進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物對(duì)比分析研究

摘要：通過(guò)同時(shí)蒸餾萃取法去除4種進(jìn)口煙葉中的揮發(fā)性成分，獲得煙葉水提物，采用β-葡萄糖苷酶水解煙葉水提物中糖苷鍵合態(tài)成分，制備鍵合態(tài)香氣化合物，利用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分析鍵合態(tài)香氣化合物的組成，以揭示4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物的差異。結(jié)果表明：（1）津巴布韋、加拿大、美國(guó)、巴西煙葉中分別鑒定出鍵合態(tài)香氣化合物30、31、32、26種，含量分別為1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL；（2）主成分和層次聚類分析表明，4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)化合物成分含量存在較大差異；（3）通過(guò)OPLS-DA對(duì)不同煙葉中鍵合態(tài)化合物含量進(jìn)行分析，從4種進(jìn)口煙葉中共篩選出18種含量具有顯著差異的鍵合態(tài)香氣化合物，其中，津巴布韋煙葉中有5種，加拿大煙葉有5種，美國(guó)煙葉中有5種，巴西煙葉中有3種。結(jié)論可知，進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物的含量存在明顯差異，OPLS-DA法能以該類成分的含量有效區(qū)分4種進(jìn)口煙葉，該方法可以用于4種進(jìn)口煙葉的產(chǎn)地溯源。

關(guān)鍵詞：煙葉；β-葡萄糖苷酶；酶解；鍵合態(tài)；香氣化合物

中圖分類號(hào)：TS41⁺1""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0209-06

作為中式卷煙的重要功能原料，優(yōu)質(zhì)進(jìn)口煙葉在我國(guó)高檔卷煙葉組配方中的使用比例不斷增加，僅巴西一國(guó)的年度采購(gòu)量就已經(jīng)接近國(guó)內(nèi)收購(gòu)計(jì)劃的4%左右^［1］。除巴西以外，我國(guó)還從津巴布韋、美國(guó)和加拿大等煙葉生產(chǎn)國(guó)進(jìn)口大量?jī)?yōu)質(zhì)煙葉。但隨著國(guó)際形勢(shì)和政策的不斷變化，優(yōu)質(zhì)煙葉的進(jìn)口從數(shù)量和質(zhì)量上均受到較大制約，嚴(yán)重影響了我國(guó)重點(diǎn)品牌卷煙風(fēng)格特征和產(chǎn)品質(zhì)量的維護(hù)工作^［2-3］。因此，中國(guó)煙草總公司近年來(lái)開展了一系列替代進(jìn)口煙葉的研發(fā)工作^［4］，也取得了較大成效。然而，這些工作多集中于進(jìn)口煙葉物理特性^［5］、常規(guī)化學(xué)成分、游離態(tài)香氣物質(zhì)^［6-7］、感官質(zhì)量、生態(tài)條件^［8-9］和加工工藝^［10］等方面，對(duì)優(yōu)質(zhì)進(jìn)口煙葉中的鍵合態(tài)香氣化合物缺乏系統(tǒng)研究。

香氣化合物以游離態(tài)和鍵合態(tài)2種形式存在于天然植物中，鍵合態(tài)香氣化合物是以游離態(tài)香氣成分為配體（苷元），通過(guò)糖苷鍵與糖鍵合形成^［11］。該類成分不具有揮發(fā)性，通過(guò)一定手段斷裂糖苷鍵則可將游離態(tài)苷元釋放出來(lái)，從而達(dá)到豐富、強(qiáng)化和改善香氣的效果^［12］。目前，國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于水果、茶葉、陳皮等不同對(duì)象中鍵合態(tài)香氣化合物的研究，但針對(duì)優(yōu)質(zhì)進(jìn)口煙葉中該類成分的報(bào)道較少^［13］。此外，研究進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣成分的種類和含量，并通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行有效區(qū)分，可為優(yōu)質(zhì)進(jìn)口煙葉的溯源和替代提供重要的數(shù)據(jù)和方法支撐。因此，本研究通過(guò)同時(shí)蒸餾萃取法去除進(jìn)口煙葉中的揮發(fā)性成分，獲得煙葉水提物，采用β-葡萄糖苷酶水解煙葉水提物中糖苷鍵合態(tài)成分，制備鍵合態(tài)香氣化合物苷元，利用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）分析鍵合態(tài)香氣化合物苷元的組成。

