不同哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結構及功能的影響

摘要：為探究不同哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結構及功能的影響，給木霉制劑的研發提供理論依據，在陜西省咸陽市旬邑縣進行大田試驗，以煙草品種云煙99為材料，試驗設置5個處理：CK（常規施肥），T1（常規施肥+15 kg/hm²"哈茨木霉A劑型），T2（常規施肥+15 kg/hm²哈茨木霉B劑型），T3（常規施肥+15 kg/hm²哈茨木霉C劑型），T4（常規施肥+15 kg/hm²哈茨木霉D劑型）。不同的哈茨木霉制劑對植煙土壤真菌群落結構和作用的影響，通過高通量測序技術進行探究。結果表明，從真菌α多樣性來看，T1處理土壤真菌群落的多樣性和豐富性較對照明顯增加，其真菌總OTU數量和特有OTU數量也均明顯增加，T2和T3處理則較對照減少。不同哈茨木霉制劑處理與對照間共有優勢菌株不同，說明哈茨木霉改變了土壤真菌優勢菌群。在門水平對真菌群落組成和組間差異性的檢驗分析中發現，T2和T3處理腐生型真菌的毛霉菌門相對豐度增加，而T1和T4處理腐生型真菌的子囊菌門相對豐度增加，各處理間的毛霉菌亞門和子囊菌門相對豐度差異明顯；在屬級分析中，T2處理根霉屬和球囊霉屬較對照相對豐度分別提高2.79、1.75百分點，T3和T4處理病理學營養型鐮刀菌屬較對照豐度分別降低1.81、0.48百分點。各處理間鏈格孢屬和球孢子菌屬存在顯著差異，其中T1和T4處理鏈格孢屬豐度占比顯著升高。LEfSe分析發現，不同哈茨木霉制劑處理均提高了土壤優勢菌群數量，以T4處理增加最多，優勢菌群為子囊菌門、假孢子蟲科和地星目等。綜上所述，T3處理對植煙土壤真菌菌群落結構改善效果最佳。

關鍵詞：煙草；哈茨木霉；土壤；真菌；群落結構

中圖分類號：S435.72""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0215-07

有研究表明，植物抗病能力與土壤微生物群落結構密切相關，而微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，大量發生的土傳類病害與之密切相關，土壤微生態失衡造成的致病菌大量繁殖并富集于植物根部是誘發土傳病害的根源^［1］。豐富的土壤微生物多樣性和適宜的群落組成是支持生態系統生產力的重要因素，良好的土壤微生態環境也是促進植物生長發育的首要條件之一^［2］。通過水合氧化鐵與棘孢木霉復合處理菠菜，菠菜的地上部和根系中砷含量分別減少了37%和34%，地上部和根系生物量分別提高了134%和138%，同時土壤中碳、氮、磷礦化和抗氧化活性密切相關的土壤酶活性大幅升高^［3］。黃君霞等研究發現，采用硫酸銨和木霉處理后，連作土壤微生物群落得到了明顯改善，土壤細菌豐度和數量明顯增加，有害真菌的數量減少^［4］。經高錳酸鉀消毒后的土壤，增施木霉能較大程度改善土壤真菌群落結構^［5］。劉正洋等研究認為，施用木霉菌生物有機肥后增加了白菜—甘藍輪作下土壤微生物豐富度和多樣性，主要是增加了伯克氏菌屬和紅酵母屬等的相對豐度^［6］。郭成瑾等通過高通量測序后發現，木霉菌、細菌和放線菌在哈茨木霉協同小麥秸稈處理后的數量分別上升了 1 407.27%、75.36%和60.58%^［7］。Umadevi等研究發現，哈茨木霉的施用降低了與致病相關細菌的豐度，同時宏基因組測序結果顯示，經過木霉處理后的土壤中降解雜環芳香族化合物、苯甲酸轉運及其降解相關基因有著更高的豐度^［8］，這說明木霉制劑的應用可以為植物修復土壤創造出適合的群落結構。魯海菊等對枇杷根際添加木霉P3.9菌株得到的結果與上述相似，木霉菌改變了土壤真菌群落豐富度的同時對根際土壤有一定的修復作用^［9］。不同木霉對不同植物的根際微生物群落結構的影響存在著一定的差異，但是土壤微生態結構的改變離不開木霉對植物生長的有益影響^［10］。

