腸桿菌F8-H發酵道真煙葉宏基因組及相關性分析

摘要：為探究腸桿菌F8-H發酵道真煙葉作用機制，分析發酵前后煙葉香味成分的變化，利用宏全基因組學分析發酵過程中煙葉表面微生物群落和基因豐度變化，并進行相關性分析。結果表明，發酵后煙葉中4，7，9-巨豆三烯酮A、二氫獼猴桃內酯以及茄酮的相對含量分別增加了10.34%、16.59%和10.50%，新檢測到植酮和橙化基丙酮這2種香味物質；煙絲發酵過程中，微生物相對豐度呈先增加后降低趨勢，其中腸桿菌屬、乳酸桿菌屬和寡養單胞菌屬呈增長趨勢；腸桿菌屬、植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬會在糖基轉移家族酶GT1的作用下與植酮、橙化基丙酮的形成與積累呈正相關關系，鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬在碳水化合物合酶家族CBM48的作用下與二氫獼猴桃內酯、茄酮和3種4，7，9-巨豆三烯酮的形成與積累呈正相關關系。初步揭示了腸桿菌F8-H發酵道真煙葉（2018 C3F-A 云煙87）的機制，為微生物發酵技術在煙草生產中的應用打下理論基礎。

關鍵詞：腸桿菌；發酵；煙葉；宏基因組；酶；差異分析

中圖分類號：S572.01""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0193-09

腸桿菌屬（Enterobacter）微生物是水稻^［1］、煙草^［2］等高等植物常見優勢菌屬，具有固氮^［3］、溶磷^［4］、解鉀^［5］等功能。研究發現，腸桿菌屬微生物因其遺傳多樣性豐富被廣泛應用于醫學防控和生物產氫^［6］等領域中，同時，陰溝腸桿菌可有效抑制煙草赤星病，可被用作生物防病菌^［7］，霍氏腸桿菌發酵煙葉后感官品質得到明顯提升，富有清甜香氣和潤感^［8］。

目前，微生物發酵煙葉作為一種重要的技術手段，廣泛應用于提升煙葉品質、提高煙葉等級和改善吸食品質等方面^［9］。例如，Izquierdo用微生物菌株發酵煙葉后，香味提升，生物堿濃度下降^［10］。黃靜文等用短小芽孢桿菌發酵煙葉后，卷煙吸食品質明顯提高^［11］；陳興等用西姆芽孢桿菌發酵煙葉能提高煙葉質量^［12］。已有部分研究從煙葉香味成分角度分析微生物發酵煙葉的機制，葉建斌等采用一株腸桿菌發酵煙草浸提液后發現茄酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮等煙草特征香味成分明顯增加^［13］；盧紅兵等利用水蒸氣蒸餾法－氣質聯用法分析了38種煙葉的香味成分，并通過香味成分評價卷煙內在品質^［14］；周正紅等分析了煙草香味化學成分對卷煙吸食品質的影響^［15］。同時，亦有研究者從煙葉表面微生物群落演替和發酵過程中煙葉表面酶基因豐度變化角度分析微生物發酵煙葉的機制^［16］。但是，將特定微生物、酶基因以及煙葉香氣成分關聯分析來解釋微生物發酵煙葉機制的報道較少。

筆者所在課題組前期研究表明，腸桿菌屬（Enterobacter）發酵道真煙葉可增加其香氣，提高甜潤感，改善煙葉吸食品質。為闡明該菌發酵道真煙葉的作用機制，本研究分析發酵前后煙葉香味成分的差別，利用宏全基因組學分析發酵過程中煙葉表面微生物群落變化和基因豐度變化，通過關聯微生物、酶基因以及煙葉香氣成分，以期揭示腸桿菌發酵提升道真煙絲品質的機制，為后期應用打下基礎。

1"材料與方法

1.1"儀器與材料

主要材料：道真煙葉（2018 C3F-A 云煙87）由甘肅煙草工業有限責任公司技術中心提供；腸桿菌（Enterobacter F8-H）由鄭州輕工業大學煙草行業煙草工業生物技術重點實驗室分離并保存。

