高效液相色譜法檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1的含量

摘 要：本文建立了高效液相色譜檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的方法。試樣用甲醇-水溶液渦旋振蕩提取，提取液經免疫親和柱凈化，氮吹濃縮，供高效液相色譜-熒光檢測器測定。結果表明，黃曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1范圍內線性關系良好，方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，加標回收率在89.0%～98.7%，相對標準偏差為1.24%～4.39%。本方法適用于玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的檢測。

關鍵詞：高效液相色譜法；玉米；黃曲霉毒素B1

Detection of Aflatoxin B1 Content in Corn and Its Products by High-Performance Liquid Chromatography

Abstract： A method for detecting aflatoxin B1 content in corn and its products using high-performance liquid chromatography has been established in this paper. The sample was extracted by vortex oscillation with methanol water solution， and the extract was purified by an immunoaffinity column and concentrated by nitrogen blowing for determination by high-performance liquid chromatography fluorescence detector. The results showed that aflatoxin B1 had a good linear relationship in the range of 0.1～20.0 ng·mL-1， with a detection limit of 0.02 μg·kg-1 and a quantification limit of 0.05 μg·kg-1. The recovery rate was within the range of 89.0%～98.7%， and the relative standard deviation was 1.24%～4.39%. This method is applicable for the detection of aflatoxin B1 content in corn and its products.

Keywords： high-performance liquid chromatography; corn; aflatoxin B1

黃曲霉毒素是一種由黃曲霉代謝產生的有毒物質，其中黃曲霉毒素B1的毒性最強，具有高致癌性，世界衛生組織將其定為Ⅰ類致癌物[1]。玉米是一種適應性強、產量高的糧食作物，在我國栽培歷史悠久、分布范圍很廣，播種面積僅次于水稻、小麥，總產量則在糧食作物中居于首位[2]。玉米中富含蛋白質、維生素、纖維素和多種微量元素，一直被譽為長壽食品，也是油料和飼料的重要來源[3]。然而，玉米這種主要的糧食作物受黃曲霉毒素B1污染也最為嚴重，因此，加強對玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的監管檢測，對保障糧食和飼料安全非常重要。本研究參照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）[4]第三法中高效液相色譜法（無衍生器法），建立了高效液相色譜法檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜（配大流通池熒光檢測器），美國沃特世公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德國賽多利斯公司；XH-S旋渦混合器，無錫杰瑞安儀器公司；Multi Reax多管旋渦振蕩器，德國海道爾夫公司；TG16G臺式高速離心機，常州市億能實驗儀器廠；ASE-12固相萃取裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HSC-B水浴氮吹儀，天津市恒奧科技發展有限公司；移液器（1 mL、10 mL）移液器，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料與試劑

玉米、玉米糝，購自某農貿市場；乙腈中黃曲霉毒素B1（編號91661c，濃度10 μg·mL-1），壇墨質檢標準物質中心；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國默克公司；氯化鈉（分析純）、氯化鉀（分析純），天津市大茂化學試劑廠；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、鹽酸（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；Triton X-100（化學純），上海酶聯生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，北京泰樂祺科技有限公司。

磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）：準確稱取4.00 g氯化鈉、0.60 g磷酸二氫鈉、0.10 g磷酸二氫鉀、0.10 g氯化鉀于燒杯中，用450 mL超純水溶解，用鹽酸溶液調節pH值至7.4，全部轉移至500 mL容量瓶中，定容至刻度。

1%Triton X-100的PBS：準確吸取5.0 mL1%Triton X-100，用PBS定容至500 mL。

1.3 標準溶液配制

（1）標準中間液配制。準確吸取0.25 mL濃度為10 μg·mL-1的乙腈中黃曲霉毒素B1標準溶液于25 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，搖勻，配制得100 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標準中間液。

（2）標準工作液配制。分別吸取0.01 mL、0.05 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL濃度為100 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標準中間液于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋定容至刻度，搖勻，配制得濃度為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的標準工作系列溶液。

1.4 樣品處理過程

（1）試樣提取。稱取5 g（精確至0.01 g）經粉碎后粒徑小于2 mm的試樣于50 mL具塞離心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），使用旋渦混合器渦旋1 min，混勻后置于多管旋渦振蕩器上渦旋振蕩20 min，6 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液備用。

