單細胞RNA測序和孟德爾隨機化分析IgA腎病關鍵基因的調控作用

[摘要]"目的"探討IgA腎病（IgA"nephropathy，IgAN）中重點細胞類型的基因表達及關鍵基因ADI1、BNIP3L、SERPINE2對IgAN發生、發展的調控作用。方法"采用基因表達綜合數據庫（gene"expression"omnibus，GEO）和eQTLGen聯盟數據庫，通過孟德爾隨機化（mendelian"randomization，MR）和單細胞RNA測序（single-cell"gene"expression，scRNA-seq），探討IgAN的關鍵細胞類型及ADI1、BNIP3L、SERPINE2與IgAN間的因果關系。使用Seurat軟件包讀取表達譜并篩選低表達基因，通過差異基因表達分析篩選TOP100高表達基因，采用敏感性分析和異質性檢驗選擇顯著的基因結果。最后，通過重要基因的調控網絡分析和微小核糖核酸（microRNA，miRNA）網絡構建對MR結果進行驗證。結果"ADI1（OR=0.946，95%CI：0.900～0.994，P=0.029）、BNIP3L（OR=0.820，95%CI：0.707～0.950，P=0.008）、SERPINE2（OR=0.958，95%CI：0.919～0.999，P=0.045）可能與IgAN風險降低相關。KLF6（OR=1.318，95%CI：1.036～1.678，P=0.025）與IgAN的風險升高相關。結論"揭示包括近端腎小管細胞在內的18種關鍵細胞類型的基因特征，確定ADI1、BNIP3L、SERPINE2與IgAN發生、發展的調控作用密切相關。

[關鍵詞]"單細胞RNA測序；孟德爾隨機化；IgA腎病；關鍵基因；慢性腎病

[中圖分類號]"R692.5"""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.002

Single-cell"RNA"sequencing"and"Mendelian"randomization"to"analyze"regulatory"role"of"key"genes"in"IgA"nephropathy

QIU"Minhua1，2，"JIANG"Peng2，3，"CHEN"Jibing2，3，"ZHANG"Ting2，3，"GAO"Hongjun2，3

1.Graduate"School"of"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530001，"Guangxi，"China;"2.Department"of"Organ"Transplantation，"Ruikang"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530011，"Guangxi，"China;"3.Clinical"Translational"Medicine"Center，"Ruikang"Hospital"Affiliated"to"Guangxi"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Nanning"530011，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"gene"expression"of"key"cell"types"in"IgA"nephropathy"（IgAN）"and"regulatory"role"of"key"genes"ADI1，"BNIP3L"and"SERPINE2"in"occurrence"and"development"of"IgAN."Methods"The"gene"expression"omnibus"（GEO）"and"eQTLGen"consortium"database"were"used"to"perform"Mendelian"randomization"（MR）"and"single-cell"RNA"sequencing"（scRNA-seq）."Key"cell"types"of"IgAN"and"causal"relationship"between"ADI1，"BNIP3L，"SERPINE2"and"IgAN"were"investigated."Expression"profiles"and"screened"out"low"expression"genes"were"read"through"Seurat"package，"and"used"differential"gene"expression"analysis"to"screen"TOP100"highly"expressed"genes."In"addition，"were"used"sensitivity"analysis"and"heterogeneity"test"were"used"to"select"significant"results."Results"ADI1"（OR=0.946，"95%CI："0.900–0.994，"P=0.029），"BNIP3L"（OR=0.820，"95%CI："0.707–0.950，"P=0.008），"SERPINE2"（OR=0.958，"95%CI："0.919–0.999，"P=0.045）"might"be"associated"with"a"lower"risk"of"IgAN."However，"KLF6"（OR=1.318，"95%CI："1.036–1.678，"P=0.025）"was"associated"with"high"risk"of"IgAN."Conclusion"Genetic"characteristics"of"18"key"cell"types"including"proximal"renal"tubule"cells"were"revealed.ADI1，"BNIP3L"and"SERPINE2"are"closely"related"to"the"regulation"of"IgAN.

