復合抑菌型卵磷脂脂質體緩解貓口腔異味效果研究

摘要：調研顯示，貓口腔異味常伴有健康狀況異常和口腔有害微生物滋生，其中后者是異味來源重要原因。本文旨在研究用卵磷脂包埋抑菌物質制備的復合抑菌型卵磷脂脂質體對貓口腔異味的緩解效果。通過抑菌試驗表明，復合抑菌型脂質體對貓口腔異味具有良好緩解作用。

關鍵詞：口腔異味；卵磷脂脂質體；貓；抑菌型

近年來我國城鎮養貓人群不斷擴大，貓的數量迅速增長，人們對貓的健康關注度越來越高。成年貓的口腔異味嚴重時，除因疾病引發[1]，其余多為口源性微生物引發。貓喜歡通過舔舐自身毛發清理干凈藏匿于其中的灰塵、死皮和寄生蟲等[2]，在此過程中位于體表的外源微生物也會隨之進入口腔，包括有害菌。貓的唾液含有溶菌酶，能起到抑菌的作用[3]，當唾液殺菌能力不足時，有害菌會快速生長繁殖，如變形鏈球菌、中間型葡萄球菌、黏性放線菌等，常會引起齲齒、殘根和牙菌斑等口腔疾病[4，5]，口腔異味伴隨而生。其中變形鏈球菌具有極強的產酸和耐酸能力[6，7]，是加快齲齒和牙菌斑形成的主要致病菌。因此，緩解貓口腔異味的關鍵在于抑制貓口腔中有害菌的生長，特別是變形鏈球菌，而目前市場上應對輕、中度貓口腔異味問題的調理類產品匱乏。

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽[8]、乳酸鏈球菌素[9]和茶多酚[10]都是天然來源的抑菌物質，抑菌譜具有互補性，不僅能有效抑制變形鏈球菌生長，對其他有害菌也有廣譜抑菌作用，關鍵是這三種物質均可在貓體內正常消化，無毒副作用。同時，為了提高這三種物質穩定性，可使用磷脂類物質對它們進行脂質包埋處理。

本文使用卵磷脂包埋ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、乳酸鏈球菌素和茶多酚制備復合抑菌型卵磷脂脂質體，通過體外抑菌試驗評價包埋工藝對其抑菌效果的影響，再通過貓喂食試驗研究其對貓口腔牙菌斑生長、唾液抑菌能力、口腔異味程度的影響。本研究為開發緩解貓口腔異味的產品提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

第一，試驗材料。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）提取、分離自口腔異味問題嚴重的貓口腔內壁；ε-聚賴氨酸鹽酸鹽購自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；乳酸鏈球菌素購自上海麥克林生化科技有限公司；茶多酚購自北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；貝索便隱血檢測試紙購自珠海貝索生物技術有限公司；艾瑞金牙菌斑指示劑購自安陽森浠醫學有限公司。

第二，儀器。Multiskan FC酶標儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；旋轉蒸發儀購自鄭州予輝儀器設備有限公司；聚能式超聲購自小美超聲儀器（昆山）有限公司；ShowNovo智能口氣檢測儀購自深圳市時代傳感技術有限公司。

1.2 復合抑菌型卵磷脂脂質體的制備

參考徐碩的方法制備大單室脂質體并略作修改。經超聲處理（750 W、25 kHz、工作/間歇時間2 s/2 s、4 min）后制得卵磷脂小單室脂質體混懸液。

取200 mL卵磷脂小單室脂質體混懸液與0.128 g ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、3.2 g乳酸鏈球菌素和9.6 g茶多酚混合均勻，經反復凍融包埋后，凍干制得復合抑菌型卵磷脂脂質體。同時取卵磷脂粉末，按相同比例加入三種抑菌物質進行混合，制得非包埋型的抑菌物—卵磷脂混合物，用于對照實驗。