1"材料與方法

1.1"材料、試劑與儀器

津巴布韋、巴西MBO-GX、加拿大CAO118CHC、美國(guó)2019BF1M煙葉。二氯甲烷（色譜純），山東禹王和天下新材料有限公司；β-葡萄糖苷酶（300 U/g），北京索萊寶科技有限公司；2，6-二氯甲苯（99%），百靈威科技有限公司；純凈水，娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2"主要儀器與設(shè)備

電子天平（GMC3002，南京伯尼塔科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；同時(shí)蒸餾萃取裝置（鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司）；調(diào)溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；磁力攪拌水浴鍋（HJ-4CS，常州普天儀器制造有限公司）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-5977A，美國(guó)Agilent公司）。

1.3"實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1"試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年在鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與工程學(xué)院（113.509 27°E，34.810 942°N）進(jìn)行。

1.3.2"煙葉前處理

準(zhǔn)確稱取50 g煙葉，剪碎放置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入沸石和600 mL純凈水，安裝同時(shí)蒸餾萃取裝置，裝置另一側(cè)將 100 mL 二氯甲烷放入250 mL茄形瓶中，水相第1次回流開始計(jì)時(shí)2.5 h。同時(shí)，蒸餾萃取結(jié)束后，取下圓底燒瓶，靜置冷卻，過(guò)濾。過(guò)濾后的液體即為煙葉水提物。

1.3.3"酶解煙葉

取150 mL煙葉水提物于 250 mL 藍(lán)蓋試劑瓶中，不加酶作為空白對(duì)照，加入β-葡萄糖苷酶作為處理。將空白對(duì)照與處理樣品置于磁力攪拌水浴鍋中，在50 ℃、180 r/min條件下酶解24 h。

精確量取空白對(duì)照與處理樣品10 mL置于 50 mL 離心管中，加入10 mL二氯甲烷和50 μL 2，6-二氯甲苯作為內(nèi)標(biāo)（濃度為0.590 3 mg/mL），200 r/min 渦旋振蕩10 min，以8 000 r/min離心 8 min，分液，得到有機(jī)相，重復(fù)上述操作2次合并有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)過(guò)無(wú)水硫酸鈉干燥后常壓濃縮至 1 mL，用于GC-MS分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4"GC-MS條件

色譜條件：Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)行口溫度：280 ℃；載氣：99.999% 高純度氦氣，流速：1.0 mL/min；分流比為10 ∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持0 min，然后以 10 ℃/min 的升溫速度升至180 ℃，保持25 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持0 min，以0.6 ℃/min升至210 ℃，再以4 ℃/min升至280 ℃結(jié)束。

質(zhì)譜條件：采用SCAN模式，傳輸線溫度 280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為 150 ℃；離子源為XTR-EI源，電子能量為70 eV；溶劑延遲時(shí)間為8 min；掃描范圍：10～800 amu。

1.3.5"數(shù)據(jù)分析

通過(guò)NIST 20譜庫(kù)檢索進(jìn)行化合物定性分析；采用內(nèi)標(biāo)-半定量法進(jìn)行定量分析；SIMCA 14.1進(jìn)行OPLS-DA分析，TBtools繪制聚類熱圖。

2"結(jié)果與討論

2.1"進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)化合物含量比較

通過(guò)GC-MS對(duì)4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物種類含量進(jìn)行分析，由圖1可知，4種進(jìn)口區(qū)煙葉中鍵合態(tài)香味化合物酯類、醇類含量是最多的，化合物含量高低排序?yàn)榘臀鱣t;加拿大gt;津巴布韋gt;美國(guó)。