近年來，世界上含木霉菌的商業化生防劑數量不斷增加，世界各地已經注冊了250多種木霉的商業制劑，其中哈茨木霉SQR-T-037、哈茨木霉SH2303、綠色木霉LTR-2等在土壤改良、植物促生和病害防治方面都具有優良的應用前景^［11-12］。當前木霉制劑主要類型包括可濕性粉劑、顆粒劑、懸乳劑和混配劑等，以新西蘭開發的Trichodry、Trichoflow等制劑和以色列研發的哈茨木霉T39發酵液所制成的Trichodex生防菌劑為代表產品，由木霉分生孢子發酵物與載體劑均勻混合而制成。懸乳劑是由植物油或礦物油與乳化劑等助劑組成的乳液配制而成，而混配劑是木霉孢子粉與化學殺菌劑按一定比例，選擇合適載體混合而成^［13］。陳凱等研究表明，木霉重組株L-15和野生株LTR-2所制備的可濕性粉劑對番茄立枯病的防治效果達到89.27%^［14］。吳曉儒等研究對比不同配方木霉顆粒劑對玉米莖腐病的防效，試驗結果顯示各配方顆粒劑都有較好的生物防治效果及增產作用^［15］。有研究發現，哈茨木霉、綠色木霉等6種生防菌與化學農藥百菌清進行二元混配使用對百合貯存期鱗莖腐爛病防治效果達61.76%以上，哈茨木霉制劑的研發有利于減少化學農藥的使用，維護土壤生態系統的健康。

1"材料與方法

1.1"試驗條件

試驗于2022年3—8月在陜西省咸陽市旬邑縣馬欄煙葉工作站（34.05°～35.22°N，108.44°～110.03°E）進行。該地屬于低山丘陵，屬暖溫帶季風氣候，年平均氣溫14.5 ℃，年降水量660～750 mm。試驗地前茬為谷子，土壤質地為褐土，試驗地基礎肥力：速效磷含量為14.38 mg/kg，速效鉀含量為 157.22 mg/kg，速效氮含量為149.87 mg/kg，有機質含量為7.87 g/kg，pH值為5.37。試驗地施肥情況：復合肥（N、P2O5、K2O含量分別為10%、12%、18%）300 kg/hm²，硫酸鉀375 kg/hm²，重鈣75 kg/hm²。

1.2"試驗材料

供試煙草品種為云煙99。

供試微生物菌劑為河南農業大學煙草學院微生物實驗室篩選的哈茨木霉菌株（Trichoderma harzianum），專利保藏號為CGMCC23294，依據該菌株研發的4種不同顆粒劑分別為A劑型以硅藻土為載體與哈茨木霉孢子混合、B劑型以麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合、C劑型以粉碎煙梗-麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合、D劑型以水熱炭-麥飯石為載體與哈茨木霉孢子混合，其活菌數均為 2×10⁹"CFU/g，隨煙苗移栽時施入。

1.3"試驗設計

試驗采用隨機區組設計，設置5個處理（表1），3次重復，小區面積300 m²，行距1.2 m，株距 0.55 m，按照優質煙葉生產管理辦法進行大田管理。

1.4"樣品采集及測定方法

1.4.1"土壤樣品采集

煙苗移栽45 d后，拔出整株煙根，去除石礫以及動植物殘體，用刷子小心地把緊貼煙根上的土壤刷下來，收集到無菌塑料離心管中，放于-80 ℃超低溫冰箱中用于高通量測序。

1.4.2"土壤樣品DNA提取和PCR擴增

土壤微生物高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。使用美國Omega Bio-Tek公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit（Omega Bio tek，Norcross，GA，USA）試劑盒提取土壤中微生物總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測DNA的提取質量，NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；采用上、下游引物（F：CTTGGSOCATTTAGAGGAAGTAA；R：GCTGCGTSOCTSOCASOCGATGC）對ITS基因ITS1可變區進行PCR擴增^［16］。

1.4.3"Illumina Miseq測序

把來自同一樣本的PCR產物進行混合，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國）進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，利用Quantus^TMFluorometer（美國）對回收的產物進行檢測定量。使用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT LibraryPrep Kit進行建庫，并在Illumina NovaSeq機器上利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit（500 cycles）進行2×250 bp的雙端測序。真菌對比數據庫為unite_8。數據上傳至NCBI SRA數據庫^［17］。

1.5"數據處理

所有數據均采用Excel 2019整理，IBM SPSS Statistics 26軟件進行數據方差分析。方差分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA）法，差異顯著的指標用最小顯著差法（LSD）進行多重比較分析。使用美吉生物云平臺進行聚類分析，使用聯川云平臺對OTU表進行線性判別分析（LEfSe）。采用Canoco 5.0軟件用于冗余分析。將OTU分類表與FUNGuild（真菌）數據庫進行比對以進行功能預測。圖表制作采用Excel 2019和Origin 8.0^［18］。

