關鍵詞 多肽親和標記；定點偶聯(lián)；抗體；元素標簽；單細胞-電感耦合等離子體質譜

近年來，基于電感耦合等離子體質譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）的生物分析方法在生物醫(yī)學研究領域得到了廣泛應用[1-11]。ICP-MS 可在痕量和超痕量濃度水平實現(xiàn)高靈敏的元素分析，具有多元素/同位素分析以及元素信號強度與化學形態(tài)無關等優(yōu)勢[12-13]。元素標簽的信號響應強度與每個元素標簽所攜帶的金屬原子數(shù)量成正比，而納米顆粒可一次性負載成千上萬的金屬原子，因此，納米顆粒是提高ICP-MS 生物測定靈敏度的有效載體之一，可實現(xiàn)對低豐度細胞標記物的高靈敏度定量分析檢測[14-18]。

抗體（Antibody），又稱免疫球蛋白G（Immunoglobulin， IgG），是一種由B 細胞產生的Y 形蛋白，能夠特異性識別并結合目標分子，是最常用的靶向遞送載體之一。IgG 由兩條重鏈（Heavy chain）和兩條輕鏈（Light chain）構成，表面含有多種溶劑可及性的反應性氨基酸，例如賴氨酸和半胱氨酸等可用于化學修飾，是一種常用的制備元素標簽的靶向分子[19-21]。

目前，已經發(fā)展了多種基于金屬螯合物、金屬聚合物和金屬納米粒子的抗體元素標簽，并被應用于生物分子特異性識別和高靈敏定量分析[22-23]。2001 年，張新榮研究組[24]首次報道了金屬穩(wěn)定同位素（Eu同位素）抗體元素標簽，并實現(xiàn)了對促甲狀腺激素（TSH）的ICP-MS 定量分析。2011 年， Bendall 等[25]使用抗體聚合物元素標簽，結合單細胞-質譜流式細胞技術，成功實現(xiàn)了對免疫細胞高達34 個參數(shù)的高通量分析。金屬穩(wěn)定同位素標記和絕對定量分析策略在高靈敏度檢測和多通道多參數(shù)生物分析等方面展現(xiàn)了巨大的應用潛力，為生物分子研究和臨床診斷帶來了技術革新[26]。

目前，抗體元素標簽多采用隨機偶聯(lián)的方式制備，即通過抗體表面廣泛的游離氨基或者巰基，與目標載體的反應官能團隨機碰撞，實現(xiàn)抗體與納米載體的共價偶聯(lián)[27-28]。這種隨機偶聯(lián)會導致抗體偶聯(lián)位點和偶聯(lián)比例的不可控。偶聯(lián)位點的不確定性可能會阻塞抗體的抗原結合位點，降低其特異性結合目標的能力，影響元素標簽的專一性和親和力；偶聯(lián)比例無法控制會導致制備的元素標簽無法進行準確的定量分析，增加元素標簽異質性，影響標簽的穩(wěn)定性。隨著Thiomab 工程、非天然氨基酸插入等技術的發(fā)展，研究者可采用這些技術實現(xiàn)抗體位點特異性偶聯(lián)[29-32]。但是，這些技術路線需要通過復雜的基因工程技術，將具有反應性的氨基酸引入到抗體的目標位點，技術要求高，生產過程周期長，并且價格昂貴。