主要試劑：二氯甲烷，購自山東禹王和天下新材料有限公司；酵母粉和蛋白胨，購自賽默飛世爾科技公司；H3PO4，購自安徽六國化工股份有限公司；NaH2PO4-2H2O，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜級），購自天津市四友卓越科技有限公司；MgSO4、NaCl、瓊脂，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要儀器：DHP-9162型恒溫培養箱（太倉市科教器械廠）、TH2-C型恒溫搖床（太倉市試驗設備廠）、7890C型GC-MS聯用儀（美國Agilent公司）。

培養基：菌株培養采用LB液體培養基（酵母粉含量0.5%、蛋白胨含量1%、氯化鈉含量1%）；LB固體培養基（酵母粉含量0.5%、蛋白胨含量1%、氯化鈉含量1%、瓊脂含量2%），上述培養基均在 121 ℃ 高壓滅菌20 min；PBS緩沖液（稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于800 mL蒸餾水中，用HCl調節溶液pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1 L即可）。

1.2"試驗方法

1.2.1"菌株的制備

從-80 ℃冰箱中取出腸桿菌菌株F8-H，-20 ℃冰箱解凍20 min，轉移至4 ℃冰箱解凍30 min，按1%接種至LB液體培養基中，30 ℃、150 r/min條件下培養12 h，進行梯度稀釋涂板，30 ℃培養12 h；挑選出生長狀況良好的單菌落按1%接種至LB液體培養基，在30 ℃、150 r/min條件下培養至D600 nm=1左右，獲得種子液；將種子液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心8 min，用無菌水復溶后，再次離心得到干凈的菌體，備用。

1.2.2 "菌株發酵煙絲

將菌株菌體用無菌水稀釋至原來的2倍后，再按照煙絲質量的15%均勻噴灑于500 g煙絲表面，裝入密封袋，放于35 ℃的發酵箱中進行靜態發酵8、16、24、36 h，以等量無菌水相同條件發酵煙絲0 h為空白組。發酵結束后，無菌袋中密封，置于-80 ℃保存，留樣，送測。

1.2.3"煙絲感官評吸

從-80 ℃冰箱中取出發酵后的煙絲，160 ℃烘2 min。發酵組（24 h）與空白組（0 h）卷制成成品煙支，由13名專業評吸人員組成評吸小組，采用對比評吸并依據九分制單料煙評吸標準進行感官評價。

1.2.4 "煙絲香味成分測定

從-80 ℃冰箱中取出發酵后的煙絲，160 ℃烘2 min，然后，置于40 ℃烘箱2 h，取出打成粉末，過孔徑0.35 mm篩。稱取2 g煙末放于離心管，加入10 mL PBS，渦旋靜置 5 min （2 500 r/min），加入10 mL色譜乙腈，50 μL內標（2，6-二氯甲苯 0.209 6 g/L）渦旋20 min （2 500 r/min），放入-20 ℃冷凍30 min，加入1.5 g NaCl和6 g MgSO4，快速搖勻，加入5 mL色譜二氯甲烷，渦旋10 min （2 500 r/min），離心3 min （8 000 r/min），除水，濃縮，過濾，GC-MS檢測。分析條件為色譜柱：HP-5MS毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃；進樣量1.0 μL；載氣He；流速1.0 mL/min；分流比為不分流；升溫程序：50 ℃保持4 min，3 ℃/min升至70 ℃并保持5 min，2 ℃/min升至100 ℃并保持17 min后，繼續升溫至120 ℃保持10 min，再以6 ℃/min升至280 ℃。質譜條件：電離方式為電子轟擊（EI），電子能量70 eV；溶劑延遲10 min；全掃描檢測，掃描質量范圍（m/z）35～500 amu。將煙葉中性香味成分的GC檢測結果利用NIST20標準譜庫進行檢索，結合標準樣品的GC保留時間和煙草中化學成分進行定性分析。對有標準樣品的香味成分采用GC內標工作曲線法定量，沒有標準樣品的香味成分采用峰面積相對定量法（化合物峰與內標峰面積之比）定量。

1.2.5"菌株宏基因組測定

從-80 ℃冰箱中取出發酵后的煙絲。干冰保藏送至上海派森諾生物科技股份有限公司測序，每組3個平行，宏基因組二代測序，基于Illumina NovaSeq/HiSeq高通量測序平臺，采用全基因組鳥槍法（WGS）策略，將提取獲得的菌群宏基因組總DNA隨機打斷為短片段，并構建合適長度的插入片段文庫，對這些文庫進行雙端（PE）測序。采用hmmscan軟件來預測在基因組序列中存在的CAZy酶類基因。根據測序結果及分析軟件可以對多樣本的群落組成和系統發育信息進行多樣性分析、差異顯著性檢驗、功能預測等一系列深入的統計學和可視化分析。

