轉GbHCT13、GbHCT15基因棉花的篩選鑒定及農藝性狀、產量性狀和纖維品質分析

摘要：對轉GbHCT基因棉花葉片進行草銨膦除草劑濃度梯度篩選，通過對農藝性狀、產量性狀和纖維品質進行分析，探討目的基因GbHCT在棉花纖維發育中的作用。通過60、70、80 μL/L濃度的除草劑初步篩選抗性植株，測量經標記基因PCR鑒定為陽性的植株的農藝性狀、產量性狀和纖維品質，并進行相關性分析。結果得出：（1）當草銨膦除草劑濃度為80 μL/L時篩選效果最佳，噴施除草劑9 d后轉GbHCT13品系存活率為0.85%，其中60%存活植株能擴增出標記基因片段；轉GbHCT15品系存活率為0.90%，其中80%存活植株能擴增出標記基因片段。（2）與受體Y1169相比，2個轉基因品系的農藝性狀存在顯著差異，單鈴重均有所下降，產量性狀顯著增加。（3）與對照相比，2個轉基因品系經目的基因導入后纖維品質指標均有所變化，其中轉GbHCT13品系的斷裂伸長率、成熟度和短纖維指數均上升，其他纖維指標均下降，而轉GbHCT15品系的馬克隆值、光透亮和短纖維指數有所下降，成熟度變化不大，其余纖維指標均上升；對比2個轉基因品系的纖維指標得出，轉GbHCT15品系的纖維伸長更為明顯。經除草劑篩選、PCR鑒定及室內加代篩選得出，GbHCT基因可以在后代中穩定遺傳，該基因導入受體后，2個轉基因品系的農藝性狀、產量性狀和纖維品質均有所變化，其中轉GbHCT15品系變化更為明顯。

關鍵詞：轉基因棉花；HCT基因；農藝性狀；纖維品質

中圖分類號：S512.103""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0069-09

新疆是我國的主要產棉區，其種植的海島棉具有優良的纖維品質，而纖維品質是衡量棉花品質的關鍵，不斷挖掘棉纖維發育相關基因功能不僅對探究棉花優異的纖維品質有著重大作用，而且對篩選優異的棉花品種具有現實意義。20世紀末，世界成功研究出首例轉基因作物——含抗生素抗性的轉基因煙草^［1］。隨后相繼開展轉基因抗蟲、抗除草劑的創新型作物研究，這為作物抗病以及纖維品質提高、纖維發育調控等方面的轉基因研究提供了思路^［2-5］。目前關于外源基因能否穩定遺傳給后代仍存在一些爭論。一些研究表明，外源基因一旦導入到受體植株的基因組中，完整外源基因即可穩定傳遞給后代^［6］。陳淼平在研究轉crylAb基因水稻時發現，導入的目的基因在子代中能夠表達抗蟲效應，且該基因穩定遺傳給后代^［7］。也有研究認為，一些外源基因受拷貝數與受體不同、轉化方法不成熟以及外界不可控環境因素的影響，不能穩定遺傳^［8-11］。轉基因植株中的外源基因會發生基因漂移，因而需通過擴大群體，不斷地雜交后代并進行鑒定，以篩選出穩定遺傳給后代的轉基因植株^［12］。羥基肉桂酰基轉移酶（hydroxycinnamoyl transferase，HCT）是一種木質素合成酶，在木質素單體合成中起著上下游調節作用。21世紀初，Hoffmann等從煙草莖中分離提取出一種蛋白質，這種蛋白質不僅能夠?；喾N底物，還具有莽草酸/奎尼酸酯?；D移酶的雙重活性，因此將其命名為羥基肉桂?；D移酶^［13］。通過調控HCT基因的表達量，可調節植物中的木質素含量，由此可以證實，HCT可以促進纖維發育^［14］。因此，通過對HCT基因的調控可實現纖維品質的改變。將目的基因導入受體材料中，轉基因陽性植株可以通過表型抗性進行篩選，再經分子水平鑒定，結合目標性狀可確定導入的目的基因在轉基因植株后代中是否得到穩定遺傳和表達^［15］。為進一步研究調控纖維的HCT基因導入受體后對受體纖維品質產生的影響，通過不同濃度的除草劑對轉基因陽性植株進行初步篩選，再經PCR對轉基因陸地棉進行鑒定，分析目的基因GbHCT轉入受體后，植株各性狀發生的變化及轉基因在植株體內的表達情況，最后對在試驗田種植的轉GbHCT基因棉花的農藝性狀、產量性狀和纖維品質進行相關性分析，探討目的基因GbHCT在棉花纖維發育中的作用。

