IDH1-R132H突變體通過調(diào)節(jié)HIF-1α通路抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞惡性進(jìn)展

【摘要】 目的 探究異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）-R132H突變體通過調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）通路抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞惡性進(jìn)展。方法 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。將U87細(xì)胞分為對(duì)照組、Vector組、IDH1 wt組、IDH1-R132H組，qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)IDH1 wt、IDH1-R132H轉(zhuǎn)染效率，噻唑藍(lán)（MTT）和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western Blot檢測(cè)IDH1、PCNA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)。結(jié)果 與癌旁組織和正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs相比，膠質(zhì)瘤組織和人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果表明，IDH1 wt、IDH1-R132H 轉(zhuǎn)染成功；與對(duì)照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細(xì)胞活性、PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)明顯升高，且 IDH1-R132H 組克隆細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；但對(duì)照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標(biāo)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 IDH1-R132H突變體可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α通路抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 IDH1-R132H突變體；HIF-1α通路；膠質(zhì)瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】 R739.41" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A" 【文章編號(hào)】 1672-7770（2024）06-0654-06

The IDH1-R132H mutant inhibits malignant progression of glioma U87 cells by regulating the HIF-1α pathway FANG Song， TANG Guoqiang， YE Youzhong， LI Mingsong， CHEN Jiabei.Department of Neurosurgery， Chenzhou First Peoples Hospital， Chenzhou 423000， China

Corresponding Author： CHEN Jiabei

Abstract：" Objective To investigate the inhibition of malignant progression of glioma U87 cells by the regulation of hypoxic-induced-factor-1α（HIF-1α） pathway by mutant isocitrate dehydrogenase 1 R132H（IDH1-R132H）. Methods Real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot were used to detect IDH1 mRNA and protein expression levels in glioma tissues and cells. U87 cells were divided into control group， Vector group， IDH1-wt group and IDH1-R132H group. The transfection efficiency of IDH1-wt and IDH1-R132H were detected by qRT-PCR and Western Blot， and cell proliferation was detected by MTT and clonal formation experiments. Cell migration was detected by Transwell， apoptosis was detected by flow cytometry， Western Blot analysis of IDH1， PCNA， matrix metalloproteinase-2（MMP-2）， Bcl-2 associated X protein（Bax）， B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2）， vascular endothelial growth factor（VEGF）， HIF-1α， HIF-2α protein expression. Results The expression levels of IDH1 mRNA and protein in glioma tissues and human glioblastoma cells T98G， U138， U87 were significantly lower than those in para-cancerous tissues and normal glioblastoma cells（Plt;0.05）. qRT-PCR and Western Blot proved successful transfection of IDH1-wt and IDH1-R132H. Compared with control group or Vector group， IDH1-R132H group significantly decreased cell activity， PCNA，"MMP-2 and Bcl-2 protein expression， significantly increased VEGF， HIF-1α and HIF-2α protein expression， decreased the number of cloned cells and migrated cells， and significantly increased apoptosis rate and Bax protein expression， and the number of cloned cells and migrated cells in IDH1-R132H group were decreased， while the apoptosis rate and Bax protein expression were significantly increased（Plt;0.05）. However， pairwise comparison of the above indicators in control group， Vector group and IDH1-wt group showed no statistical significance（Pgt;0.05）. Conclusions The IDH1-R132H mutant may inhibit the proliferation and migration of glioma U87 cells and induce apoptosis by regulating the HIF-1α pathway.

Key words： IDH1-R132H mutant; HIF-1α pathway; glioma; cell proliferation; cell migration; apoptosis

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科常見顱內(nèi)腫瘤，始于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，占原發(fā)腦腫瘤60%以上，可嚴(yán)重影響患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，多數(shù)患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤5年生存率未超過10%^［1］。近幾年雖然膠質(zhì)瘤綜合治療已獲得重大突破，但治療效果不甚理想。2008年，有研究通過高通量測(cè)序首次發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中存在異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）基因點(diǎn)突變，多項(xiàng)研究顯示，約80%～90%世界衛(wèi)生組織Ⅱ/Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤患者、繼發(fā)膠質(zhì)瘤患者存在IDH1/2基因突變，這一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤診療帶來新的希望^［24］。研究證實(shí)，IDH1基因突變?cè)谀z質(zhì)瘤中常見突變類型為在第132位的精氨酸（R）轉(zhuǎn)換為組氨酸（H），約占90%以上，IDH1基因突變有望成為膠質(zhì)瘤輔助診斷和預(yù)后評(píng)估潛在生物標(biāo)記物^［5］。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，IDH1-R132H突變可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移^［6］。缺氧是腫瘤常見特征，缺氧環(huán)境下可激活腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲，引起低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達(dá)上調(diào)，HIF-1α是缺氧應(yīng)答過程中重要轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高表達(dá)，可介導(dǎo)參與腫瘤進(jìn)展，是腫瘤治療的潛在作用靶點(diǎn)^［7］。關(guān)于IDH1-R132H突變體通過調(diào)控HIF-1α通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展的研究較少見，本研究主要探討IDH1-R132H突變體通過調(diào)節(jié)HIF-1α通路對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等影響。