1.2.6"相關性分析

采用R語言對煙葉表面微生物間的相關性進行分析。基于Spearman相關系數，分析優勢菌株之間、優勢菌株與代表性香味成分之間、功能酶與代表性香味成分之間以及優勢菌株與功能酶之間的相關性。

2"結果與分析

2.1"煙絲感官評吸變化

腸桿菌F8-H發酵煙絲前后的煙絲感官評吸結果見圖1，可以看出，發酵后煙絲的香氣質、香氣量均有提高，濃度稍增大，余味稍好，雜氣稍減弱，刺激性無變化，勁頭也有相應提高，較空白組總分提高1分，煙葉的吸味品質有所提升。王文婷等研究發現，腸桿菌發酵BEQ煙葉后，香氣質提高，潤甜感突出，雜氣和刺激性降低，較未處理樣品總分提高2分，感官品質得到明顯提升^［8］；葉建斌等研究發現，加入腸桿菌發酵煙草浸膏的卷煙（K2）較加入未發酵煙草浸膏的卷煙（K1）雜氣減輕，潤感提升，刺激減小，回甜、余味均有提高，卷煙內在品質提高^［13］。這些研究結果與本研究結果大致相同。

2.2"菌株發酵煙絲前后香味成分變化

煙絲發酵前后香味成分變化見表1。可以看出，發酵24 h后，煙葉中多種香味成分的相對含量有不同程度的提升，其中類胡蘿卜素的降解產物如4，7，9-巨豆三烯酮A、4，7，9-巨豆三烯酮B、4，7，9-巨豆三烯酮C分別增加了10.34%、12.91%、10.88%；二氫獼猴桃內酯、茄酮、4-羥基-β-二氫大馬酮分別增加了16.59%、10.50%和14.92%；植酮和橙化基丙酮是煙絲發酵后產生的新香味物質。二氫大馬酮、茄酮、植酮、橙化基丙酮等物質可以提升煙氣濃度，柔和煙氣^［17-19］。這些成分的增加有利于改善煙絲的感官品質。

王文婷等利用腸桿菌發酵煙絲，結果發現，巨豆三烯酮、茄酮和二氫大馬酮含量較發酵前分別提高37.40%、59.87%和46.61%^［8］；李石頭等利用宏基因組學解析云南煙葉在不同陳化時間表面微生物群落結構及功能基因演替，發現煙葉陳化過程中茄酮、大馬酮以及巨豆三烯酮等總體呈增長趨勢^［20］；Zheng等利用微生物發酵雪茄煙葉發現，發酵后的煙葉中二氫大馬酮、茄酮、巨豆三烯酮等香氣成分含量明顯增加^［9］。本研究結果與這些研究結果大致相同。

2.3"發酵煙絲表面微生物變化分析

為探究發酵前后煙葉表面微生物的群落變化，采用韋恩（Venn）圖進行發酵過程中煙葉表面微生物群落分析。分類單元（OTU）的數量可以表示樣

本物種的相對豐度^［21］，以97%的序列同一性進行過濾后，煙葉表面微生物群落多樣性差異韋恩圖見圖2。可以看出，空白（T0）組只有39個OTU；煙葉發酵16 h （T16）后，OTU數量增加至232個；煙葉發酵24 h （T24）后，OTU數量增加至421個；發酵處理36 h （T36）后，OTU數量略減至368個。隨著發酵時間的延長，煙葉表面微生物物種數量呈先增加后降低趨勢。由此可知，微生物物種的多少可能影響著發酵后煙絲吸食品質的優劣，微生物物種在一定的發酵時間內越多，卷煙的吸食品質越好，超過最適發酵時間，微生物之間的競爭增強，可能導致處于劣勢的微生物死亡，從而使微生物物種數量減少，影響發酵后煙絲的吸食品質^［18］。

