一株廣東省豬源25重耐藥大腸桿菌的鑒定與致病性研究

摘要：在微生物界，大腸桿菌作為常見的致病病原備受矚目。于動物群體中，一旦流行病暴發，大腸桿菌極易引發繼發感染，其如同隱匿的破壞者，直接損害動物機體，從而加劇損失，這無疑對養殖企業的正常生產構成嚴重威脅。本研究針對廣東省展開，研究區域涵蓋清遠市、佛山市、茂名市、江門市、云浮市、揭陽市六個地級市。從不同發病豬場采集到72份病料，從中成功分離出4株豬源大腸桿菌。為探究這些菌株的特性，研究采用紙片法測定分離菌株對各類抗菌藥物的耐藥性，同時運用人工感染昆明小鼠的方式評估其中耐藥性最強菌株對小鼠的致病性。研究結果顯示，所分離出的4株大腸桿菌均呈現出對多種抗菌藥物的耐藥性。其中，耐藥性最為復雜的一株大腸桿菌，可耐受25種抗菌藥物，其對小白鼠的半數致死量達3.29×107CFU，這一結果表明該菌株具有一定的臨床致病性。本研究的結果為廣東省大腸桿菌的耐藥性監控提供了一定的數據支持。

關鍵詞：廣東省；豬源大腸桿菌；耐藥性；致病性

大腸桿菌（escherichia coli，E.coli）屬革蘭氏陰性菌，可通過糞口或直接接觸進行傳播，致病性大腸桿菌主要危害新生及斷奶仔豬，使其發生傳染率與死亡率均極高的仔豬黃白痢病[1]，以及發病率低但致死率高的豬水腫病[2]。大腸桿菌可致不同年齡段不同性別的人均發生急性腹瀉，是導致人腹瀉脫水的最常見病原菌[3]。大腸桿菌作為人與動物的常見機會致病菌，常伴隨著群體免疫力下降造成繼發感染，若不及時控制，容易直接造成患病豬只的大批量死亡。

隨著養豬業規模化發展，我國曾有一段時間大量使用抗生素來控制與治療包括大腸桿菌病在內的各種細菌病[4]。大腸桿菌具有質粒轉移[5]、修飾抗生素作用靶位[6]、構建外排泵[7]、產生滅活酶[8]等多種產生耐藥性的分子機制，使得大腸桿菌耐藥性日趨增長，逐漸產生了對多種抗生素具有耐藥性的多重耐藥大腸桿菌[9]。這既使養殖業疫病的控制難度增大，又使人感染多重耐藥大腸桿菌時難以找到合適的藥物進行治療[10]，因此更需要警惕。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級6周齡昆明小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：44007200120264。藥敏紙片購自常德比克曼生物科技有限公司；LB肉湯、LB瓊脂培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司；PCR引物、Taq酶、DL2000 DNA Marker購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 樣品來源

2022年從廣東省的清遠市、佛山市、茂名市、江門市、云浮市、揭陽市六個地級市的不同豬場采集72份病料，共分離出4株豬源大腸桿菌。

1.3 細菌鑒定

在無菌操作臺中將保存有大腸桿菌的瓷珠接種到LB液體培養基中，于37 ℃、180 r/min搖床上培養24 h。以菌液為模板進行細菌16S rRNA PCR檢測。根據參考文獻[11]選取16s rRNA通用引物，送生工進行測序。

1.4 藥敏試驗

根據美國國家臨床和實驗室標準化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）頒布的《抗菌藥物敏感性試驗執行標準》2023版指導標準，運用紙片擴散法（K-B法）測定4株大腸桿菌的藥物敏感性。按照2023版CLSI判讀標準，將所有大腸桿菌藥敏試驗結果分為耐藥（R）中度敏感（I）和敏感（S）。

1.5 小鼠致病力試驗

選擇12只健康昆明小鼠，雌雄隨機，體重30～34 g。隨機分為4組，每組3只小鼠，其中3組為試驗組，1組為陰性對照組。調整菌液設置3個濃度梯度，每個濃度梯度各注射一組小鼠。試驗組中的小鼠每只腹腔注射0.2 mL菌液，陰性對照組小鼠每只注射0.2 mL滅菌PBS。每組小鼠隔離飼養，避免相互感染，連續觀察7 d，感染后每12 h記錄一次臨床癥狀、存活數以及體重變化。對死亡小鼠立即解剖，對病變組織進行細菌分離培養，通過細菌形態觀察、PCR方法進行鑒定，使用改良寇氏法計算小鼠的半數致死量。