1"材料與方法

1.1"材料

轉基因材料是新疆農業大學作物遺傳改良與種質創新重點實驗室采用農桿菌介導法將目的基因GbHCT13、GbHCT15導入到陸地棉Y1169中獲得的，其中目的基因GbHCT來自海島棉新海21。試驗于2021年在新疆塔城地區沙灣市新疆農業大學棉花育種基地（43°20′～45°20′N，84°45′～86°40′E）進行，對照材料Y1169與轉基因材料均采用人工點播方式、覆膜種植，每條膜行長 5 m，對照組材料株距為10 cm，每條膜種植3行；轉基因材料種植密度較大，共種植9行，每3行1個重復，每條膜約5 000棵，轉基因棉花用地與對照組用地肥力基本一致，因需噴灑除草劑，田間管理與其他試驗用地分開。

1.2"試驗方法

1.2.1"除草劑篩選

設置60、70、80 μL/L 3個草銨膦除草劑Basta濃度梯度（表1），在長出第4～5張葉片時分別噴施試驗材料，在噴施后3、6、9 d觀察并記錄棉花子葉的反應，統計噴施后轉基因材料的存活株數。收集T2代種子在室內種植，通過涂抹除草劑進行加代篩選。

1.2.2"PCR鑒定

取噴施高濃度除草劑后未發生變色的植株頂端幼嫩葉片，采用改良的CTAB法^［16］提取棉花基因組DNA，用篩選標記基因bar引物（表2）進行PCR鑒定。

1.2.3"轉GbHCT基因對陸地棉Y1169農藝性狀、產量及纖維品質的影響

2021年試驗地天氣狀況良好，灌溉及時，棉花生長狀況良好。8月底開始對棉花進行打頂，同時開始打脫葉劑；9月棉花生長進入吐絮期，此時測量轉基因棉花的農藝性狀；10月棉花進入收獲期，收取棉花正常吐絮鈴，用棉花軋花機分離皮棉與籽棉，并用天平測定重量，取其中15 g左右皮棉，送至新疆農墾科學院進行纖維品質測定。對測得的農藝性狀、產量性狀和纖維品質進行相關性分析。

2"結果與分析

2.1"轉基因材料篩選

通過圖1可以看出，噴施除草劑后，A組葉片沒有發生任何變化，B組葉片出現黃色斑點，C組葉片有較明顯黃化特征，由于除草劑產生藥害約需3 d時間，當棉花長出子葉后，用80 μL/L草銨膦除草劑噴施棉花真葉，轉基因棉花葉片沒有發生反應，生長點也未產生枯死反應，而非轉基因棉花葉片出現枯死斑點，莖尖生長點干枯。每隔3 d噴施1次 80 μL/L 草銨膦除草劑，9 d后對噴施草銨膦除草劑的葉片進行觀察，發現未轉GbHCT基因植株的涂抹部位出現枯死斑點，而轉GbHCT基因植株葉色正常。

本試驗中，大田共種植轉GbHCT13基因棉花 4 730株、轉GbHCT15棉花3 870株（表3），經高濃度除草劑篩選后，對存活的40株轉GbHCT13、35株轉GbHCT15棉花進行取樣，并進行室內PCR鑒定。

2.2"PCR檢測結果分析

為進一步驗證轉基因陽性植株，對草銨膦除草劑涂抹部位的葉片沒有出現反應的植株進行PCR驗證。結果表明，87%以上的抗除草劑轉基因棉花的新生葉片能擴增出大小為475 bp的標記基因片段，而對除草劑敏感的植株未擴增出標記基因產物。利用除草劑篩選和PCR檢測相結合的方法對試驗田中用于測定農藝性狀的T2代轉基因棉花進行鑒定。