1.3 包埋率測定

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽由25～30個賴氨酸殘基組成，通過全自動氨基酸分析儀檢測賴氨酸含量，檢測參考GB 5009.124—2016進行。乳酸鏈球菌素穩定包含硫元素，脂質體其他原料均不含硫元素，通過對硫元素含量測定計算乳酸鏈球菌素的含量，檢測參考GB/T 17776—2016進行。茶多酚含量測定參考GB/T 8313—2018進行，脂質體中包埋茶多酚質量為總添加質量與游離茶多酚質量的差值。其中游離茶多酚質量測定時，取脂質體加蒸餾水重溶，離心處理（13 000 r/min，30 min）測定上清中茶多酚含量即游離的茶多酚。三個物質的包埋率按式（1）計算：

（1）

注：式（1）中，E為包埋率，單位為%；m1為脂質包埋體中ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、乳酸鏈球菌素或茶多酚的質量，單位為g；m2為相應物質進行包埋時的添加質量，單位為g。

1.4 抑菌率測定

參考趙曉慶的方法配制蔗糖液體培養基并制備變形鏈球菌工作菌懸液。參考張守玉的方法測定脂質體半數抑制濃度（50 % inhibitory concentration，IC50）并略作修改。取復合抑菌型卵磷脂脂質體和抑菌物—卵磷脂混合物溶解于蔗糖液體培養基，使其終濃度為5、10、20、30、40、50 mg/mL。按0.5 %（v/v）接種變形鏈球菌工作菌懸液，37℃厭氧培養罐中培養8 h。對照組使用蔗糖液體培養基按0.5 %（v/v）接種變形鏈球菌，其他操作不變。通過酶標儀測定樣品組和對照組培養前后200 μL菌液在600 nm下的OD值。抑菌率按式（2）計算：

（2）

注：式（2）中，I為抑菌率（%）；OD1和OD2為樣品組培養前、后的OD值；OD3和OD4為對照組培養前、后的OD值。

以樣品濃度為橫坐標、抑菌率為縱坐標，繪制曲線。抑菌率為50 %代入曲線方程，計算得到的濃度即為IC50。

1.5 小鼠急性毒性試驗

最大耐受劑量法：20只健康8周齡ICR小鼠，雌雄各半。每只按喂食劑量的20倍，即720 mg/kg·bw一次性灌胃復合抑菌型卵磷脂脂質體。連續觀察10 d，觀察小鼠活動狀態、中毒癥狀及死亡情況。

1.6 貓食用抑菌凍干和普通凍干的制備

將3 g復合抑菌型卵磷脂脂質體與97 g粉碎的市售凍干雞肉混合，加水攪拌成糊，經鑄模、預凍、脫模和凍干后制備貓食用抑菌凍干。以不加三種抑菌物質的卵磷脂脂質體制備貓食用的普通凍干。每顆凍干約0.3 g，低溫、干燥保存備用。

1.7 貓喂食試驗

第一，動物分組及喂食方式。喂食試驗分三組，對照組、試驗組和正常組。挑選24只存在口腔異味問題的成年貓（5～7歲），公母各半，體重3.1～4.3 kg，品種包括英短、貍花、布偶和美短。將貓均勻分配到對照組和試驗組，試驗前三個月停止清理口腔牙菌斑。再挑選12只健康的、定期刷牙清理口腔牙菌斑的青年貓（1.2～1.5歲），公母各半，體重2.7～3.6 kg，品種包括英短、貍花和美短，作為正常組。每只貓每天提供60 g市售全價貓糧，飲水自由。對照組和試驗組貓分別喂食普通凍干和抑菌凍干，每只每天固定時間喂食兩次，每次2粒，試驗進行20 d。

第二，貓牙菌斑率測定。參考劉挺立的方法進行并略作修改。使用艾瑞金牙菌斑指示劑，用棉簽蘸取少量牙菌斑顯示劑均勻涂抹牙齒及牙齦各面，染上顏色處即為牙菌斑。牙菌斑率按式（3）計算：

（3）

注：式（3）中，I為牙菌斑率（%）；n為被染色有牙菌斑的牙齒數，N為總牙齒數。

第三，貓唾液抑菌效果測試。在滅菌的離心管中加入10 mL滅菌生理鹽水，用無菌棉拭子在貓舔舐的前足固定部位（5 cm×2 cm區域）采樣。棉拭子采樣后投入生理鹽水中，充分混勻制備樣液，參考GB 4789.2—2022的方法進行菌落計數。結果以單位面積菌落總數表示。