多肽介導的親和標記技術是一種利用多肽作為橋梁，特異性地將標記物結合到目標生物分子（如蛋白質、核酸和細胞表面受體等）上的方法。Delano 等[33]通過建立環(huán)肽文庫，篩選出可與IgG 抗體的Fc 片段特異性結合的親和多肽Fc-Ⅲ（DCAWHLGELVWCT-NH2），并以2.7 ?的分辨率確定了Fc-Ⅲ肽與Fc 片段復合物的X 射線晶體結構，證明了Fc-Ⅲ肽與Fc 片段的CH2 和CH3 區(qū)域的交界面結合。在此基礎上， Kishimoto 等[34]結合之前的工作，通過空間結構分析，確定了序列為GPDCAYHKGELVWCTFH 的環(huán)肽的第8 位賴氨酸與抗體Fc 片段的K248 位賴氨酸距離僅為6.1 ?，并在該多肽的第8位賴氨酸的氨基上修飾了一條碳鏈長度為7.1 ?、末端帶有甲基丙烯酸N-琥珀酰亞胺酯（N-Hydroxysuccinimide ester，NHS）的Linker。在親和標記過程中，游離的親和多肽分子首先與抗體的CH2 和CH3 區(qū)域發(fā)生非共價特異性結合（圖1）。這種非共價的結合拉近了抗體上K248 的氨基和多肽上的NHS 酯之間的距離，從而使得氨基親和進攻羰基，形成酰胺鍵，實現(xiàn)抗體的位點特異性偶聯(lián)；然后，通過多肽上的馬來酰亞胺基團與巰基化DNA 偶聯(lián)，得到化學計量比為1∶1 的抗體-DNA 偶聯(lián)物；最后，通過IgG 與修飾了Eu 的MS2 蛋白納米顆粒[35-36]之間的DNA 雜交，實現(xiàn)元素標簽的精準組裝。這種元素標簽制備技術可實現(xiàn)抗體的位點特異性偶聯(lián)和化學計量比1∶1 的精確偶聯(lián)，無需對抗體進行工程改造，具備更強的通用性。本研究采用多肽介導的親和標記技術，實現(xiàn)了抗體與修飾稀土元素Eu 的MS2 衣殼蛋白納米顆粒定點偶聯(lián)，構建了一種高靈敏和高親和力的元素標簽，并利用單細胞-電感耦合等離子體質譜（Single cell inductively coupledplasma mass spectrometry， SC-ICP-MS）技術對此元素標簽的專一性和靈敏度進行了評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD高效液相色譜儀和LC-16P制備液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；XBridge Protein BEH尺寸排阻色譜柱（SEC， 7.8 mm×300 mm， 3.5 μm，美國Waters公司）；制備色譜柱C₁₈（10 mm×150 mm， 5 μm，日本Shimadzu 公司）；分析色譜柱C₁₈（4.6 mm×150 mm， 5 μm，日本Shimadzu 公司）；NexION?2000 ICPMass Spectrometer（美國PerkinElmer公司）；autoflex?maX基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDITOFMS，美國Bruker 公司）；JEM1400 透射電鏡（日本JEOL 公司）；PowerPac?基礎電泳儀電源、Mini-PROTEAN?Tetra 電泳槽（美國Bio-Rad 公司）；UVP GelStudio PLUS 多功能凝膠成像系統(tǒng)（德國AnalytikJena公司）；DYCP-31BN型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物公司）。

NexION Setup Solution 調諧液（TruQ?ms， 500 mL，美國PerkinElmer 公司）；四元素微球校準液（TruQ?ms， 100 mL，美國Fluidigm 公司）；西妥昔單抗（Cetuximab，廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心）；氯化銪（Ⅲ）六水合物（25 g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DOTA-馬來酰亞胺（100 mg，陜西新研博美生物科技有限公司）；三氟乙酸（TFA， 500 mL，上海麥克林生化科技股份有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF， 500 mL，國藥集團化學試劑有限公司）；超濾管（30和100 kDa， 0.5 mL，美國Millipore 公司）；雙琥珀酰亞胺戊二酸酯（Diosuccinimidyl glutamate， DSG， 50 mg，上海麥克林生化科技股份有限公司）；親和多肽（BP）、ssDNA、BCA 試劑盒、SDS 預制膠和Protein Ladder（生工生物工程（上海）股份有限公司）；尼龍篩網（300 目，孔徑約為48 μm，北京索萊寶科技股份有限公司）；非小細胞肺癌細胞系A549 和人乳腺癌細胞MDA-MB-231 來自American Type Culture Collection。

1.2 實驗方法

1.2.1 基于多肽親和標記策略的元素標簽IgG-MS2-Eu的制備

BP-NHS的制備BP的NHS修飾反應在DMF中進行。在終濃度為0.5 mmol/L的多肽中加入100倍當量的雙琥珀酰亞胺戊二酸酯（DSG），于37 ℃中振蕩反應5 h。采用制備色譜儀進行純化，流動相由A 相（TFA/H2O， 0.1%， V/V）和B 相（TFA/ACN， 0.1%， V/V）組成。以0.5 mL/min 的流速洗脫，洗脫程序為：0～5 min， 5% B，用于樣品的加載及系統(tǒng)平衡；5～15 min， 5%～90% B，實現(xiàn)目標多肽的逐步分離；15～20 min，90% B，用于快速洗脫未完全分離的雜質或高極性組分。

