亡的改善作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討大黃酚對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)EA. hy926細(xì)胞氧化損傷的作用，并闡明其對(duì)支氣管肺發(fā)育不良（BPD）的治療作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：分別采用25、50、100、200、400、800和1 600 μmol·L-1 H2O2及0、8、16、32、64、128 和256 μmol·L-1大黃酚誘導(dǎo)EA. hy926 細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)不同濃度H2O2 和大黃酚處理后EA. hy926 細(xì)胞活性。將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組（200 μmol·L-1H2O2）、低劑量大黃酚組（8 μmol·L-1大黃酚和200 μmol·L-1 H2O2） 和高劑量大黃酚組（256 μmol·L-1大黃酚和200 μmol·L-1 H2O2）。Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中凋亡誘導(dǎo)因子（AIF） 蛋白表達(dá)水平，免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位情況，試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-8及Caspase-9水平。結(jié)果：不同濃度H2O2 作用下，EA. hy926 細(xì)胞呈倒置S 形細(xì)胞活性曲線，細(xì)胞活性良好，半數(shù)抑制濃度（IC50） 為261. 52 μmol·L-1，采用200 μmol·L-1 H2O2 干預(yù)24 h 誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型。隨著大黃酚藥物濃度升高，EA. hy926 細(xì)胞活性無(wú)明顯變化（Pgt;0. 05）， 采用8 和256 μmol·L-1 大黃酚進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。Westernblotting 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞核中AIF 蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0. 05），細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細(xì)胞核中AIF 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0. 05），細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。免疫熒光法檢測(cè)，對(duì)照組細(xì)胞AIF 定位于細(xì)胞核內(nèi)較少；與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值明顯升高（Plt;0. 05）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值均明顯降低（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）；與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05），MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；各組細(xì)胞中Caspase-8和Caspase-9水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Pgt;0. 05）。結(jié)論：大黃酚通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和AIF 核轉(zhuǎn)位改善H2O2誘導(dǎo)的EA. hy926 細(xì)胞凋亡，有助于治療BPD。

［關(guān)鍵詞］ 大黃酚； 支氣管肺發(fā)育不良； 凋亡誘導(dǎo)因子； 核轉(zhuǎn)位； 細(xì)胞凋亡； 氧化應(yīng)激

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R725.6 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD） 是威脅早產(chǎn)兒生命的常見(jiàn)慢性呼吸系統(tǒng)疾病， 可以導(dǎo)致反復(fù)住院并引起多種后遺癥，嚴(yán)重影響患兒生活質(zhì)量，遠(yuǎn)期影響甚至可能持續(xù)至青春期和成年期，給患兒、家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)［1］。研究［2］ 顯示： 經(jīng)典型BPD 發(fā)病率已明顯降低，然而新型BPD 發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。不同于以肺部感染及炎癥、肺纖維化和氧化應(yīng)激為特征的經(jīng)典型BPD，新型BPD 以肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化、毛細(xì)血管形態(tài)畸形、間質(zhì)細(xì)胞變化和纖維增生為主要特征。目前，BPD 的潛在發(fā)病機(jī)制及其具體病因尚未完全闡明，仍然缺乏有效的治療手段和干預(yù)藥物，是全球性的婦幼重點(diǎn)健康問(wèn)題［1］。

生命早期高濃度氧暴露是最終導(dǎo)致BPD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3］。氧化應(yīng)激在高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞凋亡過(guò)度是氧化應(yīng)激導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一［4］。研究［5］ 發(fā)現(xiàn)： 肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是BPD 的重要組織學(xué)特點(diǎn)，肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)隨高氧暴露時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加。新型BPD 病理?yè)p傷明顯減輕， 因此內(nèi)源性凋亡途徑激活可能在新型BPD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducingfactor， AIF） 核轉(zhuǎn)位是內(nèi)源性凋亡通路激活的標(biāo)志［6-7］。當(dāng)機(jī)體處于高氧刺激下，活性氧（reactiveoxygen species， ROS） 產(chǎn)生增加和線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，致使線粒體內(nèi)膜電位喪失、基質(zhì)腫脹及外膜破裂，AIF 由線粒體釋放并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。