第四，貓口腔異味度感官評價。測定參考韓立軍的方法并略作修改，挑選十位測試人員進行盲法測試，臭味越明顯的分數越高：1分，微弱；2分，可感知；3分，中度；4分，強烈；5分，難以忍受。其中1分接近于定期清理牙菌斑1歲青年貓口腔異味水平，5分接近長期未清理牙菌斑8歲老年貓口腔異味水平。試驗組貓口腔異味消除率測定按式（4）計算：

（4）

注：式（4）中，R為口腔異味消除率，單位為%；D、S和Z分別為對應時間點對照組、試驗組和正常組的口腔異味度評分分數。

第五，貓口腔硫化物含量。保持貓口腔密閉，利用氣閉性針筒和軟管采集口腔中氣體20 mL。將軟管出口對準智能口氣檢測儀檢測口，距離1 cm勻速推注針筒，5 s內完成。儀器自動檢測并顯示數值。

第六，貓口腔氨含量。安撫受試貓，使用蒸餾水沾濕的脫脂棉刮蹭貓口腔上腔和舌頭，之后浸泡于25 mL的0.01 mol/L硫酸溶液

2 h，經離心處理（4 000 r/min，10 min）后留取上清備測。使用茚三酮法測量上清中氨含量，測定參考劉秦仲的方法進行測定。

1.8 統計學處理

試驗結果以SPSS 26.0軟件進行統計學分析，試驗數據用表示，采用One Way-ANOVA檢驗對數據進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果分析與討論

2.1 貓口臭情況調研

對家庭、貓舍、收容所的51只貓進行調研，結果如圖1所示，發現貓口腔異味問題普遍存在，異味主要表現為肉類腐敗和氨氣的味道，個別的還存在魚腥味。因口腔疾病原因引發的口腔異味占比最高，達70.6 %，包括牙菌斑、牙結石、口腔潰瘍等，主要是因為口腔微生態平衡被打破，有害菌過度繁殖所致[7]，其中存在口腔有害菌變形鏈球菌的貓的檢出率超過90 %。針對這部分口源性疾病所致口腔異味的貓，本研究期望通過用卵磷脂脂質體包埋抑菌物質制備復合抑菌型卵磷脂脂質體，起到抑制貓口腔有害菌生長、降低口腔異味程度的作用。

2.2 包埋率

ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、乳酸鏈球菌素和茶多酚三種物質在復合抑菌型卵磷脂脂質體中包埋率分別為94.8 %±4.3 %、93.6 %±5.2 %和88.4 %±4.7 %。包埋效果好，可用于后續試驗。

2.3 抑菌率測定

復合抑菌型卵磷脂脂質體的抑菌率—濃度曲線方程為y=31.592 In（x）-21.97（R2=0.9 558），抑菌物—卵磷脂混合物的曲線方程為y=51.318 In（x）-120.11（R2=0.9 425）。根據曲線計算得到復合抑菌型卵磷脂脂質體的IC50為9.76 mg/mL，抑菌物—卵磷脂混合物的IC50為27.52 mg/mL（圖2）。經過脂質包埋工藝制備的抑菌型脂質體對變形鏈球菌的抑制能力優于非包埋型抑菌物—卵磷脂混合物。

2.4 小鼠急性毒性試驗

最大耐受劑量法：在10 d觀察期內，所有小鼠均保持正常活動，精神狀態良好，無死亡無中毒。復合抑菌型卵磷脂脂質體在720 mg/kg·bw以下劑量對小鼠無毒副作用。

2.5 貓牙菌斑率測定

喂食試驗前后貓牙齒和牙齦經指示劑染色情況如圖2所示。喂食試驗后染紅的牙齒數量減少。

如圖3所示，喂食試驗期間試驗組貓牙菌斑率持續下降，喂食第16 d時牙菌斑率降至15.28 %±2.83 %，相比對照組顯著下降75.13 %（P＜0.05），與正常組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.6 貓唾液抑菌效果測試

如圖4所示，喂食試驗期間試驗組貓體表微生物數量持續下降，喂食第12 d時降至304±30 CFU/cm2，相比對照組顯著下降62.49 %（P＜0.05），與正常組間無差異（P＞0.05）。