1 資料與方法

1.1 主要細(xì)胞與試劑 人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87和正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs購于美國ATCC公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640培養(yǎng)基、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix試劑盒購于美國賽默飛世爾科技公司；Lipofectamine 3000試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen；質(zhì)粒及引物購于上海吉瑪公司；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell購于美國Corning公司；IDH1抗體、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、HIF-1α抗體、HIF-2α抗體購于英國Abcam公司。

1.2 樣本收集 選取2020年3月—2021年3月于郴州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的36例膠質(zhì)瘤患者，術(shù)中收集患者膠質(zhì)瘤組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣≥3 cm），其中男26例，女10例；年齡35～65歲，平均（52.27±8.11）歲；部位額葉22例，顳葉9例，其他5例；腫瘤直徑lt;3 cm 19例，≥3 cm 17例；ⅠⅡ級(jí)21例，ⅢⅣ級(jí)15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)^［8］，經(jīng)病理組織學(xué)專家確診；（2）均為首次確診，入組前未接受放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）預(yù)計(jì)生存期＜6個(gè)月；（3）免疫缺陷疾病；（4）其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；（5）傳染性疾病；（6）既往存在顱內(nèi)手術(shù)史或家族腦病史。

1.3 培養(yǎng)細(xì)胞與分組 正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs、人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87常規(guī)復(fù)蘇后，細(xì)胞置于10% FBS、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長鋪至90%～95%時(shí)，棄舊培養(yǎng)基，加胰酶消化傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長期U87細(xì)胞，1×104個(gè)/孔鋪至6孔板，培養(yǎng)24 h保證細(xì)胞生長至80%，用Lipo 3000試劑轉(zhuǎn)染空載體Vector、過表達(dá)IDH1 wt質(zhì)粒、過表達(dá)IDH1-R132H質(zhì)粒，記為Vector組、IDH1 wt組、IDH1-R132H組，將未經(jīng)任何處理的U87細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)IDH1 mRNA表達(dá) 取膠質(zhì)瘤組織、癌旁組織、正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs、人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87及培養(yǎng)24 h的各組U87細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，保證A260/A280值處于1.8～2.0之間。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。2^-ΔΔCt法計(jì)算IDH1 mRNA表達(dá)。

1.5 MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組U87細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種96孔板中，培養(yǎng)48 h后每孔內(nèi)添加20 μL MTT溶液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h其培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，置于酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定A值，計(jì)算細(xì)胞活性（%）。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：各組U87細(xì)胞使用胰酶消化吹打，細(xì)胞懸液以2×105個(gè)接種6孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，肉眼可見有團(tuán)落形成，其培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，漂洗4次晾干后，用顯微鏡觀察細(xì)胞克隆數(shù)目。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 各組U87細(xì)胞用不含血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，調(diào)整成密度為1×105個(gè)/mL，在Transwell上室加入100 μL懸液，下室加500 μL含血清培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h，拿棉簽擦掉未穿膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，漂洗4次晾干后，用顯微鏡觀察細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組U87細(xì)胞用預(yù)冷磷酸鹽緩沖處理，調(diào)整細(xì)胞懸液為1×105個(gè)/mL，24 h后加入500 μL Binding Buffer，參考凋亡試劑盒說明書，先后加入5 μL Annexin VFITC、5 μL PI，遮光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集膠質(zhì)瘤組織、癌旁組織、正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs、人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87及培養(yǎng)24 h的各組U87細(xì)胞，加100 uL細(xì)胞裂解液，置于4 ℃搖床上30 min，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，12 000 rpm/min離心20 min取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品、5×上樣緩沖液以4∶1混合，沸水變性5 min，經(jīng)10%凝膠電泳處理后，轉(zhuǎn)膜、封閉培養(yǎng)2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃過夜孵育，37 ℃加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液孵育2 h，加顯色試劑顯影后、拍照，采用Image J分析各條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中IDH1表達(dá)水平 與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤組織中IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs相比，人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 IDH1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 為驗(yàn)證IDH1-R132H、IDH1 wt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，在U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染24 h后RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組或Vector組比較，IDH1 wt組、IDH1-R132H組中IDH1 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。在U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后提取蛋白，F(xiàn)lag抗體進(jìn)行Western Blot，結(jié)果顯示，IDH1 wt組、IDH1-R132H組細(xì)胞均表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽IDH1，證明轉(zhuǎn)染IDH1-R132H及IDH1 wt轉(zhuǎn)染成功。見圖2。