為進一步分析韋恩圖中各個區域的物種豐度組成，在屬水平上統計每個處理組相應OTU的豐度。由圖3可知，每個處理組檢測到的序列片段主要分布在20個菌屬，其中對照組（T0）檢測到假單胞菌屬（Pseudomonas，18.32%）、鞘單胞菌屬（Sphingomonas，16.62%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，11.63%）、科薩克氏菌屬（Kosakonia，11.55%）和腸桿菌屬（Enterobacter，5.22%）為優勢菌屬。這一結果與Huang等的研究結果^［22-23］基本一致。煙絲發酵24 h后，煙絲表面細菌群落發生改變，不僅體現在菌屬種類上的增加，而且同一菌屬的數量也會有所改變。24 h時為假單胞菌屬（Pseudomonas，29.82%）、鞘單胞菌屬（Sphingomonas，17.39%）、腸桿菌屬（8.97%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，3.93%）和科薩克氏菌屬（Kosakonia，2.40%）為優勢菌。優勢菌株發生數量上的變化，其原因可能是將適量的菌株噴灑于煙絲表面后，對煙絲表面原有微生物種群產生影響，改變煙絲表面原有的微生物群落結構。腸桿菌接種煙絲后，菌株快速定殖，同時假單胞菌屬和鞘單胞菌屬微生物也在快速生長增殖，推測上述微生物對發酵煙絲有著積極的作用。同時，科薩克氏菌屬生長受到抑制，而且在數量上還有相應的減少，該菌株可能在菌株發酵煙絲過程中不適應該煙絲表面微生物環境。

2.4"發酵煙絲表面功能酶分析

煙絲發酵24 h后，采用hmmscan軟件來預測在基因組序列中存在的CAZy酶類基因，比對結果選取ORF序列長度gt;80個氨基酸，E-value臨界值設置為1×10^-5；氨基酸序列比對長度大于數據庫當中氨基酸序列的30%；若序列比對長度lt;80個氨基酸，E-value臨界值設置為1×10^-3，氨基酸序列比對長度大于數據庫當中氨基酸序列的30%也作為選取對象。CAZy分析的結果統計見表2。獲取到的基因豐度前20名的功能酶家族分別為GT1、CBM48、GH1、GH2、GH20、GT4、GH16、GH43、CE4、CBM50、E8、GH23、GH3、GH13、GH0、GT28、GT0、GT51、GT2、GH5。

2.5"優勢菌株間關聯性分析

微生物相互作用與群落結構密切相關，為闡明接種菌株與煙葉表面原有微生物之間的相互作用。采用Spearman相關系數分析微生物之間相關性已廣泛應用于發酵領域^［24-25］。本研究利用Spearman相關系數分析煙葉微生物（20種）之間的關系，繪制相關性熱圖（圖4），圖中藍色表示負相關，綠色表示正相關，顏色隨右側色階變化。由圖4可知，煙絲表面腸桿菌屬與植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）和寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）呈正相關關系，說明雖然腸桿菌發酵期間豐度提升不大，但該菌株與植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬在煙葉發酵過程中可能具有協同作用，共同影響煙葉品質。鞘單胞菌屬（Sphingomonas）與叢毛單胞菌屬（Comamonas）呈正相關關系。

2.6"優勢菌株與代表性香味成分關聯性分析

為闡述菌株發酵煙絲過程中微生物表面優勢菌株與香味成分之間的關系，利用Spearman相關系數分析煙葉微生物（20種）與香味成分（17種）之間的關系，繪制相關性熱圖（圖5）。由圖5可知，腸桿菌屬與植酮、橙化基丙酮等呈正相關關系，與植酮的相關性強于橙化基丙酮。另外，與腸桿菌屬具有正相關性的植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬也與這些成分正相關，并且與植酮的相關性也強于橙化基丙酮，推測這3種菌株在微生物代謝方面具有協同作用，可共同影響香味成分的變化。鞘單胞菌屬（Sphingomonas） 和毛單胞菌屬（Comamonas）與二氫獼猴桃內酯、茄酮、4，7，9-巨豆三烯酮A、4，7，9-巨豆三烯酮B、4，7，9-巨豆三烯酮C呈正相關關系。這些菌屬是煙葉發酵過程中產生香味成分的重要貢獻者，如腸桿菌屬微生物已被證實可利用煙草果膠^［26］、有機酸等物質^［27］。腸桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬微生物是雪茄煙發酵過程中的優勢菌，與植酮、茄酮等香味成分的生成呈正相關關系^［28］。