[Key"words]"Single-cell"RNA"sequencing;"Mendelian"randomization;"IgA"nephropathy;"Key"genes;"Chronic"kidney"disease

IgA腎病（IgA"nephropathy，IgAN）是最常見的原發性腎小球腎炎，其主要機制是IgAN在內的免疫復合物存在于腎小球系膜中，引起一系列炎癥反應，導致患者進展為心血管疾病死亡和終末期腎病（end-stage"renal"disease，ESRD）[1]。識別可改變的危險因素對預防IgAN進展和提高治療效果具有重要意義。近年來，利用單細胞RNA測序技術的研究表明，IgAN患者外周血中B2亞群細胞數明顯增加[2]。T細胞失衡可導致B細胞產生過多異常的IgA。幼稚CD4+T細胞分化為輔助性T細胞，分泌并產生各種細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL）-17a、IL-17f和IL-22，使炎癥細胞進一步浸潤腎組織，加重IgAN損傷[3]。研究表明免疫細胞特征與IgAN間存在很強的關聯性[4]。孟德爾隨機化（Mendelian"randomization，MR）是一種用于因果推理的流行病學方法，其中與暴露因素密切相關的遺傳變異被用作工具變量[5-6]。MR的功能類似于隨機對照試驗，因為基因型在減數分裂期間是隨機分配的，可限制混雜因素的影響和反向因果關系[7-8]。本研究采用單細胞RNA測序（single-cell"gene"expression，scRNA-seq）和MR方法探討IgAN的重點細胞類型和基因表達，分析與IgAN發生、發展相關的重點基因間的遺傳關系和因果關系，以證實免疫、信號和代謝通路在IgAN發病機制中的重要作用。

1""資料與方法

1.1""數據獲取

從基因表達綜合數據庫（gene"expression"omnibus，GEO）[9]下載GSE171314單細胞數據文件，下載5例帶有完整單細胞表達譜的樣本數據用于單細胞分析。eQTL數據來自eQTLGen聯盟（https：//www."egtlgen.org）數據庫。本研究選擇全基因組關聯研究數據庫。結局匯總數據來源于歐洲生物信息學研究所數據庫。其中，IgAN病例有15"587例和對照""462"197例。

1.2""scRNA-seq

首先通過Seurat包讀取表達譜并篩除低表達基因，依次對數據進行標準化分析處理，通過ElbowPlot觀察最佳主成分（principal"component，PC）數，通過UMAP分析得到每個cluster間的位置關系；通過已知的細胞標志物對cluster進行注釋，分別被注釋到一些與疾病發生有重要關系的細胞。最后從單細胞表達譜中提取每個細胞亞型的標記基因。篩選其中log2"FCgt;0.585且P_adjlt;0.05的基因作為每個細胞亞型中的特有標記基因。進行差異基因表達分析篩選對照vs.疾病的TOP100高表達基因，將其作為cluster的特征基因并計算這些基因在每個細胞亞型中的差異表達水平和表達占比，最后計算疾病貢獻度。

1.3""MR與調控網絡分析

提取在eQTL中的相關因果關系，選擇與每個基因在全基因組顯著性閾值相關的單核苷酸多態性（single"nucleotide"polymorphism，SNPs）作為潛在的工具變量，計算SNPs間的連鎖不平衡。依次通過逆方差加權、MR"Egger、加權中位數法估計、加權模型估計4種統計方法評估因果關系的可靠性，獲得全血基因表達對IgA腎病影響的總體估計。運用MR留一法敏感性分析評估特定遺傳變異對膠質瘤風險的影響。采用MR異質性檢驗評估所研究的SNPs間是否存在統計異質性。通過R軟件包“RcisTarget”預測轉錄因子。進一步分析在關鍵基因中是否有部分miRNAs調節一些危險基因的轉錄或降解。

