甘藍型油菜BnaC03g56680D基因的生物信息及亞細胞定位分析

摘要：2C型蛋白磷酸酶在細胞信號傳導和植物生長發育中發揮著至關重要的作用，有關甘藍型油菜PP2C家族的系統分析尚未見諸報道。本研究對BnaC03g56680D基因進行了全面分析。BnaC03g56680D基因的cDNA序列全長423 bp，編碼140個氨基酸，包含PP2C-like結構域，其相對分子質量為15 765.96 u，理論等電點為4.96，屬于穩定的親水性蛋白。其二級結構主要呈現為無規則卷曲，不含有跨膜結構域與信號肽，亞細胞定位于細胞核，屬于非分泌蛋白。該基因啟動子中含激素誘導相關元件與干旱脅迫響應元件。此外，ABA、PEG、甘露醇的高水平誘導均導致BnaC03g56680D的表達上調，說明其可能在植物的抗逆過程中發揮重要功能。本研究不僅有助于解析2C型蛋白磷酸酶在植物生物學中的作用機制，還為未來基因工程和植物育種提供了潛在的目標和指導。

關鍵詞：甘藍型油菜；生物信息學；基因克隆；PP2C；BnaC03g56680D

中圖分類號：S565.401""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0038-06

油菜是湖南地區的主要油料作物，其種植面積和產量在我國均居領先地位^［1］。國家統計年鑒顯示，2021年我國油菜種植面積為699.2萬hm²，占自產油料作物面積53.36%，是油料作物之首。油菜根據其植物學和生物學特性，分為甘藍型油菜（Brassica napus L.）、白菜型油菜（Brassia campestris L.）和芥菜型油菜（Brassica juncea L.）3類^［2］。其中，甘藍型油菜作為我國重要的油料作物之一，具有極高的經濟價值^［3］。然而，隨著世界氣候與生態環境日益惡化，保護甘藍型油菜的生存環境變得艱難，特別是在干旱和半干旱地區，干旱和鹽堿化對其影響最為顯著^［4］。同時，由于我國人口眾多，對菜籽油的需求不斷增加，導致我國菜籽油每年仍需進口^［5］。因此，提高甘藍型油菜產量對于確保油料作物供應和促進可持續農業發展至關重要。

2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2Cs，PP2Cs），是一類依賴于Mg²⁺/Mn²⁺的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，能夠去除蛋白質的磷酸基團，動態調控蛋白磷酸化狀態，在植物生長、發育以及對非生物脅迫響應中發揮關鍵作用^［6-9］。PP2C還參與多種植物信號通路的調控，包括脫落酸（ABA）信號通路、植物激素赤霉素（GA）信號通路以及蛋白激酶級聯反應等，這些信號通路對植物的生長和發育至關重要^［10-12］。多種植物中已鑒定出PP2C基因家族成員，如黃瓜（56個）、林地草莓（62個）、擬南芥（80個），蒺藜苜蓿（94個），玉米（103個）^［13-17］。多項研究表明，PP2C在植物的抗逆性中發揮著關鍵作用，尤其是在干旱和鹽堿等不利環境下。例如，小麥中的TaPP2C158可以直接與TaSnRK1.1相互作用并使其去磷酸化，從而使TaSnRK1.1-TaAREB3信號通路失活，阻斷干旱脅迫響應^［18］。棉花的GhDRP1基因可能通過調節ABA信號通路和類黃酮生物合成途徑參與干旱脅迫響應^［19］。在水稻中，OsPP65通過調節茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）信號通路以及調節棉子糖家族低聚糖代謝途徑來負調控滲透脅迫和鹽脅迫耐受性^［20］。另外，白樺BpPP2C1過表達植株可能通過減少氧應激損傷，表現出明顯的耐鹽性^［21］。

本研究成功從甘藍型油菜XY15中克隆得到BnaC03g56680D基因的完整cDNA序列。通過生物信息學方法，對該基因編碼蛋白的氨基酸組成、理化性質、親疏水性、亞細胞定位以及三級結構進行分析和預測。這項研究不僅對培育抗逆新品種具有重要意義，同時也可以為揭示甘藍型油菜抗逆基因的功能機制提供有力支持。

1"材料與方法

1.1"材料

本研究于2022年在湖南農業大學作物表觀遺傳調控與發育湖南省重點實驗室完成。供試材料甘藍型油菜湘油15號（XY15），常規種植于該實驗室。

1.2"引物設計與合成

根據甘藍型油菜數據庫Genoscope網站（https：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）設計基因克隆及實時熒光定量PCR引物（表1），由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.3"甘藍型油菜RNA的提取

