金黃地鼠不同病理狀態頰囊黏膜的近紅外熒光成像差異分析

[摘要]目的 探討分析吲哚菁綠（ICG）近紅外熒光（NIF）成像技術對口腔潛在惡性疾患及口腔鱗狀細胞癌早期診斷的可行性。方法 利用二甲基苯并蒽丙酮溶液，給予金黃地鼠頰囊黏膜不同時間的局部刺激，誘導建立輕/中度異常增生、重度異常增生、鱗狀細胞癌等病理狀態的頰黏膜病變模型。采用ICG-NIF技術對病變組織進行熒光信號定量分析，免疫組織化學染色法對不同病理狀態黏膜的微血管密度（MVD）、微淋巴管密度（MLVD）進行分析。結果 ICG-NIF熒光定量分析結果顯示，實驗組中黏膜病變組織的熒光強度均高于正常黏膜，差異具有統計學意義（Plt;0.05），且實驗組中黏膜病變惡性程度越高，其熒光強度越高。組織學分析顯示，隨著黏膜病變惡性程度增加，MVD增加（Plt;0.05），MLVD減小（Plt;0.05）。結論 金黃地鼠異常增生的頰部黏膜病變與正常黏膜組織間具有ICG-NIF熒光信號差異，熒光定量分析方法具有輔助鑒別的臨床應用潛能。

[關鍵詞]吲哚菁綠；近紅外熒光成像；口腔潛在惡性疾患；口腔鱗狀細胞癌

[中圖分類號]R780.2[文獻標志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024150

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，oscc）是口腔頜面部最常見的上皮來源的惡性腫瘤之一，目前公認的治療方案是以手術治療為主的綜合治療，但是OSCC患者的5年生存率為60％左右，晚期患者生存率更低。因此OSCC患者的早期診斷及治療至關重要。口腔黏膜白斑、紅斑、扁平苔蘚等是一類具有癌變潛能的口腔潛在惡性疾患（oral potentially malignant disorders，OPMD），臨床工作中需要對OPMD患者進行長期隨訪和定期復查，以早期發現早期治療OSCC，降低死亡率。組織病理活檢是診斷OPMD和OSCC的金標準，但活檢屬于有創檢查，存在創傷大、耗時長、患者接受程度低等問題，不適合作為OPMD早期診斷及長期監測的手段。積極探索OPMD及OSCC的無創篩查、早期診斷方法具有重大意義。

近年來，自體熒光技術（autofluorescence imaging，AFI）、窄帶成像技術（narrow band imaging，NBI）、反射式共聚焦顯微鏡（reflectance confocalmicroscopy，RCM）、光學相干斷層掃描技術（optical coherence tomography，OCT）等光學診斷技術逐漸得到發展川。吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）近紅外熒光（near-infrared fluorescence，N1F）成像技術的推廣應用，為光學診斷提供了一種新的選擇。ICG-NIF的原理是利用病變組織血管、淋巴管缺陷形成的高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應，使靜脈注射的ICG在病變部位聚集，繼而在近紅外光的激發下（常用的激發波長為785 nm，發射波長為820 nm）與周圍正常組織形成對比。目前ICG-NIF技術已經在多種腫瘤疾病的熒光引導手術（fluorescence guided surgery，FGS）中被廣泛應用，通過對ICG-NIF圖像的分析可以輔助區分腫瘤病變和正常組織。本研究旨在應用二甲基苯并蒽（7，12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA）丙酮溶液誘導建立不同病理狀態的金黃地鼠頰黏膜病變模型，依靠ICG-NIF成像技術定量分析不同病變組織的熒光信號差異，探索通過熒光定量法輔助區分黏膜病變的可行性，為OPMD及OSCC的早期熒光輔助診斷提供一種新的策略。

1材料和方法

1.1主要材料和儀器

1.1.1實驗動物

金黃地鼠，清潔級，鼠齡4～6周，體重約為150 g，雌雄各半，購于遼寧長生生物技術股份有限公司。實驗操作符合南京大學動物實驗倫理要求。

1.1.2主要試劑及儀器

DMBA（Sigma公司，美國），注射用ICG（25 mg/支，丹東醫創藥業有限責任公司），CK5/6、CD31、LYVE1抗體購買自艾博抗貿易有限公司。小動物活體成像儀（IVIS Lumina，Perkin Elmer公司，美國），熒光手術導航系統（Real-IGS，南京諾源醫療器械有限公司）。