2""結果

2.1""數據下載及scRNA-seq結果

下載GSE171314單細胞數據，共納入5例樣本，在初步篩選之后，標準差最高的10個基因分別是KLK1、1L1RL1、CCL4L2、CCL3L1、NPHS2、CCL4、S100A9、CCL3、S100A8、RGS5。通過對10個基因進行分析獲得18個亞群，可歸類為11種細胞類型，即循環細胞、平滑肌細胞、單核吞噬細胞、間質細胞、主細胞、亨利氏細胞環、遠端腎小管細胞、近端腎小管細胞、吞噬細胞、內皮細胞和系膜細胞。通過篩選總樣本中對照vs.疾病的TOP100高表達基因，計算疾病貢獻度發現近端腎小管上皮細胞的貢獻度最高，因此將近端腎小管上皮細胞作為后續分析的關鍵細胞，篩選其中log2FCgt;0.585且P_adjlt;0.05的基因，共獲得328個細胞基因。

2.2""MR分析、敏感性分析和異質性分析

為進一步找出影響IgAN的關鍵基因，通過IgAN相關的477"784例樣本，依次使用提取儀器和提取數據提取到232對基因與結局相關的因果關系。進一步通過MR篩選得到4對基因對應eQTL陽性結局，對應4個基因依次是ADI1、BNIP3L、KLF6、SERPINE2。ADI1（OR=0.946，95%CI：0.900～"0.994，P=0.029）、BNIP3L（OR=0.820，95%CI：0.707～"0.950，P=0.008）、SERPINE2（OR=0.958，95%CI：0.919～0.999，P=0.045）的存在可能與IgAN的低風險相關；而基因KLF6（OR=1.318，95%CI：1.036～"1.678，P=0.025）與IgAN的高風險相關。進一步對4個基因的因果關系進行敏感性分析確定其可靠性。結果顯示剔除任何一個SNP后對總體誤差線的影響并不明顯。此外，對4對因果關系進行異質性分析，將3個異質性檢驗Pgt;0.05的基因作為后續分析的關鍵基因。這些關鍵基因分別是ADI1、BNIP3L、SERPINE2。

2.3""關鍵基因的scRNA-seq分析及免疫代謝通路富集分析

采用scRNA-seq方法分析關鍵基因在腎小球系膜細胞、內皮細胞、吞噬細胞、近端腎小管細胞、遠端腎小管細胞、細胞環、主細胞、間插細胞、單核吞噬細胞、平滑肌細胞、循環細胞中的表達情況。將ADI1、BNIP3L、SERPINE2關鍵基因用于本次分析的基因集，關鍵基因所有富集到的Motifs和相應的轉錄因子見圖1。通過miR-Walk數據庫對3個關鍵基因進行反向預測，得到42個miRNA，共43對mRNA-miRNA關系見圖2。