（2）凈化測定。準確移取4.0 mL上清液于比色管中，加入23 mL 1%Triton X-100的PBS，混勻。從冰箱冷藏室中取出免疫親和柱，待恢復至室溫，將免疫親和柱中液體放棄后，連接在50 mL注射器套管上，將混勻后的試液轉移入注射器中，連接至固相萃取裝置上，調節真空泵使樣液以1～3 mL·min-1的流速下滴。待樣液滴完后，加入10 mL超純水淋洗免疫親和柱并重復一次，超純水滴完后調節真空泵抽干小柱。關閉真空泵，取下注射器，往免疫親和柱中加入1 mL甲醇，控制以1～3 mL·min-1的流速洗脫親和柱，用玻璃刻度試管接收洗脫液，并重復一次，最后抽干親和柱，將全部洗脫液并入刻度試管中。將玻璃試管置于水溫50 ℃的氮吹儀上，緩緩通入氮氣吹至近干，用流動相定容至1.0 mL，渦旋混勻后過0.22 μm濾膜，收集濾液上機測試。

1.5 儀器工作條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流動相：水∶乙腈+甲醇（50+50，V/V）=65∶35；洗脫程序：等度洗脫；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測器：熒光檢測器（大流通池），激發波長365 nm，發射波長436 nm；進樣量：3.0 μL；根據保留時間定性，色譜峰面積比較定量。

2 結果與分析

2.1 色譜分離效果

將配制的黃曲霉毒素B1標準工作溶液按照本研究中儀器條件上機測試，色譜圖如圖1。黃曲霉毒素B1色譜峰尖銳對稱，流動相中的溶劑峰、雜質峰也未對目標峰產生干擾，可以準確進行黃曲霉毒素B1的定性定量分析。

2.2 方法的線性關系與檢出限

將配制的黃曲霉毒素B1標準工作系列溶液按照本研究中儀器條件上機測試，以標準系列溶液中黃曲霉毒素B1的質量濃度為橫坐標，測得目標峰的色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，獲得的線性回歸方程為Y=1.172×104X，相關系數R為0.999 9，由此看出黃曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1線性關系良好。稱取5.00 g陰性樣品，添加0.25 mL濃度為2.0 ng·mL-1的黃曲霉毒素B1標準溶液，按照1.4試樣處理過程，最終定容體積為1.0 mL，按照1.5儀器工作條件上機測試，以黃曲霉毒素B1色譜峰的信噪比S/N≥3對應濃度為方法檢出限、信噪比S/N≥10對應濃度為方法定量限，獲得方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，滿足GB 5009.22—2016第三法中高效液相色譜法（無衍生器法）的要求。

2.3 方法的準確度與精密度

稱取經本研究中方法檢測不含黃曲霉毒素B1的陰性玉米及玉米糝樣品（本底值為0 μg·kg-1），分別添加低（0.05 μg·kg-1）、中（5.00 μg·kg-1）、高（20.00 μg·kg-1）3個濃度水平的標準溶液，按照1.4試樣處理過程，在1.5儀器工作條件上機測試，每個水平加標樣品平行測定6次，考察方法的準確度（以加標回收率表示）與精密度（以相對標準偏差表示），結果見表1。玉米及玉米糝樣品中黃曲霉毒素B1的加標回收率在89.0%～98.7%，相對標準偏差為1.24%～4.39%，方法的準確度與精密度滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[5]的規定。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法（無衍生器法）檢測玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的分析方法，經試驗表明，黃曲霉毒素B1色譜峰尖銳對稱、分離效果較好，線性關系良好，相關系數R＞0.999，方法檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.05 μg·kg-1，加標回收率在89.0%～98.7%，相對標準偏差為1.24%～4.39%，均符合GB 5009.22—2016與GB/T 27404—2008中的規定，可以滿足食品檢驗檢測機構及相關企業對玉米及其制品中黃曲霉毒素B1含量的檢測需求。

參考文獻

[1]顧雨熹，劉金陽，劉冬雨，等.全自動免疫磁珠法與免疫親和柱法測定玉米粉中黃曲霉毒素B1的對比研究[J].糧食儲藏，2023，52（5）：31-35.

[2]張向麗，李杰，董海軍，等.淺析玉米黃曲霉影響因素及應對措施[J].農業裝備技術，2024，50（3）：33-34.

[3]張艷，吳乾坤，韓逸陶，等.分級制備法評估粉碎粒徑對玉米中黃曲霉毒素B1測定的影響[J].糧油食品科技，2023，31（6）：107-112.

[4]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定：GB 5009.22—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[5]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.實驗室質量控制規范 食品理化檢測：GB/T 27404—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.