固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定動物源性食品中的五氯酚

摘 要：根據(jù)《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜-質譜法》（GB 23200.92—2016）規(guī)定的方法對畜禽水產(chǎn)品中五氯酚含量進行測定，通過條件優(yōu)化、質控樣方法驗證、不同儀器型號測試使檢測條件達到最優(yōu)。結果表明，以100%純乙腈為定容液，在1～20 ng·mL-1的添加量下，五氯酚的平均回收率為84%～95%，相對標準偏差為1.72%～2.38%，該方法滿足大批量畜禽水產(chǎn)品中五氯酚殘留量的檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜儀；五氯酚；動物源性食品

Determination of Pentachlorophenol in Animal-Derived Foods by Solid-Phase Extraction Column Purification-Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Abstract： According to the method specified in the GB 23200.92—2016， the content of pentachlorophenol in livestock and poultry aquatic products was determined. The detection conditions were optimized， the quality control sample method was validated， and different instrument models were tested to achieve the optimal detection conditions. The results showed that using 100% pure acetonitrile as the constant volume solution and adding from 1 ng·mL-1 to 20 ng·mL-1， the average recovery rate of pentachlorophenol was 84% to 95%， with a relative standard deviation of 1.72% to 2.38%. This method is suitable for the detection of residual pentachlorophenol in large-scale livestock and poultry aquatic products.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; pentachlorophenol; animal-derived foods

五氯酚酸鈉（Sodium Pentachlorophenoxide，PCP）即五氯酚鈉，作為氯代烴類殺蟲劑和滅真菌劑，由于其價格低廉、效果好，20世紀30年代以來，在世界范圍內被廣泛用于農(nóng)業(yè)殺蟲劑、抗菌劑和防腐劑等[1-2]。五氯酚酸鈉易通過載體進入食物鏈并產(chǎn)生蓄積，如果誤飲被該藥污染的水或者皮膚接觸被污染的水，可能會出現(xiàn)急性中毒，對人體的肝、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷，臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉和發(fā)力等癥狀，嚴重者則會出現(xiàn)呼吸加快、煩躁不安、心動過速、昏迷，甚至引起死亡等癥狀[3]。目前，我國除了允許在塑料、橡膠和木材的防菌劑和防腐劑中使用外，其他領域都已禁用[4-5]。2018年，劉少偉等[6]在牛肚中檢測出五氯酚酸鈉，提醒人們要關注食品中五氯酚酸鈉的殘留量。原農(nóng)業(yè)部2002年235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》和中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號，均將五氯酚酸鈉列為違禁藥物，不得在動物源性食品中檢出。目前，五氯酚及其鈉鹽的檢測方法以氣相色譜-質譜聯(lián)用法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-11]為主，其中液相色譜-串聯(lián)質譜法因其定性準確，靈敏度高，前處理簡單易操作，已經(jīng)成為畜禽肉類及水產(chǎn)中五氯酚酸鈉殘留的主要檢測方法[12-15]。近年來，隨著食品抽檢量加大，動物源性食品中五氯酚酸鈉檢出率也相對較高，尤其是動物肝臟中五氯酚酸鈉的檢出率偏高，含量在1.5～5.0 μg·kg-1，因此有必要建立一種回收率和準確度都滿足檢驗要求的方法，故本文參考《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜-質譜法》（GB 23200.92—2016）中對五氯酚酸鈉的前處理過程，同時對標準規(guī)定的方法進行優(yōu)化，使整個前處理既滿足上機樣品的潔凈度，又能滿足日常檢驗中回收率的要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

五氯酚標液（1 000 μg·mL-1），上海安譜實驗科技股份有限公司；氨水（25%水溶液），天津市大茂化學試劑廠；甲醇（色譜純），天津歐姆尼基因技術有限公司；三乙胺（色譜純），天津市光復精細化工研究所；甲酸（色譜純），福晨（天津）化學試劑有限公司；乙腈，天津歐姆尼基因技術有限公司；P-SAX固相萃取柱（60 mg/3 mL），Welchrom月旭科技。

API4000液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用儀，美國AB SCIEX公司；Velocity 18R Pr離心機，達美柯技術公司；超聲機，德國Elma（艾爾瑪）公司；氮吹儀，?？芃PE高通量真空平行濃縮儀；固相萃取儀，睿科Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液（200 μg·mL-1）：精確移取1 000 μg·mL-1的五氯酚標液2.0 mL，并用甲醇定容至10 mL，混勻。標準使用液（1.0 μg·mL-1）：準確移取200 μg·mL-1標準儲備液0.05 mL，并用甲醇定容至10 mL，混勻。

標準工作液：分別準確移取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL和0.20 mL的標準使用液，并用合適的定容液定容至10 mL，配制成濃度分別為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20 ng·mL-1的標準工作曲線。