3""討論

IgAN是世界范圍內最常見的原發性腎小球腎炎，占ESRD的概率為20%～40%，其高發病率和高死亡率給社會和經濟帶來巨大的負擔。IgAN的病理生理機制尚未完全闡明。侵入性腎活檢是目前唯一可用的識別IgAN的工具，目前的治療方法在臨床中尚未達到預期療效。因此，迫切需要在充分了解發病機制的基礎上開發新的非侵入性方法和更有效的治療方案[11]。本研究采用scRNA-seq方法在GSE171314單細胞數據中納入5例單細胞數據樣本，通過計算得出近端腎小管上皮細胞與10個基因的豐度密切相關，并通過近端腎小管上皮細胞篩選出328個細胞基因。Perry等[12]研究表明，腎小管上皮細胞中的巨噬細胞集落刺激因子主要通過與其受體基因結合并促進腎小管細胞增殖保護急性腎損傷。本研究結果表明SLC12A3在IgAN發生和發展中有潛在作用。SLC12A3是一種基因編碼鈉-氯化物協同轉運蛋白，可介導腎遠曲小管中的Na和Cl重吸收，在腎臟疾病中具有遺傳效應[13]。此外，SLC12A3"基因中的單核苷酸變異Arg913Gln與2型糖尿病患者的糖尿病腎病有關。本研究MR篩選得到4對基因對應eQTL陽性結局的因果關系。其中，ADI1、BNIP3L、SERPINE2的存在可能與IgAN低風險相關，而基因KLF6與IgAN高風險相關。進一步敏感度和特異性分析證實ADI1、BNIP3L、SERPINE2對IgAN均有良好的診斷性能。研究表明ADI1作為一個代謝相關基因，與巨噬細胞M2、中性粒細胞、樹突狀細胞活化呈正相關，與巨噬細胞M1、B淋巴細胞、T淋巴細胞CD4呈負相關[14]；側面提示ADI1與抑制性免疫表型相關，而免疫系統的參與是IgAN的重要致病原因之一，證實ADI1的表達水平在IgAN患者中的意義。Pan等[15]研究發現BNIP3L與線粒體活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）和線粒體自噬通路密切相關。BNIP3L參與控制血小板炎性小體活化，后者和線粒體功能障礙的擴增回路可減輕敗血癥相關急性腎損傷。Delgado等[16]研究證明，使用針對BNIP3L的反義寡核苷酸阻斷缺氧誘導的BNIP3L表達或通過表達BNIP3L突變阻斷"BNIP3L功能來抑制缺氧誘導的人胚胎腎293細胞的死亡。在人上皮細胞系中，缺氧介導的BNIP3L表達受轉錄因子缺氧誘導因子-1α的調節，在細胞死亡中發揮重要作用。SERPINE2是一種分泌蛋白，是纖溶酶原、尿激酶和凝血酶的抑制劑。研究表明SERPINE2表達與腫瘤發生和侵襲有關[17]。SERPINE2在晚期腎細胞癌組織中高表達，在瘤旁組織和HK-2細胞系中低表達。SERPINE2降低可顯著抑制晚期腎細胞癌細胞的生長和侵襲，而SERPINE2過表達可顯著促進晚期腎細胞癌細胞在體外和體內的轉移[18]。另外，SERPINE2主要是凝血和纖溶相關基因，凝血和纖溶系統的異常激活可導致血栓形成和微循環障礙，從而進一步影響腎功能[19]。Gao等[20]研究表明KLF6通過與miR-223-3p啟動子結合抑制miR-223-3p并促進NLRP3，并激活NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路，從而加重細胞焦亡和膿毒性急性腎損傷。Piret等[21]發現腎近端小管細胞代謝改變在急性腎損傷中起關鍵作用。KLF6在小鼠急性腎損傷后期的腎近端小管細胞中被誘導，在細胞色素C氧化酶2合成的轉錄激活中起作用，KLF6的缺失保留編碼支鏈氨基酸（branched-chain"amino"acid，BCAA）基因表達，減輕急性腎損傷和最終的腎臟纖維化。相反，如果誘導小鼠KLF6過表達則抑制BCAA基因，這將造成腎損傷。此外，多種BCAA基因有KLF6結合位點，表明KLF6可能是BCAA分解代謝的轉錄調節因子。在脂肪酸氧化減少的腎損傷中，維持BCAA分解代謝可能提供一種替代的線粒體能量來源改善腎損傷。Zhang等[22]發現miR-181d-5p上調對腎臟急性腎缺血、再灌注損傷和因缺氧/復氧損傷的腎細胞產生保護性抗凋亡和抗炎作用，這些作用是通過靶向抑制KLF6實現的。另外，研究發現刺芒柄花素可顯著改善腎功能并減少缺血性急性腎損傷的炎癥反應，主要是通過抑制KLF6/STAT3介導的巨噬細胞實現的[23]。