2"結果與分析

2.1"土壤真菌α多樣性

由表2可知，真菌群落覆蓋度在所有樣本中均達到99%，表明本次測序結果代表真實情況。與CK相比，所有處理的Simpson指數均有所降低，最明顯的是T2處理，降幅達42.86%。T1和T4處理Shannon指數分別顯著上升14.35%和14.97%，說明不同哈茨木霉制劑對土壤真菌群落均勻性和多樣性有顯著改善，其中T1、T2和T4處理效果顯著。T1及T3處理Chao1指數較CK分別升高了6.47%和3.17%，而T2和T4處理較CK降低了4.62%和1.09%，表明T1、T3處理有助于土壤真菌豐度，而T2和T4處理土壤真菌豐度有所降低，不同哈茨木霉制劑的施用影響了土壤的真菌群落結構多樣性。

2.2"真菌群落組成Venn圖

圖1是不同哈茨木霉制劑對土壤真菌群落組成OTU的Venn分析圖，結果顯示各處理土壤真菌OTU總數量為T1gt;T4gt;CKgt;T3gt;T2，T1、T4處理能提高土壤真菌OTU數量，而T2和T3處理OTU數量相比CK有所下降。5個處理OTU總數量為287，各處理與CK共有OTU數量為122，占總OTU的42.51%。T1處理后OTU數量較CK增加最明顯，增加了11.11%，特有OTU個數為20，相比CK增加400%，占總OTU的6.97%。T4處理OTU數量增加了3.86%，特有OTU數量僅7個，相比CK增加75%，占總OTU的2.44%。不同哈茨木霉制劑能增加土壤真菌物種數量，改變其群落結構。根霉屬（Rhizopus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、蟻巢傘屬（Termitomyces）和腐皮殼菌屬（Valsa）為5個處理OTU中共有優勢菌株。而Dacryopinax屬、嗜藍孢孔菌屬（Fomitiporia）、共頭霉屬（Syncephalastrum）和Polychaeton屬為不同哈茨木霉制劑處理后土壤共有優勢菌株，表明哈茨木霉制劑處理后使土壤中的優勢菌種發生了變化。

2.3"對門水平真菌群落組成和組間差異性的檢驗

如圖2-a所示，在門水平土壤真菌主要優勢門類為毛霉菌門（Mucoromycota）、子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota），它們的平均豐度占比為98.51%。真菌毛霉菌門（Mucoromycota）相對豐度表現為T2（50.87%）gt;T3（47.58%）gt;CK（46.66%）gt;T1（42.68%）gt;T4（42.57%），T2處理相比CK豐度提高4.21百分點，T1、T4處理分別下降3.98、4.08百分點。子囊菌門（Ascomycota）相對豐度表現為T4（42.77%）gt;T1（41.93%）gt;CK（37.51%）gt;T2（34.29%）gt;T3（33.09%），T1、T4處理提高較明顯，分別提高了5.26、4.42百分點，T2和T3處理下降了3.22、4.42百分點。擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度表現為T3（12.34%）gt;T1（11.36%）gt;CK（10.49%）gt;T4（9.72%）gt;T2（8.59%），與CK相比較，T3處理有所升高，而T2降低最明顯，達到1.90百分點。油壺菌門（Olpidiomycota）相對豐度則T2、T3處理分別為5.08%和4.58%，T4處理低于CK，為3.28%，而T1處理最低，僅為2.99%。綜上，不同哈茨木霉制劑對主要真菌優勢菌門占比影響較大。

如圖2-b所示，對每個處理間的真菌群落樣本優勢菌門進行組間差異顯著性檢驗。結果顯示，各處理在毛霉菌門（Mucoromycota）、子囊菌門（Ascomycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）間差異較明顯，且各處理毛霉菌門（Mucoromycota）和子囊菌門（Ascomycota）占比菌超過30%，毛霉菌門（Mucoromycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）各處理豐度占比均表現為T2gt;T3gt;CKgt;T4、T1。

2.4"對屬水平真菌群落組成和組間差異性的檢驗

如圖3-a所示，屬水平土壤真菌主要優勢菌屬為根霉屬（Rhizopus）、球囊霉屬（Glomus）、毛霉屬（Mucor）、Lipomyces屬、鐮刀菌屬（Fusarium）、油壺菌屬（Olpidium），相對豐度均在3%以上，其在各處理中相對豐度分別為53.49%、49.09%、59.87%、46.10%和50.53%，平均達到51.82%。根霉屬（Rhizopus）相對豐度表現為T2（31.55%）gt;T1（29.65%）gt;CK（28.76%）gt;T3（26.15%）gt;T4（24.59%），與CK相比，T1、T2處理相對豐度明顯升高，分別提高0.89、2.79百分點，T3、T4處理有所降低。球囊霉屬（Glomus）相對豐度表現為T3（9.26%）gt;T4（8.44%）gt;T2（8.41%）gt;CK（6.66%）gt;T1（4.92%），除T1處理豐度下降1.74百分點外，其余各處理均有不同程度升高。T2、T3和T4處理毛霉屬（Mucor）相對豐度分別為5.28%、5.33%和5.55%，與CK（5.32%）數值接近，而T1處理相對豐度為3.58%，較CK降低1.74百分點。T2、T4處理Lipomyces屬相對豐度為5.08%、4.89%，較CK（4.33%）分別提高了0.75、0.56百分點，T1和T3處理菌有所下降。鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度表現為T1（4.67%）gt;T2（4.47%）gt;CK（4.26%）gt;T4（3.78%）gt;T3（2.45%），T3、T4處理明顯降低了鐮刀菌屬（Fusarium）豐度，同時T1、T4處理油壺菌屬（Olpidium）豐度也明顯降低。