大黃是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥， 已證實(shí)有助于治療BPD［8-9］。蒽醌類(lèi)化合物是大黃的主要有效化學(xué)成分，其中大黃酚結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，可由此合成其他蒽醌類(lèi)化合物［10］。研究［11］ 顯示：大黃酚可以減輕肺損傷， 但大黃酚改善BPD 的臨床療效及其作用機(jī)制尚未完全闡明。因此本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA. hy926 通過(guò)過(guò)氧化氫（hydrogen peroxidesolution， H2O2） 誘導(dǎo)其凋亡建立高氧損傷模型，探討大黃酚治療對(duì)EA. hy926 高氧損傷細(xì)胞模型AIF 核轉(zhuǎn)位及氧化應(yīng)激的影響， 旨在為BPD 的治療提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA. hy926 （CL-0272） 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司。H2O2 溶液（CAS： 7722-84-1）、大黃酚粉（CAS： 481-74-3）、N-N- 二甲基乙酰胺（CAS：127-19-5） 和聚山梨酯80 （CAS：9005-65-6） 均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司，胰蛋白酶（25200056）和DMEM 培養(yǎng)基（12100046） 均購(gòu)自美國(guó)Gibico公 司， 胎 牛 血 清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（FSP500） 購(gòu)自上海依科賽生物爾科技公司， 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、丙二醛（malondialdehyde， MDA） 檢測(cè)試劑盒、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartatespecific proteinase， Caspase）-8 活性檢測(cè)試劑盒、Caspase-9 活性檢測(cè)試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA 檢測(cè)試劑盒及蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自江蘇海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所， CCK-8 檢測(cè)試劑盒（K1018）購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司，AIF抗體（17984-1-AP）和HistoneH3 （17168-1-AP） 均購(gòu)自武漢Proteintech公司， β -actin （T0022） 購(gòu)自江蘇Affinity 公司。CO2 培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)NanoDrop 公司，聚焦光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司。

1. 2 大黃酚和 H2O2應(yīng)用液制備和 EA. hy926細(xì)胞培養(yǎng) 大黃酚采用N-N-二甲基乙酰胺和聚山梨酯-80 溶解后混勻，實(shí)驗(yàn)前用0. 9% 氯化鈉溶液稀釋至0、8、16、32、64、128 和256 μmol·L-1 藥物濃度。取453 μL 30% H2O2 溶液配制為母液后，定容至100 mL 備用。本研究已通過(guò)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查編號(hào)：202001075。采用含1% 青-鏈霉素和10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，EA. hy926 細(xì)胞復(fù)蘇后，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察EA. hy926 細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合后，采用0. 25% 胰酶消化細(xì)胞，分瓶傳代培養(yǎng)，備用。

1. 3 CCK-8法檢測(cè)不同濃度H2O2處理后EA. hy926細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 EA. hy926 細(xì)胞，采用0. 25% 胰酶消化細(xì)胞，DMEM 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×105 mL-1，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別用濃度為25、50、100、200、400、800 和1 600 μmol·L-1 H2O2 溶液干預(yù)24 h 后，根據(jù)CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處細(xì)胞吸光度（A） 值，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性= （實(shí)驗(yàn)孔A 值-對(duì)照孔A 值） /對(duì)照孔A 值×100%。

1. 4 CCK-8法檢測(cè)不同濃度大黃酚和H2O2處理后EA. hy926細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 EA. hy926細(xì)胞， 稀釋至細(xì)胞密度為1×105 mL-1 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 待細(xì)胞貼壁匯合后， 生理鹽水溶解大黃酚溶液至0、8、16、32、64、128和256 μmol·L-1 濃度梯度， 細(xì)胞中加入不同濃度的大黃酚溶液和200 μmol·L-1 H2O2 溶液， 共同培養(yǎng)24 h，根據(jù)CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處細(xì)胞A 值， 計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性= （實(shí)驗(yàn)孔A 值-對(duì)照孔A 值） /對(duì)照孔A 值×100%。

1. 5 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 EA. hy926 細(xì)胞，分為對(duì)照組、模型組、低劑量大黃酚組和高劑量大黃酚組。對(duì)照組EA. hy926 細(xì)胞不作處理； 模型組EA. hy926 細(xì)胞加入200 μmol·L-1 H2O2溶液，培養(yǎng)24 h； 低和高劑量大黃酚組細(xì)胞培養(yǎng)至匯合后， 分別加入8 和256 μmol·L-1 大黃酚溶液及200 μmol·L-1 H2O2溶液，干預(yù)24 h。