1.2金黃地鼠頰黏膜癌變模型構建

將40只金黃地鼠隨機分成4組：對照組、輕／中度異常增生組、重度異常增生組、OSCC組，每組10只。將金黃地鼠分別固定于自制鼠架上，拉開頰囊，在實驗組小鼠右側（病變側）頰囊黏膜下注射50 uL的0.5％DMBA丙酮溶液，在對照組小鼠頰囊黏膜及實驗組左側（對照側）黏膜涂布丙酮溶液，每周處理3次。輕沖度異常增生組、重度異常增生組、OSCC組造模處理時間分別為4、6、10周，處理后禁食、禁飲2h。觀察監測并記錄頰囊黏膜顏色、質地變化以及增生、糜爛情況。初次處理后每2周于各組隨機挑選1只金黃地鼠，取頰囊黏膜進行組織病理檢查，免疫組織化學染色法標記CK5/6，確認病理狀態。在造模結束后對各組小鼠拍照記錄頰囊黏膜狀態，之后進行熒光成像及定量分析。

1.3ICG-NIF技術進行熒光成像及定量分析

黏膜病變模型構建成功后，4組中隨機選取5只金黃地鼠，腹腔注射2％戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，靜脈注射5 mg/kg ICG溶液，在注射后1、6、12、24 h通過熒光手術導航系統采集頰部組織熒光信號進行定量分析，24 h后拍攝熒光圖像。隨后安樂處死金黃地鼠，解剖其頰囊黏膜，置于小動物活體成像儀拍攝熒光圖像。根據ImageJ軟件對目標區域的熒光圖像定量分析，獲取其平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），計算實驗組中病變組織與正常組織的熒光信號對比（signalto backgroundratio， SBR）， SBR=MFI（病變黏膜）/MFI（對照側正常黏膜）。

1.4組織學分析

熒光檢測完成后，將頰囊組織固定于4％多聚甲醛中，常規石蠟包埋、切片后進行蘇木精，伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，免疫組織化學染色法CD31標記微血管，LYVE1標記微淋巴管，進行組織病理學評估。采用Weidner法進行微血管密度（microvessel density，MVD）、微淋巴管密度（microlymphatic vesseldensity，MLVD）計數。

1.5統計學分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量數據以均數士標準差的形式表示。不同組別的數據進行單因素方差分析。Plt;0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1不同病理狀態頰囊黏膜模型構建

根據不同處理時間構建金黃地鼠頰囊黏膜病變模型，熒光成像定量分析后進行病理驗證。肉眼大體觀察（圖1上），對照組及實驗組對照側頰囊黏膜表面紅潤光滑，彈性良好，微血管充盈清晰。與對照組相比，實驗組病變側黏膜顏色較灰暗蒼白，黏膜增厚，表面粗糙，彈性減弱，微血管模糊，黏膜表面可見散在乳頭狀新生物。隨著造模時間增長至6-10周時，黏膜病變累及范圍擴大，新生物增生明顯呈菜花狀，突向口腔內側，表面糜爛不規整，觸之易出血。

對黏膜組織進行HE及CK5/6染色切片觀察（圖1中、下），對照組頰囊黏膜為復層鱗狀上皮，表面角化，黏膜厚度為4-6層細胞，基底細胞層結構清晰，與人類正常黏膜結構相似。與對照組相比，輕／中度異常增生組病變側頰囊黏膜細胞整體排列尚規整，表面出現過度角化，顆粒細胞層明顯，棘層增厚，基底細胞層結構完整；重度異常增生組病變側頰囊黏膜鱗狀上皮異常增生明顯，上皮分層不規則，結構紊亂層次超過上皮2/3，上皮釘突增生呈指狀、水滴狀，細胞大小不一，核深染，核漿比增大，核分裂象增多，但基底膜仍完整；黏膜癌變組病變側頰囊黏膜細胞異常增生，核分裂象明顯增加，可見病理性核分裂象，瘤細胞突破基底膜，呈團塊狀、條索狀侵犯黏膜下結締組織，形成浸潤癌巢。

2.2熒光成像結果及定量分析

ICG-NIF熒光定量分析結果（圖2）顯示，各組中黏膜組織熒光強度均在注射后持續衰減，實驗組癍變側黏膜熒光強度始終高于對照組。靜脈注射24h后對頰囊黏膜進行熒光成像及定量分析（圖3，表1），對照組中頰囊黏膜組織內熒光信號微弱，MFI為（65+9.16）AU；實驗組中病變側黏膜組織熒光信號均高于對照側黏膜，差異具有統計學意義（Plt;0.05）；各實驗組中，隨著黏膜病變惡性程度增加，黏膜組織MFI升高，3組間差異均有統計學意義（Plt;0.05），其中OSCC組病變黏膜的MFI達到了（325±47.46） AU，SBR為4.97±0.87。