2.3 IDH1-R132H突變體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響 與對(duì)照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細(xì)胞活性、PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)明顯降低，克隆細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），但對(duì)照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標(biāo)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖3。

2.4 IDH1-R132H突變體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），但對(duì)照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標(biāo)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖4。

2.5 IDH1-R132H突變體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF-1α通路相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組或Vector組比較，IDH1-R132H組VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），但對(duì)照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標(biāo)兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖5。

3 討 論

IDH是三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵限速酶，可催化異檸檬酸氧化生成草酰琥珀酸，進(jìn)一步氧化脫羧促進(jìn)α-酮戊二酸，在細(xì)胞能量生成和合成中具有重要作用^［9］。據(jù)報(bào)道顯示，IDH基因分為IDH1、IDH2、IDH3，根據(jù)輔酶不同分為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）依賴性、NAD+依賴性，其中IDH1、IDH2屬于前者，IDH3屬于后者^［10］。有報(bào)道顯示，與膠質(zhì)瘤關(guān)系最為密切的是IDH1，主要由細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶分泌，位于染色體2q33.3區(qū)域，對(duì)細(xì)胞抗氧化有重要作用，IDH1突變類型包括R132H、R132L、R132G、R132S、R132C、R132Q，其中突變體R132H類型最為常見^［11］。IDH1-R132H突變不僅改變IDH1催化活性，還可降低α-酮戊二酸和NADP+，從而改變細(xì)胞正常代謝過程^［12］。

有研究報(bào)道顯示，IDH1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，免疫組化法和WB法顯示，IDH1-R132H突變率為51.4%，且與患者臨床分期、病理類型、Ki-67陽性密切相關(guān)，證明了IDH1-R132H可影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展^［13］。Li等^［14］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IDH1-R132H可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲，體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)IDH1-R132H也可抑制小鼠移植瘤小鼠生長。Cui等^［15］的研究顯示，IDH1-R132H突變體可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并阻礙膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞神經(jīng)球形成。本研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤組織中IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)低于癌旁組織，在人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)低于正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs，這與杜寧等的研究一致^［13］。由于IDH1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在U87細(xì)胞中表達(dá)最低，故選擇其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將空載體、過表達(dá)IDH1-R132H、IDH1 wt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞中，qRT-PCR和Western Blot證明其IDH1 wt、IDH1-R132H轉(zhuǎn)染成功。

PCNA、MMP-2是細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)志物，在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移^［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IDH1-R132H可降低細(xì)胞活性、PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)，并減少克隆細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)，但過表達(dá)IDH1 wt無明顯變化，可見過表達(dá)IDH1-R132H可抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和遷移。Bax和Bcl-2是凋亡常見標(biāo)志物，可拮抗共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡^［17］。本研究中，過表達(dá)IDH1-R132H增加細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2蛋白表達(dá)，但過表達(dá)IDH1 wt無明顯變化，可見過表達(dá)IDH1-R132H可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡。

腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖速度，加快腫瘤惡性進(jìn)展，導(dǎo)致血供不足，故腫瘤內(nèi)部常處于缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致HIF-1表達(dá)上調(diào)^［18］。大量研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1通過調(diào)節(jié)多種上下游因子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、糖酵解和凋亡等過程^［1920］。HIF-1激活后可刺激VEGF基因與缺氧反應(yīng)元件序列結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控增加VEGF表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成^［21］。有研究報(bào)道顯示，胃復(fù)方可通過抑制HIF-1α/VEGF通路從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)^［22］，但其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中研究報(bào)道較少。本研究中過表達(dá)IDH1-R132H可增加VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)，但過表達(dá)IDH1 wt無明顯變化，可見過表達(dá)IDH1-R132H對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的惡性進(jìn)展可能與HIF-1α/VEGF通路有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，過表達(dá)IDH1-R132H抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能與調(diào)節(jié)HIF-1α通路有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待考究，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：方松負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究方案；唐國強(qiáng)、葉友忠負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作；李明松負(fù)責(zé)論文修改；陳加貝負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查找及數(shù)據(jù)分析。

［參" 考"" 文"" 獻(xiàn)］

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通信作者：陳加貝