PCR鑒定結果見圖2。轉GbHCT13品系的陽性率為60.0%，陽性植株共24株，轉GbHCT15品系的陽性率為80.0%，陽性植株共28株。

2.3"室內加代檢測

通過大田試驗觀察最終的子葉受害程度發現，當除草劑濃度為60 μL/L時，葉色基本無變化；當除草劑濃度為70 μL/L時，葉片有少量反應；當除草劑濃度為80 μL/L時，葉片反應明顯，與周圍正常葉色相比表現出明顯差異，且噴施過后大部分棉花植株死亡。60、70 μL/L的草銨膦噴灑至葉片后，葉片反應不能排除棉花自身對除草劑產生抗性所造成的假陽性，因此在使用時可以排除這2個濃度，而 80 μL/L 的除草劑噴灑至葉片后，葉片反應可基本消除是由棉花自身對除草劑產生的抗性所造成的，并且對棉花植物的正常生長產生影響，因此可以作為除草劑篩選轉基因棉花與否的標準。在室內加代篩選中，直接選取80 μL/L的除草劑進行篩選。

收集在田間試驗中被鑒定為陽性的轉基因棉花種子，取少量種植于室內進行加代鑒定，待長出 2～3張真葉時，涂抹濃度為80 μL/L的除草劑至葉片上，每隔3 d涂抹1次，取少量涂抹后無反應的葉片（圖3），提取植株總DNA進行PCR檢測。部分轉基因植株對濃度為80 μL/L的除草劑有葉片反應，對未對除草劑產生葉片反應的植株進行標記基因鑒定。

取鮮嫩葉片提取棉花DNA，以陸地棉Y1169為陰性對照，含有標記基因的質粒載體為陽性對照，對標記基因進行PCR鑒定。由標記基因鑒定結果（圖4）可知，在8個樣品中有6個樣品含標記基因，片段大小均為475 bp， 表明目的基因成功導入到這6條含有特異性條帶的植株中。確定T3代轉GbHCT13品系棉花的陽性率為83.0%，轉GbHCT15品系棉花的陽性率為82.1%（表4）。

2.4"農藝性狀的比較分析

2.4.1"轉GbHCT基因品系與對照棉花農藝性狀比較分析

采用SPSS軟件對所測得的農藝性狀進行單因素方差分析與顯著性差異分析，結果（表5）顯示，不同品系在果枝數、有效果枝數、鈴數和有效鈴數上存在顯著差異。對農藝性狀進行進一步多重比較分析可得，轉GbHCT13品系的株高與對照Y1169相比顯著增加，而轉GbHCT15品系的株高與對照Y1169相比略有增加；轉GbHCT15品系的果枝數、有效果枝數與對照Y1169相比顯著增加，而轉GbHCT13品系與對照組相比略有升高；在鈴數方面，轉GbHCT15品系的掛鈴數更多，轉GbHCT13品系和轉GbHCT15品系的鈴數、有效鈴數與對照組相比顯著或極顯著增加。由以上結果可以得出，目的基因導入到受體后，農藝性狀發生顯著變化，各項農藝性狀指標均有升高；綜合來看，轉GbHCT15品系和轉GbHCT13品系與對照相比，果枝數、有效果枝數、鈴數和有效鈴數存在顯著差異。

2個轉基因品系與Y1169相比，差異見圖5。在鈴數、有效鈴數、果枝數、有效果枝數中轉GBHCT13最大值低于轉GBHCT15；轉GBHCT13、轉GBHCT15在農藝性狀方面最大值均高于Y1169。轉GBHCT13、轉GBHCT15材料的中位數均高于Y1169，即轉基因材料農藝性狀優于Y1169。

2.4.2"產量性狀的比較分析

采用Excel與SPSS軟件進行統計分析，結果發現，轉GbHCT基因的2個品系的產量性狀與對照Y1169相比差異明顯，轉基因品系單鈴重較對照組有所減少。

對10月收獲的棉花進行單獨計數，測平均單鈴重、衣分、籽棉產量和皮棉產量等指標，結果（表6）顯示，與對照Y1169相比，2個轉基因品系的棉花單鈴重均有所降低，其中轉GbHCT13品系的單鈴重與對照組相比降低了10.9%，平均為4.1 g，而轉GbHCT15品系的平均單鈴重為4.2 g，與對照組相比降低8.7%。