2.7 貓口腔異味度感官評價

如圖5所示，喂食試驗期間試驗組貓口腔異味評分在第4 d時顯著下降（P＜0.05），第8天時降至較低水平，為1.2±0.3分，與正常組間無顯著差異（P＞0.05），口腔異味消除率為91.67 %。

2.8 貓口腔硫化物含量

口氣檢測儀檢測臭味氣體主要是甲硫醇和硫化氫等硫化物，呈刺激性臭雞蛋味。如圖6所示，喂食試驗期間試驗組貓口腔硫化物量先下降后平穩，喂食第12天時試驗組降至0.17±0.04 mg/kg，相比對照組顯著降低59.52 %（P＜0.05），與正常組間無顯著差異（P＞0.05），之后趨于平穩。

2.9 貓口腔氨含量

如圖7所示，試驗組貓口腔氨含量呈先下降后平穩趨勢，在喂食12 d時降至13.1±3.4 ug，相比對照組顯著降低79.72 %（P＜0.05），與正常組間無顯著差異（P＞0.05），之后趨于平穩。氨是另一個會帶來貓口腔異味的物質。口腔中有害菌會分解食物殘渣中蛋白產生大量氨，氨易溶于水，會貯存于貓口腔中富含粘液的位置，達一定濃度后散發刺激性惡臭味，需從源頭抑制有害菌生長才能減少氨的產生。

3 討論

本研究通過體外試驗和貓喂食試驗，研究了復合抑菌型卵磷脂脂質體的抑菌能力。經過包埋工藝制備的脂質體對貓口腔有害菌變形鏈球菌的抑制能力相比未包埋型有顯著提高，其IC50為9.76 mg/mL，相比未包埋型顯著降低64.53 %。主要是因為復合抑菌型卵磷脂脂質體中ε-聚賴氨酸基團具疏水性，可形成網絡附著于脂質體的表面，其帶正電荷，會與細菌表面帶負電荷脂磷壁酸結合，起靶向定位作用，將整個脂質體和其他兩種抑菌物質定位到變形鏈球菌附近，實現殺菌物質靶向富集，進而提高殺菌效果。目前市面上缺少應對輕、中度寵物口腔異味問題的調理類產品，大多是發展至問題嚴重時聯系寵物醫生通過抗生素藥劑、殺菌劑或者漱口水（通常含有香精）治療，雖短時起效，但持續時間有限，長期使用會造成貓的口腔菌群紊亂失衡，引起腹瀉、腸道炎癥等，使貓的健康惡化。本研究中所制備抑菌型脂質體中三種抑菌物都是天然來源的，安全性高，急性毒性試驗的結果說明，其在日常攝入的20倍劑量下無毒副作用。

牙菌斑是指黏附在牙面、牙間或者牙齦表面的細菌性群體，難以直接通過水沖掉或者漱口去除，牙菌斑率是反映口腔抑菌能力的重要指標。貓的唾液中含有溶菌酶等殺菌物質，能抑制外源有害菌生長，然而貓唾液難以直接獲取。貓喜歡舔舐自己前足固定位置，通過唾液清理毛發，所以可通過貓前足固定位置體表微生物數量反映貓唾液的抑菌效果。牙菌斑率和唾液抑菌效果測試中，喂食含抑菌型脂質體的抑菌凍干后，相比對照組貓口腔牙菌斑率顯著降低75.13 %、貓舔舐前足固定部位的體表微生物數量顯著降低62.49 %。說明復合抑菌型卵磷脂脂質體有助于提高貓口腔抑菌能力。

本文先通過人嗅聞對異味程度進行綜合性評價，再通過貓口腔硫化物和氨含量進行指標評價。在喂食含抑菌型脂質體的抑菌凍干8 d后，試驗組貓的口腔異味消除率達到91.67 %，其中貓口腔硫化物含量和氨含量分別下降了59.52 %和79.72 %。結果說明，復合抑菌型卵磷脂脂質體能有效緩解貓口腔的異味程度，貓口腔中硫化物和氨含量下降一半時，人的對其異味程度感受下降超過90 %。

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