IgG-BP 的制備IgG 與BP 的親和偶聯(lián)反應在磷酸鹽緩沖溶液（PBS， pH=7.5）中進行。在終濃度為7 μmol/L 的西妥昔單抗中加入5 倍當量的親和多肽NHS-BP-MAL，室溫反應1 h。采用超濾管（MWCO=30 kDa）在4 ℃下超濾純化5 min，共超濾4次，得到抗體多肽偶聯(lián)物IgG-BP。

IgG-BP-ssDNA 的制備向反應終濃度為10 μmol/L 的IgG-BP 偶聯(lián)物中加入20 倍當量的ssDNA-SH，于4 ℃下過夜反應。采用超濾管（MWCO=30 kDa）濾除小分子，并將溶劑置換為4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）緩沖溶液，最終得到IgG-BP-ssDNA 偶聯(lián)物。

ssDNA-MS2-DOTA-Eu 的制備在噬菌體MS2 衣殼蛋白表面修飾DOTA-Eu 和ssDNA。首先將噬菌體MS2衣殼蛋白內外表面的氨基轉化為巰基，然后在噬菌體MS2 衣殼蛋白中加入20倍當量的2-亞氨基硫烷Traut′s 試劑，在5 mmol/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）和pH=8.0 的NaHCO3 溶液中室溫振蕩反應3h。采用超濾管（MWCO=100 kDa）純化，得到巰基化MS2 衣殼蛋白（MS2-SH）。

對MS2-SH 進行DNA 和Eu 元素的組裝在MS2-SH 中加入9 倍當量的ssDNA-MAL，于4 ℃過夜反應。然后繼續(xù)加入巰基50 倍當量的MAL-DOTA-Eu，振蕩反應2 h。采用超濾管（MWCO=100 kDa）超濾3 次，得到ssDNA-MS2-DOTA-Eu。

IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu 元素標簽的組裝 反應在50 mmol/L Hepes（pH=7.0）緩沖溶液中進行，將IgG-BP-ssDNA 與ssDNA-MS2-DOTA-Eu 偶聯(lián)物以2∶1 的比例混合，即可組裝得到IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu 元素標簽。

1.2.2 基于氨基隨機偶聯(lián)策略的元素標簽IgG-PEG-MS2-Eu的制備

通過抗體上的賴氨酸側鏈上的氨基或N 端的氨基實現(xiàn)偶聯(lián)。為了將西妥昔單抗與MS2-SH 偶聯(lián)，需要在西妥昔單抗上偶聯(lián)一端帶有馬來酰亞胺基團的連接子。西妥昔單抗和MAL-PEG-NHS 連接子通過NHS 酯與氨基發(fā)生酰胺化反應，生成IgG-PEG-MAL 偶聯(lián)物。此反應在含有10%（V/V）二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）的PBS 緩沖溶液中進行，在終濃度為3 μmol/L 的西妥昔單抗中加入4 倍當量的NHS-PEG-MAL，室溫下反應2 h。采用超濾管（MWCO=30 kDa）于4 ℃以4500 g 的離心力超濾純化5 min，共超濾4 次，得到抗體偶聯(lián)物。通過BCA 微量蛋白定量試劑盒定量分析抗體偶聯(lián)物的蛋白濃度。

通過巰基和馬來酰亞胺的邁克爾加成反應，將抗體偶聯(lián)物與MS2-SH 偶聯(lián)，并在標簽上修飾Eu，制備lgG-PEG-MS2-DOTA-Eu 元素標簽，此反應在10 mmol/L Hepes 緩沖溶液（pH=7.0）中進行。在終濃度為2 μmol/L 的抗體偶聯(lián)物中加入2 倍當量的巰基化MS2，室溫反應2 h，加入5 倍巰基當量的MALDOTA-Eu，室溫反應2 h。采用超濾管（MWCO=100 kDa）于4 ℃以3500 g離心超濾純化3 min，共超濾4 次，得到元素標簽IgG-PEG-MS2-Eu。