2個轉基因品系間的衣分含量與對照組Y1169相比，轉GbHCT13品系的衣分增長不顯著，增長率為4.9%，而轉GbHCT15品系衣分顯著增長，增長率為7.3%。此外，通過對比發現，轉基因棉花的皮棉產量與籽棉產量較對照組有所增加，其中轉GbHCT13品系的籽棉產量平均增加16.4%，轉GbHCT15品系的籽棉產量顯著增加44.0%，轉GbHCT13品系的皮棉產量平均增加21.0%，轉GbHCT15品系的皮棉產量顯著增加41.1%。

2.4.3"轉基因品系農藝性狀與產量性狀相關分析

由表7可知：（1）轉基因品系的株高與單株產量、有效果枝數和有效鈴數等極顯著相關，但是與單鈴重、衣分不顯著相關，可見增加株高不會引起單鈴重與衣分的改變；（2）將果枝數與單株產量、有效果枝數和有效鈴數等進行關聯分析， 可以得出果枝數

與這些農藝性狀呈極顯著正相關，可見果枝數的增加會引起有效果枝數、鈴數、有效鈴數、單株產量的增加；（3）有效果枝數與鈴數、有效鈴數和單株產量呈極顯著正相關，與單鈴重、衣分沒有顯著相關關系；（4）鈴數與有效鈴數、單株產量呈極顯著正相關，說明增加單株棉花的鈴數，可大大提高棉花的產量；而與單鈴重呈負相關，這與前人的研究相符，棉花鈴數多而單鈴重下降；（5）有效鈴數與單株產量呈極顯著正相關，與單鈴重呈顯著負相關，說明增加有效鈴數會提高單株產量，但會降低單鈴重，與衣分呈不顯著相關，由此猜測，棉花的衣分改變不會引起棉花鈴數和有效鈴數的改變；（6）單鈴重與單株產量呈極顯著正相關，說明單鈴重的增加可提高棉花的產量。

綜上得出，轉基因棉花的衣分指標與單株產量沒有顯著相關關系，改變其他的農藝性狀均不會引起衣分的增加，而單株產量與株高、鈴數和果枝數均呈極顯著相關關系，可見增加這些農藝性狀均能增加棉花的產量。但是有效鈴數的增加會導致單鈴重的降低，因此，需要在棉花單鈴重與有效鈴數的動態變化中找到平衡，充分實現棉花高產。

2.4.4"纖維品質的比較分析

由表8、圖6得出：（1）轉GbHCT13品系的上半部平均長度顯著低于對照Y1169，而轉GbHCT15品系的上半部平均長度顯著高于對照Y1169；（2）轉GbHCT13品系的平均長度顯著低于對照Y1169，轉GbHCT15品系的平均長度卻顯著高于對照Y1169；（3）轉GbHCT13品系的長度整齊度顯著低于對照Y1169，轉GbHCT15品系的長度整齊度與對照Y1169差異不顯著；（4）在馬克隆值這項纖維品質指標上，轉GbHCT13品系和轉GbHCT15品系均顯著低于對照Y1169，其中轉GbHCT15品系的馬克隆值最低；（5）轉GbHCT13品系的斷裂比強度值顯著低于對照Y1169，轉GbHCT15品系的斷裂比強度值顯著高于對照Y1169；（6）轉GbHCT15品系的斷裂伸長率顯著高于對照Y1169，轉GbHCT13品系的斷裂伸長率也高于對照，但差異不顯著；（7）在光透亮這項指標中，對照組最高，2個轉基因品系的光透亮均顯著低于對照；（8）轉GbHCT13品系的成熟度高于對照Y1169，但并不顯著，轉GbHCT15品系的成熟度與對照Y1169無明顯差異；（9）轉GbHCT15品系的短纖維指數顯著低于對照Y1169，而轉GbHCT13品系的短纖維指數顯著高于對照。