2.3不同病理狀態頰囊黏膜組織學分析

對各組黏膜下層組織MVD和MLVD進行分析（圖4，表1），與對照維相比，各實驗組病變側黏膜均表現出MVD增加，MLVD減小，差異具有統計學意義（plt;0.05）。各實驗組中，隨著黏膜病變惡性程度增加，MVD密度增加，3組間差異均有統計學意義（Plt;0.05），其中OSCC組織內血管網絡豐富，MVD計數達到了101.2±15.30。隨著刺激時間增長，MLVD在實驗組中有下降的趨勢，OSCC組織中MLVD計數為4.2±1.14，與異常增生組相比差異有統計學意義（Plt;0.05），而2個異常增生組間差異無統計學意義（Pgt;0.05）。

3討論

研究表明，5％-18％的OPMD會轉變為癌癥，其中伴有中度或重度異常增生的病損癌變可能性更高。針對OPMD的早期篩查及診斷有利于降低oscc發病率，一直是研究的熱點。目前，臨床已較廣泛地應用AFI、甲苯胺藍染色技術作為傳統口腔檢查的輔助手段，以幫助臨床醫生無創篩查OPMD，并輔助判斷取材活檢的部位。AFI通過識別健康口腔黏膜熒光基團的淡綠色熒光（波長515 nm），與黏膜病變熒光缺失區域進行區分，但該技術特異性較低，出血區域會產生假陽性，高度角化區域會出現假陰性，且圖像判斷依賴檢查者的個人經驗，具有較強的主觀性。甲苯胺藍染色技術可以增強局部病損的可視性，從而顯示病變部位，甚至發現隱匿、無臨床表現的OPMD病損，但具有較高的假陽性，且存在誤食風險。ICG-NIF成像技術目前已在口腔癌的FGS中被逐漸應用，能夠較好地顯示腫瘤邊界，輔助界定手術切緣。相較NBI、RCM、OCT等技術，ICG-NIF的熒光具備更深的組織穿透，檢查結果具有可定量分析的優勢。將該技術應用于口腔黏膜癌變組織的篩查，能較好輔助判斷黏膜狀態，符合OPMD的長期隨訪和狀態監測的臨床需求。但其臨床應用需要注射熒光造影劑，并需要特定成像設備的支持，這對該技術的廣泛推廣具有一定的限制。

利用金黃地鼠的頰囊誘導口腔癌模型是較為理想且成熟的動物模型。頰囊是金黃地鼠特有的解剖結構，相關動物模型已被廣泛用于口腔癌前病變、口腔癌相關的基礎研究及口腔器械的生物學評價。本研究利用該動物模型，在給予不同時間的局部刺激后，成功誘導出黏膜輕/中度異常增生、重度異常增生及OSCC等不同病理階段，且較好地模擬了臨床中口腔黏膜癌變的進展規律。本研究對該動物模型中不同病理階段的黏膜組織進行熒光成像定量分析發現，隨著黏膜病變惡性程度的增加，ICG-MF熒光信號增強，且黏膜表面角化物對ICG-NIF熒光強度的影響微弱，利用該定量分析方法對于輔助區分正常黏膜與癌前病變黏膜、癌變黏膜有一定的參考價值。

目前認為，熒光分子在病變組織的蓄積主要依賴EPR效應。本研究從組織學層面分析不同病理階段的黏膜組織，發現金黃地鼠黏膜病變惡性程度的進展伴隨著MVD的增加及MLVD的減少，揭示了黏膜組織在異常增生進展過程中微血管、淋巴管的改建規律。這些改變會導致病變黏膜組織中更多的ICG灌注以及更長時間的蓄積，從而與正常黏膜形成熒光信號對比，解釋了惡性程度更高的黏膜病變模型中ICG熒光信號增強的原因。實際應用中，炎癥組織血管通透性的增強會對ICG-MF成像的結果產生干擾，本研究的動物模型具有一定局限性，無法模擬并排除炎癥組織的干擾。Pal等報道了“熒光壽命”在熒光診斷中的重要性，強調癌變細胞對于熒光分子ICG更多的攝取也會導致熒光信號的增強，提示細胞生物學行為的改變在黏膜病變進展過程中也同樣需要被關注。

綜上所述，本研究表明通過ICG-NIF熒光定量分析，可輔助鑒別不同病理狀態的黏膜病變，具備臨床應用的潛能。當然，本研究采用的標準化動物模型具有一定局限性，后續研究還需要進一步的臨床驗證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。