2.2"酶解后進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)化合物含量分析

由酶解后不同地區(qū)煙葉中化合物含量變化結(jié)果（表1）可知，不同地區(qū)煙葉經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解后，煙葉中的香氣化合物含量均有增加，導(dǎo)致煙葉中化合物含量增加的原因是β-葡萄糖苷酶使煙葉中的糖苷鍵斷裂，釋放出糖苷鍵合態(tài)化合物^［14-15］。其中，經(jīng)酶處理津巴布韋、加拿大、美國(guó)、巴西煙葉中香氣化合物分別鑒定出30、31、32、26種，含量較空白對(duì)照分別增加了1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL。

4種進(jìn)口優(yōu)質(zhì)煙葉酶解后共檢測(cè)出11種醇類、6種酮類、醛類1種、酯類3種、酸類2種、酚類3種、雜環(huán)類6種、帖烯類3種，而醇類和酮類化合物是花果香、甜香主要香氣來(lái)源。其中，不同地區(qū)煙葉中均含有苯甲醇、苯乙醇、異佛爾醇、高香草醇、3-羥基-β-大馬士革酮、茄酮等香氣物質(zhì)，這些均是對(duì)煙草香氣品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)的香氣成分。除此之外，紫羅蘭醇及其衍生物是煙草中重要的香味前體物質(zhì)，如3-氧代-α-紫羅蘭醇是煙草中重要香味物質(zhì)，3-氧代-α-紫羅蘭醇高溫可以裂解成巨豆三烯酮^［16］，3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇可以裂解成4-（3-羥丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮，而巨豆三烯酮具有煙草香和辛香底韻，能顯著增強(qiáng)煙香、改善吸味、調(diào)和煙氣、減少刺激性^［17］。

酯類與酚類化合物是木香和甜香主要香氣來(lái)源，二氫獼猴桃內(nèi)酯具有木香、麝香；香蘭素具有奶香、甜香；對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚具有煙熏香，能賦予煙草特定的氣味，降低刺激性，使煙草香氣柔和細(xì)膩^［18］。

雜環(huán)類與烯烴類化合物是焦甜香、木香主要來(lái)源，2-乙酰基吡咯、5-羥甲基糠醛具有烘烤香、焦甜香^［19］，愈創(chuàng)木烯具有木香，這些香氣成分可以賦予煙草獨(dú)特的風(fēng)格特征。不同地區(qū)煙葉中鍵合態(tài)化合物含量存在差異的原因可能是，煙葉生長(zhǎng)在不同產(chǎn)地、土壤、空氣、水分等環(huán)境不同，造成煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物含量存在差異。

2.3"進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)化合物的差異性分析

為研究不同地區(qū)煙葉中鍵合態(tài)化合物含量差異，以酶解前后鍵合態(tài)化合物成分的增加量為研究對(duì)象，對(duì)不同地區(qū)煙葉中化合物含量進(jìn)行主成分分析，由圖2、圖3可知，不同地區(qū)煙葉中化合物成分存在一定差異，層次聚類結(jié)果與PCA分析結(jié)果一致。

以4種進(jìn)口煙葉作為自變量，4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物含量作為因變量，通過(guò)正交偏最小二乘法（OPLS-DA）對(duì)4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物進(jìn)行差異分析。由圖4可知，圖4-a中模型可知不同地區(qū)煙葉鍵合態(tài)物質(zhì)含量均在95%置信區(qū)間，4種進(jìn)口煙葉分別位于不同象限，表示4種進(jìn)口煙葉能夠得到有效區(qū)分。該模型中R²x為0.945，R²y為0.994，Q²為0.989，因自變量R²和預(yù)測(cè)指數(shù)Q²均gt;0.5，表明該模型穩(wěn)定可接受^［20］。圖4-b是經(jīng)過(guò)200次置換檢驗(yàn)驗(yàn)證分析模型中是否存在過(guò)擬合現(xiàn)象，模型的預(yù)測(cè)指數(shù)Q²與y軸相交于負(fù)半軸，說(shuō)明模型擬合有效，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象^［21］，說(shuō)明該模型能夠用于后續(xù)對(duì)4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物進(jìn)行有效區(qū)分。