1.3 樣品預處理

準確稱取試樣2 g于50 mL離心管中，加入5～8 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液。旋渦混合2 min，超聲提取5 min，離心，上清液置于另一離心管中，殘渣用5～8 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液再次提取，合并兩次上清液，混勻。將提取溶液轉入經(jīng)過活化的陰離子固相萃取柱中，待樣品溶液全部通過固相萃取柱后，棄去流出液，分別用5%氨水溶液、甲醇、2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗，用10 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脫，收集所有洗脫液，氮吹至近干，選擇適當定容液定容至2 mL，旋渦混勻，過有機相濾膜，供液質聯(lián)用儀測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Waters BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相A：5 mmol·L-1乙酸銨溶液；流動相B：乙腈；洗脫梯度程序如表1所示。

1.4.2 質譜條件

選擇電噴霧離子源，負離子模式（Electrospray Ionization，ESI-）；檢測在多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下進行；氣簾氣壓力：10 psi；電噴霧電壓：-4 500V；離子源溫度：450 ℃；霧化器壓力（GS1）：30 psi；輔助氣壓力（GS2）：40 psi。質譜參數(shù)如表2所示。

2 結果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 定容液選擇

在添加量在5 μg·kg-1的情況下，以牛肉、豬肉、豬肝和鯉魚為基質，測試不同定容液下的回收率，得到結果如表3所示?？梢钥闯鑫迓确铀徕c的回收率隨著有機相比例的增加而提高，在純水作為定容液時回收率很低，在甲醇或者乙腈比例占到80%時，回收率在80%～87%，而在定容液為100%甲醇或者100%乙腈時，回收率在90%～100%，尤其是純乙腈作為定容液時，回收率接近100%。這可能是因為在過MAX固相萃取小柱時，使用5%甲酸甲醇作為洗脫液，在酸性條件下，五氯酚酸鈉轉變?yōu)槲迓确?，五氯酚難溶于水，易溶于有機溶劑，因此選擇乙腈作為本實驗的定容液。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

本文比較了水-乙腈、5 mmol·L-1乙酸銨-乙腈，5 mmol·L-1乙酸銨-甲醇、5 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈4種流動相。結果發(fā)現(xiàn)，5 mmol·L-1乙酸銨-乙腈，5 mmol·L-1乙酸銨-甲醇和水-乙腈作為流動相時，峰形較差，響應偏低，由于五氯酚為強極性化合物，在C18色譜柱上保留較差，所以最終選擇5 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈作為流動相，可以保證五氯酚的峰形較好，響應較強。

2.2 質控樣方法驗證

以凍干魚粉為質控樣，測試該方法的可行性。準確稱取1.25 g魚肉凍干粉，加入3.75 g水進行復原，按照1.3進行樣品預處理，100%乙腈作為定容液，最終結果如圖1所示。凍干魚粉中五氯酚添加量為44.2 μg·kg-1，而通過實驗測試所得結果為44.0 μg·kg-1，回收率接近100%，說明以100%乙腈作為定容液，五氯酚酸鈉的回收率更為理想，完全滿足檢驗要求。

2.3 不同儀器型號測試

在超高效液相色譜儀品牌型號的選擇方面，以乙腈作為復溶液上機測試，加標量為5 μg·kg-1的牛肉樣品質譜圖見圖2。通過兩組質譜圖可以看出，兩種品牌型號的設備上響應和峰形都滿足檢驗要求。

2.4 基質效應

為了測試基質效應，利用鯉魚、豬肉、牛肉和豬肝樣品制作基質加標樣品，按照相同的儀器參數(shù)進行分析，質譜圖見圖3。通過比較發(fā)現(xiàn)，豬肉的基質效應最大，在五氯酚酸鈉的保留時間處基線相對更為雜亂，需要在定性時注意4對離子對的離子豐度比。

2.5 方法建立

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限

以五氯酚酸鈉標準溶液濃度（x）為橫軸，以定量離子峰面積（y）為縱軸，繪制標準曲線。線性方程為y=5.13×104x+3.15×104，表明五氯酚酸鈉質量濃度在1～20 ng·mL-1的線性關系良好，R2gt;0.999。

2.5.2 準確度和精密度

在空白牛肉中，考察不同添加量（1 μg·kg-1、

2 μg·kg-1、5 μg·kg-1）下的五氯酚酸鈉回收率。由表4可知，平均回收率為84%～95%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.72%～2.38%，說明該方法完全滿足檢驗要求。

3 結論

本方法參考《食品安全國家標準 動物源性食品中五氯酚殘留量的測定 液相色譜-質譜法》（GB 23200.92—2016）中對五氯酚的前處理過程，驗證不同定容液對于五氯酚回收率的影響，結果表明在畜肉及水產(chǎn)品檢測時，定容液中有機相比例越高五氯酚的回收率越高，特別是以純乙腈作為定容液，回收率接近100%。以魚肉凍干粉質控樣作為測試樣品，結果回收率可到100%，證明測試方法可行性。同時，利用空白牛肉作為基質分別測試了準確度和精密度，證明該方法滿足檢驗要求，適合作為五氯酚的檢驗分析。

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