由圖3-b所示，各處理在鏈格孢屬（Alternaria）、球孢子菌屬（Coccidioides）、Lizonia屬、匍柄霉屬（Stemphylium）、彎孢屬（Curvularia）等菌屬間存在顯著差異。T1和T4處理鏈格孢屬（Alternaria）豐度占比顯著高于其他處理，不同哈茨木霉制劑處理后土壤球孢子菌屬（Coccidioides）T3處理豐度最高，且T3處理Lizonia屬為0，與其他處理呈極顯著差異，T2處理匍柄霉屬（Stemphylium）豐度為0，同時T3處理豐度僅為0.046%，與其余處理間呈極顯著差異。

2.5"真菌LEfSe多級物種差異判別分析

對土壤真菌從門到屬水平進行LEfSe分析和LDA判別，結果見圖4，設定LDA閾值為3.0。結果顯示，CK處理土壤高度富集的微生物為麥角菌科（Clavicipitaceae），T1處理土壤優勢菌株為座囊菌綱（Dothideomycetes）、假球殼目（Pleosporales）和孢腔菌科（Pleosporaceae），T2處理土壤中高度富集的微生物有石耳目（Umbilicariales）和Umbilicariaceae科，T3處理土壤中優勢菌株為球囊菌綱（Glomeromycetes）、梅奇酵母科（Metschnikowiaceae）、爪甲團囊菌科（Onygenaceae）等，而T4處理則為子囊菌門（Ascomycota）、假孢子蟲科（Pseudoperisporiaceae）、地星目（Geastrales）等，不同哈茨木霉制劑處理后土壤主要富集真菌物種不同，說明其對土壤主要真菌群落有較大影響。

3"討論與結論

不同的哈茨木霉制劑對土壤真菌群落結構有明顯的改變，T2和T3處理真菌群落的多樣性和均勻性有所提高，T1和T3處理的豐富性明顯增加，T1和T4處理的總OTU數量較對照增加，T2和T3處理略有下降，其中特有OTU數量最多的是T1處理，明顯高于對照。對門水平上真菌群落組成及差異性檢驗發現，T2處理毛霉菌門豐度較對照明顯增加。毛霉菌是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，其豐度增加有助于土壤蛋白質分解，促進土壤蛋白質循環^［19］。T1和T4處理土壤優勢菌株子囊菌門豐度顯著增加，子囊菌門豐度增加能加快土壤中木質化植物殘骸分解，促進養分轉化^［20］。各處理間子囊菌門豐度存在顯著差異。對屬水平分析結果顯示，T2處理根霉屬、球囊霉屬、毛霉屬等有益菌群豐度明顯升高，而T4處理對能引起煙草根腐病的鐮刀菌屬和引致甜瓜壞死斑點病毒的油壺菌屬豐度較對照顯著降低^［21-22］。不同哈茨木霉制劑菌劑對土壤真菌群落結構影響差異較大，能夠提高調節土壤真菌群落結構，減少病原菌數量，降低煙草病害發生，這與向立剛等研究結果^［23］一致。各處理在鏈格孢屬、Lizonia屬、匍柄霉屬間呈極顯著差異。對土壤真菌從門到屬水平進行LDA判別分析發現，施用不同哈茨木霉制劑后，土壤主要富集的真菌物種均有不同程度增加，其中T3處理增加最明顯。各處理在屬水平，真菌群落結構受主成分影響，與CK間均存在較大差異。土壤速效磷、速效鉀、堿解氮和有機質含量在門水平與毛霉菌門和子囊菌門表現出正相關，在屬水平與毛霉屬、Lipomyces、介球囊霉屬等呈正相關，大多數子囊菌門和毛霉菌門多為腐生菌，作為分解者在循環中扮演著重要角色^［24］。

本研究中真菌群落主要由腐生型營養真菌構成，該真菌通過加快土壤中動植物殘體和動物糞便的分解等，提高土壤養分，促進植物對營養物質的吸收，進一步增強煙株長勢^［25-26］。病原真菌數量的減少說明哈茨木霉通過自身的生防機制消滅了一定數量的病原菌，改善土壤微生態環境，印證了木霉良好的生防效果。

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