2 結果與分析

2.1 分離鑒定結果

PCR結果出現大小約為1 500 bp的條帶，符合預期。將測序結果在NCBI中進行BLAST比對，篩選出同源性在97 %以上的菌株序列，結合菌落形態判斷，本研究共分離到4株豬源大腸桿菌，分別命名為E.coli-fs022-1、2、3、4（圖1）。

2.2 藥敏結果

對4株豬源大腸桿菌菌株進行29種抗菌藥物的耐藥性試驗。4株大腸桿菌均有多重耐藥現象，其中菌1耐25種藥，2耐18種藥，3耐19種藥，4耐13種藥（表1）。

2.3 小鼠致病性試驗結果

選取耐藥性最高的E.coli-fs022-1進行實驗。試驗組小鼠在注射菌液后最早在4 h內死亡，最晚在28 h內死亡，28 h后無死亡情況，最低攻毒劑量組和陰性對照組的小鼠未死亡，半數致死量為3.29×107 CFU。攻毒后小鼠出現精神沉郁、抱團、呼吸急促、食欲減退等癥狀，28 h后出現癥狀的小鼠逐漸恢復正常。攻毒后1 d內小鼠體重出現下降，2 d后體重逐漸上升。說明該毒株有一定的致病性，在較大接毒劑量時可以迅速使小鼠致死。

經細菌分離培養PCR鑒定，僅有對照組小鼠體內未分離到豬源大腸桿菌。觀察到攻毒死亡的小鼠心臟、肝臟、脾臟等部位均發生了不同程度的淤血、腫大和出血，腸段松軟、腫脹充氣，腸系膜有不同程度出血。陰性對照組小鼠內臟器官正常。以上結果說明致病菌為豬源大腸桿菌。

3 討論

在中國經濟蓬勃發展的進程中，人民生活水平持續攀升，這一變化促使民眾對公共衛生安全與環境衛生安全的關注度日益高漲，針對獸用抗生素的“禁抗限抗”訴求也愈發強烈。致病性大腸桿菌，在微生物界作為常見致病病原的一員，于動物群體患病時，往往扮演著雪上加霜的角色。它極易引發繼發感染，進而直接致使患病豬只死亡，這無疑使養豬企業在疾病防控方面面臨更大的挑戰，遭受的損失也不斷擴大。然而，養豬場為了控制細菌病，存在濫用抗生素的現象。這種行為的后果是，大腸桿菌的耐藥性不斷強化。如此一來，當人類感染多重耐藥大腸桿菌時，合適的治療藥物將難覓蹤跡。鑒于此，從養豬場這一源頭減少抗生素的使用勢在必行。

廣東地區，鄔蘇曉等[13]研究發現2008年分離大腸桿菌對7種藥耐藥。王秀梅等[14]2007年分離的大腸桿菌最多耐17種藥。郭瀟木等[15]2011年的豬源大腸桿菌以12～14耐居多，僅有1株同時耐18種。賀丹丹等[16]2011—2012年患病豬源菌株的多重耐藥全部為5耐及以上。植嬋萍等[17]2014年豬源多重耐藥菌株主要集中于3～7耐，最高為10耐。饒麗麗等[18]2014年豬源大腸桿菌多重耐藥主要集中在4～9耐，最多耐13種藥。賈春玲等[19]2020—2021年大腸桿菌最多同時耐8種藥。經搜索，我國此前公開報道的多重耐藥性最強的豬源大腸桿菌，為2023年趙婭婭等[20]在河南新鄉發現，耐24種藥物。

本研究的藥敏結果中，分離菌株對青霉素類、林可酰胺類、多肽類、喹諾酮類、酰胺醇類、大環內酯類、磺胺類具有較高的耐藥性。其中E.coli-fs022-1對13類25種藥均耐藥。本研究的4株菌最少耐13種藥，最多耐25種藥，耐藥種類更多，同時還具有一定致病性。表明廣東地區豬源大腸桿菌多重耐藥較以前更為嚴重，應該引起注意。

于“禁抗限抗”政策推行之際，如何應對多重耐藥性豬源大腸桿菌所致感染這一問題，亟待解答且日益凸顯其重要性。知悉豬源大腸桿菌的流行態勢以及耐藥情形，有助于在減少乃至杜絕使用抗生素類抗菌藥物的大趨勢下，達成對豬源大腸桿菌的有效防控。

4 結論

本次研究的4株大腸桿菌均有多重耐藥現象，其中E.coli-fs022-1耐25種藥，E.coli-fs022-2耐18種藥，E.coli-fs022-3耐19種藥，E.coli-fs022-4耐13種藥。進行致病力試驗的E.coli-fs022-1半數致死量為3.29×107 CFU，有一定的致病性。提示廣東省豬源大腸桿菌的耐藥性比以前有所加強。

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