1.2.3 元素標簽中Eu 含量的定量分析

采用柱后同位素稀釋法測定元素標簽中Eu 的總量[37-38]。在每次測定前，采用含有1 μg/L 的Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb 和U 的調諧液對ICP-MS 進行調諧，以達到最大靈敏度。在測試樣品前，使用2% HNO3 溶液沖洗ICP-MS 的霧化室5 min。搭建尺寸排阻色譜/非形態(tài)特異同位素稀釋電感耦合等離子體質譜法（Size exclusion chromatography/species-unspecific isotope dilution inductively coupled plasma massspectrometry， SEC/SUID-ICP-MS）平臺，以三通接口連接高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）的流動相出口和注射泵上的注射器口，使得兩股液流混合，共同進入ICP-MS 進行檢測。通過SEC 柱分離蛋白樣品，色譜流速為0.3 mL/min，注射泵以0.06 mL/min 的流速注入1 μg/L 153Eu 標準品溶液。通過色譜和質譜的信息對元素標簽中Eu 的含量進行絕對定量分析。

1.2.4 元素標簽的單細胞ICP-MS 分析[30]

貼壁細胞用胰蛋白酶處理后收集，懸浮細胞通過離心收集，然后采用預冷的Hepes 溶液置換細胞培養(yǎng)液。在每組100 μL 的2×10⁶ 個細胞中，加入不同濃度元素標簽，在4 ℃下孵育30 min，期間將樣品緩慢旋轉混勻。采用預冷的Hepes 緩沖溶液洗滌3 次，在室溫下加入4%通用多聚甲醛固定液并放置15 min以固定細胞。固定操作結束后，繼續(xù)使用預冷的Hepes 緩沖溶液洗滌3 次，除去多余的元素標簽。細胞樣品測試前通過300目（孔徑48 μm）的尼龍篩網過濾，防止粘連的細胞進入裝置堵塞管路。采用SC-ICPMS對細胞樣品進行測試。

2 結果與討論

2.1 IgG-MS2-Eu 元素標簽的制備及表征

2.1.1 BP-NHS 的制備及表征

BP 的NHS修飾反應如圖2A 所示， BP的第8位賴氨酸與DSG發(fā)生酰胺縮合，引入NHS 官能團，用于后續(xù)與抗體的親和交聯(lián)反應。采用HPLC以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）對BP-NHS 產物進行了純化和表征（圖2B和2C），測得分子量（[M+H]+）為2572.1290 Da，與理論分子量結果吻合，說明成功實現(xiàn)了多肽的NHS修飾（1∶1），得到目標物BP-NHS。

2.1.2 IgG-BP 的制備及表征

利用多肽配體對單克隆抗體的親和性，實現(xiàn)抗體與目標多肽之間的共價結合，最終完成對抗體Fc 片段的定向修飾，具體的反應過程如圖3A 所示。使用MALDI-TOF-MS 對產物進行表征分析，結果如圖3B所示。抗體多肽偶聯(lián)物（IgG-BP）的分子量為153820.6 Da，而IgG 的分子量為151409.3 Da，表明西妥昔單抗均與BP-NHS 成功偶聯(lián)，并且平均每個單克隆抗體上偶聯(lián)了一條目標多肽。利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對產物進行分析，如圖3C 所示，隨著BP-NHS 加入劑量增加，抗體的重鏈逐漸上移，輕鏈無反應，表明此親和標記反應僅發(fā)生在抗體的重鏈位置，與預期相符。

2.1.3 IgG-BP-ssDNA的制備及表征

IgG-BP 與巰基化單鏈DNA（ssDNA-SH）的反應過程如圖4A 所示， IgG-BP 上的親和肽C 端的馬來酰亞胺官能團與ssDNA-SH 反應形成穩(wěn)定的硫醚鍵，實現(xiàn)IgG-BP 和ssDNA-SH 的共價偶聯(lián)。如圖4B 所示，完整的IgG-BP-ssDNA 條帶存在明顯上移，證實抗體與DNA 成功結合。對產物IgG-BP-ssDNA 進行還原處理，結果如圖4C 所示，抗體重鏈的條帶出現(xiàn)上移，而輕鏈無變化，證實ssDNA-SH 與抗體的共價反應僅發(fā)生在抗體的重鏈部位，而且每個抗體上僅偶聯(lián)一條ssDNA，證明發(fā)展的親和介導的位點特異性偶聯(lián)技術可實現(xiàn)對抗體的化學計量比修飾。