3"討論

3.1"除草劑初步篩選轉基因棉花

草銨膦屬于有機磷類非傳導性滅生除草劑，其作用主要是抑制植物合成酶的催化作用，使植株不能進行正常代謝，致使細胞質葉綠體解體，使植物無法進行光合作用，同時使植物葉片及芽尖枯死，最終導致植株死亡^［17-18］。草銨膦的抗性基因bar來自土壤吸水鏈霉菌，可使草銨膦不能抑制谷氨酰胺合成酶的活性^［19］，從而使植株具有耐除草劑性。因此采用濃度為60、70、80 μL/L的草銨膦除草劑對轉基因棉花進行初步篩選，結果發現，80 μL/L的草銨膦可使未轉入GbHCT基因的棉花葉片枯死、莖尖死亡，確定該濃度為適合的噴施濃度；而葉片無反應的植株可以初步證明為GbHCT基因成功已導入。為進一步確定棉花轉基因植株的真偽，進行PCR檢測，鑒定植株體內是否含有bar基因，觀察待測樣品是否含有目的條帶，從而對棉花轉基因植株進行進一步篩選。

3.2"室內PCR鑒定轉基因棉花

選用通用引物進行PCR擴增獲得目的片段的難度相較于特異性引物更大，但使用通用引物獲得的目的片段不僅可以證明目的基因成功導入到受體植株中，還表明目的基因在植株體內片段完整，并未發生基因漂移。采用通用引物對多世代轉基因材料進行檢測還可以在一定程度上證明目的基因是否穩定遺傳。趙柯柯等采用標記基因引物和通用載體引物進行PCR擴增，不僅成功鑒定出GhMYB4過表達轉基因棉花，還通過該法得出目的基因可以穩定遺傳給子代^［20］。本研究同時運用草銨膦抗性篩選和通用引物PCR檢測對轉基因植株進行鑒定，可以得到更準確的試驗結果。

傳統育種技術通過雜交以表型性狀作為篩選手段，不僅耗費時間長，且工作量巨大，不是快速準確篩選出具有優異纖維品質新品種的最佳方法^［21］。因此，在育種中，不能僅依靠表型鑒定，還需借助分子生物學方法，利用基因組學加以分析進行分子育種，這是目前最為實用且快速的選育優良品種的新方法^［22］。轉基因技術通過分子技術鑒定外源基因是否整合到受體細胞基因組中，隨著植株的生長發育，通過觀察該基因在植物細胞內的表達情況，判斷該基因能否在后代中穩定遺傳一種技術^［23］。由除草劑篩選及bar基因檢測的結果可得，T2代轉GbHCT13品系的陽性率為60.0%、轉GbHCT15品系為80.0%，T3代轉GbHCT13品系的陽性率為83.0%、轉GbHCT15品系為82.1%，本研究所用轉基因品系均是通過農桿菌介導法獲得的^［24］。T2代經PCR檢測為陽性的植株，在T3代通過bar基因篩選時仍有植株未擴增出目的條帶，說明轉基因植株在最初幾代的遺傳中可能存在基因分離的現象，因此需要對轉基因植株的每一代進行鑒定。

3.3"轉GbHCT基因海島棉農藝及產量性狀與對照的差異分析

目的基因GbHCT雖然與棉花的纖維發育相關，但該基因的導入不僅可使棉花的纖維品質發生改變，同時對棉花的農藝性狀和產量性狀產生不同程度的影響。本研究結果顯示，轉GbHCT13品系和轉GbHCT15品系的株高高于對照，經過多重比較分析得出，與對照組Y1169相比，轉基因品系的果枝數、有效果枝數、鈴數和有效鈴數等農藝性狀均有所升高。轉GbHCT15品系的籽棉產量與對照相比顯著升高，但是單鈴重均低于對照組，衣分較對照均有升高。將農藝性狀與產量性狀進行相關性分析，可得株高、果枝數、有效果枝數、鈴數、有效鈴數、單鈴重均與籽棉產量顯著相關，說明增加這些農藝性狀可提高籽棉產量。對纖維品質進行分析可得，轉GbHCT13品系的上半部平均長度和長度整齊度與對照相比顯著降低，轉GbHCT15品系的斷裂比強度有所升高；但是轉GbHCT13品系的伸長率與對照相比略微升高，而轉GbHCT15品系的纖維伸長更為明顯，推測其原因可能是HCT基因促使受體棉花的纖維伸長，這與前人的研究結果^［34］一致。此外轉GbHCT13品系的成熟度與對照相比略有升高。