2.7"功能酶與香味成分關聯性分析

為闡述菌株發酵煙絲過程中功能酶與香味成分之間的關系，利用Spearman相關系數分析煙葉微生物功能酶（20種）與香味成分（17種）之間的關系，繪制相關性熱圖（圖6）。可以看出，GT1家族酶與植酮、橙化基丙酮呈正相關關系，與植酮的相關性大于橙化基丙酮。同時，糖基轉移酶GT1家族酶也與腸桿菌屬呈正相關關系（圖7），進一步說明，在腸桿菌發酵煙絲過程中產生的GT1家族酶對植酮和橙化基丙酮的形成和積累起一定的作用。CBM48家族酶與二氫獼猴桃內酯、茄酮和3種 4，7，9-巨豆三烯酮呈正相關關系。CBM48家族酶與鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬也呈正相關關系，進一步說明，在發酵煙絲過程中鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬中的CBM48家族酶與二氫獼猴桃內酯、茄酮和3種4，7，9-巨豆三烯酮的形成和積累起一定的作用。

2.8"優勢菌株與功能酶關聯性分析

為闡述煙絲發酵過程中優勢菌株與功能酶之間的關系，利用Spearman相關系數分析煙葉微生物（20種）與功能酶（20種）之間的關系，繪制相關性熱圖（圖7）。可以看出，腸桿菌屬、植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬都與糖基轉移酶（GTs）中GT1家族酶呈正相關關系，進一步說明，這3種菌株可能協同在GT1家族酶的作用下，對植酮、橙基化丙酮等香味成分的形成和積累起一定的作用。

在煙草表面微生物群落里，不同的菌株會產生不同的酶發揮作用，鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬與碳水化合物結構域（CBM）中CBM48家族酶都呈正相關關系，由此可知，在發酵煙絲過程中可能是CBM48家族酶對二氫獼猴桃內酯、茄酮和3種 4，7，9-巨豆三烯酮等香味成分的積累和形成起一定的作用。因此，在煙葉表面可能會有一種或多種菌株或酶在相互作用，從而協調煙草品質，對煙草進一步的利用起到關鍵作用。

3"結論與討論

本研究利用腸桿菌（F8-H）發酵道真煙葉（2018 C3F-A 云煙87）。煙絲發酵后，二氫獼猴桃內酯、茄酮、4-羥基-β-二氫大馬酮和4，7，9-巨豆三烯酮A、4，7，9-巨豆三烯酮B、4，7，9-巨豆三烯酮C等重要中性致香成分含量明顯增加；另外發現2種新香味成分產生，分別為植酮和橙化基丙酮，這2種物質的產生有利于改善煙葉的吸食品質。

在發酵煙絲過程中，腸桿菌屬、植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬對植酮和橙基化丙酮的形成和積累有一定作用，并且腸桿菌屬與植物乳桿菌屬、寡養單胞菌屬呈正相關關系；糖基轉移酶中GT1家族酶對植酮和橙化基丙酮的形成和積累起一定作用，并且腸桿菌屬、植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬與GT1家族酶呈正相關關系；鞘單胞菌屬、叢毛單胞菌屬與二氫獼猴桃內酯、茄酮、3種4，7，9-巨豆三烯酮的形成和積累有一定的作用，并且鞘單胞菌屬與叢毛單胞菌屬呈正相關關系；碳水化合物結構域中，CBM48家族酶對二氫獼猴桃內酯、茄酮、3種4，7，9-巨豆三烯酮積累有一定的作用，并且鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬與CBM48家族酶呈正相關關系。

在菌株發酵煙絲過程中，不同的菌株和酶會對不同的香味成分起作用，并且可能會有一種或幾種菌株起協同作用，腸桿菌屬、植物乳桿菌屬和寡養單胞菌屬會利用糖基轉移酶中的GT1家族酶，協同對植酮和橙化基丙酮的形成和積累起作用；鞘單胞菌屬和叢毛單胞菌屬會利用碳水化合物結構域中的CBM48家族酶，協同對二氫獼猴桃內酯、茄酮和3種4，7，9-巨豆三烯酮的積累起作用，進而達到提升煙葉吸食品質的效果。本研究初步揭示腸桿菌發酵道真煙葉（2018 C3F-A 云煙87）的機制，為微生物發酵技術在煙草生產中的應用打下理論基礎。

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