1. 6 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中 AIF 蛋白表達(dá)水平 收集各組 EA. hy926細(xì)胞，按照細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分離提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「鹘MEA. hy926 細(xì)胞， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗后裂解，收集細(xì)胞總蛋白，將提取的蛋白進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中AIF 蛋白定量， 分離得到的細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白通過(guò)SDS-PAGE 電泳， 轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h 后， 孵育AIF （1∶ 1 000）、Histone H3 （1∶ 5 000） 和β-actin （1∶ 10 000） 一抗， TBST 溶液中漂洗3 次， 二抗室溫孵育1 h，TBST 溶液中漂洗3 次， 經(jīng)ECL 成像顯影。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值， 以Histone H3和β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 7 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞 AIF 核轉(zhuǎn)位情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA. hy926 細(xì)胞株，制備為細(xì)胞懸液， 接種至共聚焦皿中。按照上述分組干預(yù)后，PBS 漂洗3 次， 每次5 min， 4% 多聚甲醛固定，室 溫 作 用 15 min， PBS 緩 沖 液 漂 洗 3 次，0. 3%Triton X-100 溶液作用10 min， PBS 緩沖液漂洗3 次， 使用10% 正常山羊血清封閉， 室溫靜置孵育2 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 緩沖液漂洗3 次， 再加入二抗， 室溫孵育1 h， PBS 緩沖液漂洗3 次， 加入Hoechst 染色劑染色， 使用抗熒光淬滅封片液封片， 于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照， 每組隨機(jī)選取3 個(gè)視野， 采用Image J 軟件對(duì)發(fā)生AIF 核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)， 計(jì)算各組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值。AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值= 實(shí)驗(yàn)組AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1. 8 采用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中 SOD 活性和MDA 水平 收集細(xì)胞上清液，按照 SOD和 MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，各組細(xì)胞待測(cè)溶液加入至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 和532 nm 處檢測(cè)細(xì)胞A 值， 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法計(jì)算各組細(xì)胞中SOD 活性和MDA 水平。

1. 9 采用試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中 Caspase-8 和Caspase-9 水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 EA. hy926 細(xì)胞，1∶ 3 傳代至75T 培養(yǎng)瓶中， 待細(xì)胞貼壁匯合后按照上述分組干預(yù)24 h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照Caspase-8 和Caspase-9 活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 22. 0 和 GraphpadPrism 8. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞活性、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平、AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值、細(xì)胞中SOD 活性和MDA 水平及Caspase-8 和Caspase-9 水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度 H2O2處理后 EA. hy926 細(xì)胞活性 EA. hy926 細(xì)胞呈倒置S 形細(xì)胞活性曲線，細(xì)胞活 性 良 好，半 數(shù) 抑 制 濃 度（median inhibitionconcentration，IC50） 為261. 52 μmol·L-1，本研究采用200 μmol·L-1 H2O2 干預(yù)24 h 誘導(dǎo)建立細(xì)胞模型。見(jiàn)圖1。

2. 2 不同濃度大黃酚和H2O2處理后EA. hy926細(xì)胞活性 隨著大黃酚藥物濃度的升高，EA. hy926細(xì)胞活性無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。本研究采用8 和256 μmol·L-1大黃酚進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。見(jiàn)圖2。

2. 3 各組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中 AIF 蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組（1. 296±0. 014） 比較，模型組細(xì)胞核中AIF 蛋白表達(dá)水平（1. 692±0. 026） 明顯升高（Plt;0. 05）， 細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平（0. 910±0. 523） 明顯降低（Plt;0. 05）。與模型組比較，低和高劑量大黃酚組細(xì)胞核中AIF 蛋白表達(dá)水平（1. 583±0. 051 和1. 069±0. 043） 均明顯降低（Plt;0. 05）， 細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平（1. 566±0. 060 和1. 096±0. 013） 均明顯升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖3。

2. 4 各組細(xì)胞 AIF核轉(zhuǎn)位情況 對(duì)照組細(xì)胞 AIF定位于核內(nèi)較少。與對(duì)照組（1. 00±0. 00） 比較，模型組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值（4. 00±0. 82） 明顯升高（Plt;0. 05）。與模型組比較， 低和高劑量大黃酚組細(xì)胞AIF 核轉(zhuǎn)位陽(yáng)性值（2. 25±0. 95 和1. 50±0. 58） 均明顯降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖4。