劉方等對轉基因材料的株高、果枝數、鈴數等農藝性狀進行了深入研究，在轉相同基因的高代材料性狀間，會存在部分基因分離現象，同時還會出現遺傳不穩定或發生突變現象^［25］，本試驗結果與其結論相吻合。在轉基因抗旱性分析與農藝性狀的變異解析中，錢進等得出，轉基因株系發生明顯的變化，如在有效果枝數、單鈴重和衣分上明顯高于對照^［26］，本試驗中轉基因株系的株高、衣分都顯著高于對照組。

從本試驗結果來看，在轉基因過程中插入的GbHCT基因可能是隨機的，在試驗中，轉GbHCT13品系和轉GbHCT15品系的農藝性狀與對照組相比有顯著或極顯著變化，結合文獻可知，某些農藝性狀的正向增長與部分減少可能與插入的位點有關^［27］。在轉基因過程中，基因插入的位點越隨機，基因的遺傳變異越廣泛，對農藝性狀發生的變異越多，借此可根據現有的品種和育種目標來篩選所需的轉基因品系^{［12，28］}。

3.4"轉基因品系農藝性狀對產量的影響

棉花的纖維品質與產量一直是人們關注的熱點，因此，科研人員從高產、保產、優質和高效等目的出發，導入有利于棉花纖維伸長與產量提高的優異基因，為保障在棉花產量不變或增產的前提下提高棉花的纖維品質，使棉花原棉產生更大效益。沒有優良的基因，高產的作物就不會出現，所以將優良的目的基因整合到受體中，改變受體的短板、弱點，使其達到優異的棉花品質，將棉花的農藝性狀與產量關聯起來，可以選育出更加優異的棉花新品種，對新品種選育有重要的指導意義。劉昌文等研究發現，通過增加棉花的株高和鈴數，可有效提高棉花的籽棉產量^［29］，本研究中發現，轉基因品系的農藝性狀（衣分除外）與籽棉產量呈極顯著正相關，因此可以根據農藝性狀對棉花產量的影響進行人為干擾，進而提高棉花的產量及纖維品質。

3.5"轉基因品系纖維品質的改變

通過對比轉基因品系與Y1169的各項纖維品質發現，轉基因品系的各項指標均發生了一定變化。通過測量纖維品質的9個指標得出，轉GbHCT15品系的大部分纖維品質相較于對照升高，前人研究得出，HCT基因與棉花纖維細胞有關，而將GbHCT15基因導入受體后，轉基因棉花的纖維品質確有升高，更加證實GbHCT基因與棉花的纖維發育相關。此外，越來越多的研究表明，目的基因的導入能夠改變棉花纖維品質^［30］；斷裂比強度的不同程度增加會使纖維增粗^［31］。其他與纖維不相關的基因導入棉花受體后，與棉花纖維發育相關的基因也會不同程度地發生少許改變，如斷裂比強度會發生不同程度的增加，而馬克隆值降低，從而影響棉花纖維品質的改變^［32］，本試驗結果與之相符；前人通過將纖維長度、斷裂比強度與纖維品質進行相關分析得出，轉基因植株纖維品質明顯提高^［33］。

4"結論

通過除草劑篩選與PCR標記基因檢測初步證明，以GbHCT基因已經整合到陸地棉Y1169基因組中，再在室內進行加代檢測，以證明轉化的GbHCT基因能夠穩定遺傳。與陸地棉Y1169相比，2個轉基因品系的株高均高于對照，轉GbHCT13品系的果枝數、有效果枝數與對照相比差異不顯著，而轉GbHCT15品系的這些農藝性狀與對照相比均有顯著升高。增加果枝數、有效果枝數、鈴數、有效鈴數均可提高籽棉產量，農藝性狀的改變可引起籽棉產量的改變，尤其是果枝數與籽棉產量間呈極顯著正相關；此外，鈴數和有效鈴數的增加也均能使籽棉產量增加。綜上，2個轉基因棉花品系纖維伸長率較對照組均有所伸長，說明調控纖維發育的HCT基因導入受體后，不僅可以促進受體植株纖維的發育，還影響著受體植株的其他性狀。

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