使用Trizol法提取甘藍型油菜XY15葉片組織的RNA。產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，并用BioTek Epoch酶標儀測定其濃度。質量較好的產物用于后續目的基因擴增及反轉錄。

1.4""BnaC03g56680D基因的克隆及載體構建

甘藍型油菜湘油15號于光照氣候培養箱中培育，直至長出真葉，生長條件為24 ℃，光照16 h，黑暗 8 h。取適量真葉葉片，利用Trizol提取總RNA。使用購自諾唯贊公司的試劑盒HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）進行反轉錄，得到BnaC03g56680D基因的cDNA。在Snap Gene軟件中進行引物設計，分別在BnaC03g56680D的正向引物5′端和反向引物的3′端添加載體pCAMBIA1300-eGFP的同源臂。以cDNA為模板，采用15 μＬ的PCR反應體系進行擴增，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit （D2111-02）試劑盒回收純化目的片段，利用同源重組法將目的片段構建至pCAMBIA1300-eGFP載體，轉化至大腸桿菌DH5α中，將菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37 ℃過夜培養。挑取單克隆進行PCR檢測，選取陽性單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃過夜培養，提取質粒后送至武漢金開瑞生物工程有限公司測序。

1.5"實時熒光定量PCR

為了研究BnaC03g56680D的表達模式，分別用200 mmol/L NaCl、200 g/L聚乙二醇（PEG）6000、200 μmol/L 甘露醇、100 μmol/L ABA和 100 μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）處理正常生長3周齡的甘藍型油菜XY15幼苗。在0、3、6、9、12 h采集幼苗的葉片組織作為樣品。以油菜葉片cDNA為模板，持家基因Actin作為內參，以克隆得到的BnaC03g56680D序列為參考，使用Primer Premier 5.0軟件進行qPCR引物設計，引物序列見表1。試驗設置３次生物學重復和３次技術重復。利用2^-ΔΔCT法分析試驗數據，計算出基因的相對表達量^［22］。使用Graphpad軟件作圖，以0 h的表達量作為對照，使用單因素方差檢驗進行顯著性差異分析。

1.6"BnaC03g56680D亞細胞定位分析

構建pCAMBIA1300-35S：：BnaC03g56680D-eGFP載體完成后，采用瞬時表達法，將含有pCAMBIA1300-35S：：BnaC03g56680D-eGFP的重組質粒和pCAMBIA1300-eGFP質粒的GV3101農桿菌注射至正常生長4周齡的本氏煙草的下表皮^［23］。煙草暗培養36 h后，以含有35S：：GFP質粒的本氏煙草葉片為對照，并結合細胞核染料DAPI在熒光顯微鏡下觀察亞細胞定位情況。

1.7""BnaC03g56680D基因的生物信息學分析

通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對蛋白理化性質進行分析；并使用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）工具分析蛋白結構域；采用TMHMM Server v.2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼氨基酸的跨膜結構域；利用SignalP 5.0 Server進行信號肽預測；用在線工具Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析亞細胞定位情況；通過SPOMA及 SWISS-MODEL預測蛋白質的二級結構和三級結構。使用在線工具PlantCare（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析油菜BnaC03g56680D基因啟動子區域的順式作用元件。

2"結果與分析

2.1"BnaC03g56680D基因的克隆以及載體構建

在甘藍型油菜數據庫Genoscope中獲得BnaC03g56680D基因的cDNA序列全長為423 bp，共編碼140個氨基酸。經RNA提取及反轉錄后，獲得帶有同源臂的目的片段。利用同源重組酶進行同源重組，將目的片段構建到pCAMBIA1300-eGFP載體中，隨后進行產物檢測和測序。測序結果與數據庫中的序列完全一致，未發現任何突變，由此得到了完整的重組質粒。

2.2"BnaC03g56680D基因生物信息學分析

2.2.1"理化性質、亞細胞定位分析

BnaC03g56680D蛋白化學式為C690H1 084N184O216S11，由140個氨基酸組成。其中纈氨酸（Val）含量最高，占總氨基酸比例的10.0%（圖1）。該蛋白的相對分子質量為 15 765.96 u。理論等電點為4.96，偏酸性。脂肪系數為83.43，不穩定系數為18.65，說明該蛋白在體外能夠穩定存在。ProtScale預測為親水性蛋白（圖2）。亞細胞定位結果顯示，BnaC03g56680D主要分布于細胞核中。