2. 5 各組細(xì)胞中 SOD 活性和 MDA、Caspase-8及Caspase-9水平 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中SOD 活性明顯降低（Plt;0. 05），MDA 水平明顯升高（Plt;0. 01）。與模型組比較， 低和高劑量大黃酚組細(xì)胞中SOD 活性均明顯升高（Plt;0. 05），MDA 水平均明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。各組細(xì)胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見(jiàn)表1。

3 討 論

臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株Ea. hy926 的結(jié)構(gòu)和功能均與人肺泡微血管內(nèi)皮細(xì)胞相似， 可廣泛用于構(gòu)建BPD 肺泡體外模型［12］。氧化應(yīng)激在高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，而H2O2 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型普遍用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的機(jī)制及藥物對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用［13］。本研究設(shè)置不同濃度梯度H2O2 溶液干預(yù)EA. hy926 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞活性呈倒置S 形細(xì)胞活性曲線，提示造模成功。

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是BPD 發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制［4-5］。本研究結(jié)果顯示：在血管內(nèi)皮細(xì)胞高氧損傷模型中，大黃酚可升高SOD 活性和降低MDA水平，提示其具有抗氧化應(yīng)激作用。此外，與對(duì)照組比較，給予大黃酚和H2O2共同處理后Ea. hy926 細(xì)胞活性無(wú)明顯差異，提示大黃酚有助于減輕高氧誘導(dǎo)的EA. hy926 細(xì)胞凋亡。

過(guò)度細(xì)胞凋亡是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要病理生理機(jī)制［14］。研究［15］ 證實(shí)：肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是BPD 的重要組織學(xué)特點(diǎn)， 肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)與BPD 肺損傷程度存在顯著正相關(guān)關(guān)系。由線粒體損傷介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路和由死亡受體激活的外源性凋亡通路是目前已知的2 種細(xì)胞凋亡途徑，均被證實(shí)參與了BPD 的病理過(guò)程［8，16］。外源性凋亡通路激活啟動(dòng)于Fas 與其受體結(jié)合，隨后與細(xì)胞質(zhì)Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白和Caspase-8 結(jié)合，進(jìn)一步形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體，最終活化Caspase-3，并啟動(dòng)細(xì)胞程序化死亡程序［17］。內(nèi)源性凋亡通路是由于細(xì)胞受促凋亡因子刺激作用下，線粒體跨膜電位明顯降低，線粒體膜通透性明顯升高，從而導(dǎo)致多種促凋亡蛋白，如AIF 和細(xì)胞色素C 的釋放，細(xì)胞色素C 可先后激活Caspase-9 和Caspase-3 （依賴(lài)于Caspase 的凋亡途徑），AIF 則經(jīng)核定位信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，直接引起染色體聚集和DNA 等大分子斷裂（非Caspase 依賴(lài)性通路）， 最終引起細(xì)胞凋亡［18］。新型BPD 病理?yè)p傷較傳統(tǒng)BPD 明顯減輕， 因此內(nèi)源性凋亡通路可能在新型BPD 中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。本研究結(jié)果顯示： 各組細(xì)胞中Caspase-8 和Caspase-9 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞核中AIF 蛋白表達(dá)水平明顯升高；而大黃酚干預(yù)下細(xì)胞質(zhì)中AIF 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯升高，而細(xì)胞核中AIF 蛋白水平明顯降低， 提示輕度BPD 主要為AIF 核轉(zhuǎn)位引發(fā)的非Caspase-3 依賴(lài)性凋亡通路發(fā)揮作用， 大黃酚可有效抑制AIF 核轉(zhuǎn)位引起的EA. hy926 細(xì)胞凋亡。而H2O2 處理和大黃酚干預(yù)后Caspase-9 水平變化不明顯，可能與Caspase-9 為線粒體損傷激活的Caspase依賴(lài)性通路的下游分子，而AIF 核轉(zhuǎn)位反映線粒體損傷后凋亡蛋白的早期變化有關(guān)，且AIF 的激活依賴(lài)于腺苷二磷酸核糖聚合酶-1，而非依賴(lài)于Caspase的外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路［19-20］。

綜上所述，大黃酚通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和AIF 核轉(zhuǎn)位，改善H2O2誘導(dǎo)的EA. hy926 細(xì)胞凋亡，提示大黃酚有助于治療BPD。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李思琪參與實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和論文撰寫(xiě)，陳廣道參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文指導(dǎo)和審校，曾其毅參與研究選題。

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