通過(guò)OPLS-DA分析，篩選出VIP值gt;1的18種香氣化合物，作為區(qū)分4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物成分差異性分析（圖4）。由圖5可知，顏色是從藍(lán)色到紅色的等級(jí)進(jìn)行設(shè)計(jì)，相對(duì)含量從低到高逐漸遞增，便于不同地區(qū)煙葉之間差異區(qū)分。其中，津巴布韋煙葉中茄酮、對(duì)羥基苯乙醇、2-乙酰基吡咯、香蘭素、N-甲基-2-吡咯甲醛含量較為突出；美國(guó)煙葉中（E）-松柏醇、癸醛、3-羥基-β-大馬士革酮、地黃普內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛等含量較為突出；巴西煙葉中3-羥基-5，6環(huán)氧-β-紫羅蘭醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、菜籽多酚含量較為突出；加拿大煙葉中3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、1，5-二羥基-β-紫羅蘭酮、DDMP、愈創(chuàng)木烯含量較為突出，可以通過(guò)香氣化合物的成分含量差異作為鑒定區(qū)分4種進(jìn)口煙葉。

煙葉的風(fēng)格特征與煙葉中游離態(tài)和鍵合態(tài)香氣化合物有著密切的關(guān)系，津巴布韋煙葉香氣獨(dú)特飄逸、刺激性小可能與煙葉中鍵合態(tài)香氣化合物茄酮、2-乙酰基吡咯等含量有關(guān)^［22］；美國(guó)煙葉香氣濃度飽滿可能與（E）-松柏醇、5-羥甲基糠醛、3-羥基-β-大馬士革酮等含量有關(guān)；巴西煙葉香氣清晰、香氣爆發(fā)力足可能與3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、3-氧代-5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭醇等含量有關(guān)^［13］；加拿大煙葉香氣細(xì)膩柔和、圓潤(rùn)感好可能與3-氧代-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯等含量有關(guān)^［23］。

3"結(jié)論

采用β-葡萄糖苷酶對(duì)不同地區(qū)煙葉水提物進(jìn)行酶解，利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析不同地區(qū)煙葉中糖苷鍵合態(tài)化合物成分，得出結(jié)論：（1）經(jīng)酶處理津巴布韋、加拿大、美國(guó)、巴西煙葉中香氣化合物分別鑒定出30、31、32、26種，含量較空白對(duì)照分別增加了1 082.85、1 200.38、1 014.44、1 181.88 μg/mL；（2）主成分和層次聚類分析結(jié)果表明，4種進(jìn)口煙葉鍵合態(tài)化合物成分含量存在較大差異；（2）對(duì)VIP值gt;1 的化合物，通過(guò)OPLS-DA對(duì)不同煙葉中鍵合態(tài)化合物含量進(jìn)行分析，共篩選出4種進(jìn)口煙葉中18種差異鍵合態(tài)香氣化合物，其中，津巴布韋煙葉中含量較為突出的有5種香氣化合物，包括茄酮、對(duì)羥基苯乙醇、2-乙酰基吡咯、香蘭素、N-甲基-2-吡咯甲醛；加拿大煙葉中含量較為突出的有5種香氣化合物，包括3-氧代-7，8-二氫-α-紫羅蘭醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、1，5-二羥基-β-紫羅蘭酮、DDMP、愈創(chuàng)木烯；美國(guó)煙葉種含量較為突出的有5種香氣化合物，包括（E）-松柏醇、癸醛、3-羥基-β-大馬士革酮、地黃普內(nèi)酯、5-羥甲基糠醛；巴西煙葉中含量較為突出的有3種香氣化合物，包括 3-羥基-5，6環(huán)氧-β-紫羅蘭醇、3-羥基-7，8-二氫-β-紫羅蘭醇、菜籽多酚。

本研究通過(guò)化學(xué)計(jì)量法對(duì)4種進(jìn)口煙葉中鍵合態(tài)香氣成分的種類和含量進(jìn)行對(duì)比分析，初步明確了4種進(jìn)口煙葉中18種差異香氣化合物。本研究方法能有效表征4種進(jìn)口煙葉產(chǎn)地的特征香氣成分，可以用于煙葉產(chǎn)地溯源。

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