本研究確定4個關鍵候選基因（ADI1、BNIP3L、KLF6和SERPINE2）可作為潛在的IgAN生物標志物。IgAN的組織病理學征象是含IgA的免疫復合物沉積到腎小球系膜引起的炎癥反應，最終導致腎小球腎炎和腎功能障礙。但介導這一過程的機制尚不清楚。白細胞浸潤是由組織釋放化學引誘劑分子引發的，并因內皮細胞的穩態失衡而增強[24]。Zhou等[25]在IgAN腎小球內皮細胞中發現表達大量與內皮功能障礙相關的基因（dn1、F8和Nostrin）及促炎細胞因子（Cx3cl1、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl16和Cxcl11）。另外，Watanabe等[26]先前已描述內皮附著分子1基因多態性與IgAN進展的相關性，這種關系靶向一種已確定的促炎細胞因子可能是治療IgAN的選擇。在腎小球內皮細胞中誘導主要組織相容性復合體Ⅰ類基因已被證明可促進T淋巴細胞向組織浸潤，這可能反映IgAN相關腎小球病變的相同功能。本研究對3個關鍵基因ADI1、BNIP3L、SERPINE2進行調控網絡分析和網絡構建，量化免疫、信號和代謝通路的相關性，結果表明IgAN與氧化磷酸化、活性氧通路和雷帕霉素靶蛋白復合物1（mechanistic"target"of"rapamycin"complex"1，mTORC1）信號通路密切相關。Zhang等[27]研究表明Sesns是一類高度保守的應激反應蛋白家族，由P53和叉頭轉錄因子通過轉錄調控，在體內表現出氧化還原酶活性，保護細胞免受氧化應激，目前已證明可減輕心臟、肝臟和腎臟的缺血再灌注損傷，其主要通過降低ROS水平和抑制mTORC1活性減輕應激反應。Wu等[28]研究發現多靶點酪氨酸激酶抑制劑卡博替尼和mTORC1/mTORC2抑制劑沙帕色替的聯合用藥可有效抑制腎細胞癌細胞外調節蛋白激酶信號通路磷酸化，從而降低下游轉錄因子及其參與細胞周期調控和凋亡的靶基因表達，這有效抑制腎細胞癌的進展。細胞內ROS水平的升高在慢性腎臟疾病的發病機制中起著重要作用[29]。細胞內ROS水平的增加可導致脂質、脫氧核糖核酸和蛋白質的氧化，從而導致細胞損傷。另一方面，ROS也是細胞信號傳遞中重要的次級信使。因此，正常的腎細胞功能依賴于適量的ROS。線粒體和NADPH氧化酶是腎臟中ROS的主要來源，但腎臟抗氧化系統如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶可抵消ROS介導的損傷。研究表明ROS-抗氧化系統的改變在慢性腎臟疾病中起主要作用[29-30]。由于ROS分子也是生理過程的一部分，很難精確定義其明確的致病機制。此外，ROS-抗氧化劑的水平可在許多腎臟疾病的不同病程中波動，包括IgAN。因此，為在最少不良反應下獲得最佳治療效果，關鍵是要選擇有益于疾病細胞的時間或細胞位置進行靶向ROS。重要的是，必須調節抗氧化劑或促氧化劑的劑量以保持健康細胞所必需的氧化還原信號。通過提高對氧化還原調控的理解，可給IgAN治療帶來巨大的進步。

本研究還分析了BNIP3L和SERPINE2的基因集，發現這兩個基因受MXI1、EMX2、PAX6、BHLHE41、EMX1GCM1、HSF1和HSF2轉錄因子共同機制的調控。本研究通過對ADI1、BNIP3L和SERPINE2進行反向預測，得到42個miRNA，共43對mRNA-miRNA關系對，這些轉錄因子和miRNA關系可能在IgAN的發展中發揮重要作用，并作為IgAN診斷和治療的潛在候選分子靶點。

綜上，本研究通過scRNA-seq揭示近端腎小管細胞在內的18個關鍵基因和基因特征在IgAN中的作用，為鑒定關鍵基因和通路提供參考。通過MR進一步分析ADI1、BNIP3L、SERPINE2與IgAN發生、發展的潛在因果關系，揭示其在免疫、信號和代謝通路中的相關性。這些發現可能對IgAN免疫抑制的治療及其基因作為疾病風險評估的生物標志物的效能提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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