2.2.2"BnaC03g56680D蛋白結構分析

分析BnaC03g56680D蛋白質的結構域，發現其保守結構域第2～134位的氨基酸屬于PPM-type phosphatase-like超家族（圖3-A）。第5～53位及第88～125位為PP2C-like超家族。通過SOPMA在線工具對BnaC03g56680D的二級結構進行預測，結果顯示，其二級結構組成豐富，包括51.43%的無規則卷曲、30.71%的α-螺旋、5.71%的β-轉角和12.14%的延伸鏈（圖3-B）。使用SWISS-MODEL進行蛋白質3級結構的預測和模型構建（圖3-C），全球模型質量估計GMQE為0.83，表明模型具有高可信度。細胞膜或質膜上發揮作用的蛋白質通常包含跨膜區域，這些區域連接著細胞內外環境并在維持蛋白質位置和穩定性方面發揮關鍵作用。此外，部分跨膜區域還具有信號傳遞功能^［24］。結果表明，BnaC03g56680D缺乏跨膜結構域，不屬于膜蛋白。通過SignalP 5.0 Server在線工具進行信號肽預測，BnaC03g56680D不包含信號肽，因此可歸類為非分泌蛋白。

2.2.3"啟動子順式作用元件分析

對起始密碼子上游2 000 bp啟動子區域進行分析，結果（圖4）表明，該啟動子不僅包含了真核生物啟動子核心元件TATA-box和CAAT-box，還檢測到其他10種元件，其中包括光響應型、激素響應型和逆境響應型元件。值得注意的是，其中ARE順式作用調節元件數量最多，表明其在無氧誘導調節中起著重要作用。相比之下，逆境響應型元件較少，僅包括1個MBS元件，可能與干旱脅迫有關。綜合分析結果表明，該啟動子的元件種類豐富，具備積極響應激素誘導和逆境脅迫的潛力。

2.3"實時熒光定量PCR表達分析

利用RT-qPCR技術分析了BnaC03g56680D在各種非生物脅迫條件下的相對表達水平，結果（圖

5）顯示，在ABA誘導下，BnaC03g56680D的表達量顯著增加，在PEG和甘露醇模擬的干旱脅迫條件下，其表達量也有所上升。相比之下，在鹽脅迫條件下，其表達水平相對較低，而在MeJA誘導下，表達水平顯著下降。這種降低可能是因為該啟動子缺乏參與茉莉酸甲酯反應的順式作用元件。然而，在不同激素誘導和干旱脅迫條件下，BnaC03g56680D都能夠在短時間內迅速作出反應，這與啟動子順式作用元件分析的結果一致。

2.4"亞細胞定位分析

根據在線預測結果，BnaC03g56680D位于細胞核中。利用煙草葉片瞬時表達法將已驗證的35S：：pCAMBIA-1300-eGFP 載體通過農桿菌注射于本氏煙草葉片， 暗培養36 h后撕下葉片下表皮， 并在熒光顯微鏡下結合DAPI染色進行觀察。

pCAMBIA-1300-eGFP空載體中熒光信號同時在細胞核和細胞質中可見，而BnaC03g56680D-GFP融合蛋白的熒光信號僅在細胞核中觀察到（圖6）。結合DAPI染色的結果表明，BnaC03g56680D蛋白在細胞核內執行特定功能。試驗結果與初步預測相符。

3"討論與結論

盡管甘藍型油菜擁有高產和抗倒伏的特性， 但隨著人口的增加和環境條件的惡化，油菜籽總產量大大低于谷類，難以滿足市場需求^［25］。在面對非生物脅迫時，油菜的生物量、根系生長、葉片數、比葉面積、光合作用和葉綠素含量明顯減少。特別是在開花期受到脅迫時，可能導致開花時間提前，降低種子的油脂和脂肪酸含量，嚴重制約了油菜籽的生長和發育，從而最終影響了產量和品質，對全球食品安全構成威脅^［26］。PP2C基因廣泛分布于不同植物物種中，其家族成員通過調控多種信號通路及細胞內外離子平衡來響應不同的逆境脅迫^［27］。在常見的擬南芥、水稻、小麥等植物中研究表明，PP2C常作為負調控因子參與調節干旱、低溫、鹽等脅迫^［28-30］。BnaC03g56680D編碼的蛋白含有PP2C-like結構域，且位于細胞核內。研究表明，核內蛋白可以通過調控蛋白磷酸化狀態或與其他蛋白質互作，形成蛋白質復合物，從而調控基因表達和信號轉導，影響細胞核內的生物學過程^［31］。因此，BnaC03g56680D可能具有類似于PP2C的功能，通過去磷酸化作用調控下游靶蛋白的活性，從而影響植物的生長和發育。此外，基于啟動子順式作用元件及多種脅迫下的相對表達水平分析，BnaC03g56680D可能還參與植物對逆境脅迫的響應。在干旱脅迫下，它可能通過調控ABA信號通路，影響植物的耐受性。本研究結果為深入研究甘藍型油菜BnaC03g56680D基因表達調控及抗逆機制提供了堅實的理論基礎。

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