2.1.4 ssDNA-MS2-DOTA-Eu的制備及表征

利用Traut′s 試劑對噬菌體MS2 衣殼蛋白納米顆粒表面的賴氨酸殘基進行化學改造[36]，將噬菌體MS2 衣殼蛋白中的天然氨基轉化為巰基，再通過巰基與馬來酰亞胺的反應分別在MS2 的表面修飾ssDNA 及DOTA-Eu，反應路線圖如圖5A 所示。為了監(jiān)測反應過程中MS2 納米顆粒的完整性，使用透射電鏡對產物進行表征，結果如圖5B 所示，經由多步偶聯(lián)反應制得的元素標簽仍保持完整形態(tài)，具有良好的穩(wěn)定性，元素標簽顆粒尺寸均一，并且分散性良好。采用MALDI-TOF-MS 對MS2-SH 表征，結果如圖5C 所示， MS2-SH 亞基分子量約為14349 Da，而噬菌體MS2 衣殼蛋白亞基分子量為13760 Da，此結果表明MS2 表面的氨基被成功轉換成游離巰基，并且平均每個MS2 亞基上修飾6 個巰基。通過麥克加成反應實現(xiàn)MS2-SH 表面的DNA 偶聯(lián)，利用SDS-PAGE 對樣品進行分析。如圖5D 所示，隨著ssDNA-MAL劑量增加， ssDNA-MS2 的條帶逐漸加深，表明MS2-SH 與ssDNA-MAL 成功偶聯(lián)。

2.1.5 IgG-BP-DNA-MS2-DOTA-Eu（IgG-MS2-Eu）標簽的制備及表征

將上述純化后的IgG-BP-ssDNA 和ssDNA-MS2-DOTA-Eu 在50 mmol/L Hepes 緩沖溶液中混勻，抗體與MS2 在DNA 的雜交作用下實現(xiàn)精準組裝，反應過程如圖6A 所示。采用瓊脂糖凝膠電泳對反應過程進行檢測，結果如圖6B 所示，反應物條帶消失，并且出現(xiàn)了全新的條帶，表明IgG-BP-ssDNA 和MS2-ssDNA 經由單鏈DNA 的堿基互補配對雜交成功。采用柱后同位素稀釋法對元素標簽IgG-MS2-Eu 的Eu含量進行定量分析。將元素標簽稀釋104 倍，采用SEC/SUID-ICP-MS 對樣品中Eu 進行定量檢測，結果見圖6C。計算結果表明，平均每個MS2 顆粒上攜帶了800 個Eu 原子。

為獲得最佳標記細胞的元素標簽濃度，考察了不同濃度的IgG-MS2-Eu 標簽對A549 肺癌細胞的標記效果，建立了標簽濃度與細胞信號強度的關系。如圖6D 所示，隨著元素標簽孵育濃度增加，細胞的Eu信號強度逐漸增強。當元素標簽的濃度為40 nmol/L 時， Eu 的檢測值達到最大。因此，最佳的元素標簽孵育濃度為40 nmol/L。

2.2 IgG-BP-DNA-MS2-Eu 的SC-ICP-MS 分析

為了檢測元素標簽IgG-BP-DNA-MS2-Eu 在細胞標記實驗中的靶向性能以及評價其非特異性吸附情況，選擇A549 細胞（表皮生長因子受體（EGFR）陽性）和MDA-MB-231 細胞（EGFR 陰性）作為對照樣品，利用SC-ICP-MS 進行單細胞分析，并通過產生的元素單細胞信號響應強度進行對比分析。

如圖7A 所示，未標記A549 細胞沒有Eu 元素的信號，說明A549 細胞中Eu 元素背景很低。如圖7B所示， A549 細胞與MS2-DOTA-Eu 孵育后，僅存在微弱的脈沖信號，說明元素標簽對A549 細胞沒有非特異性吸附。如圖7C 所示，在IgG-BP-DNA-MS2-Eu 標記A549 細胞30 min 后，得到很強的Eu 元素信號響應，說明元素標簽具有高靈敏性，并且標記作用來自標簽與A549細胞表面EGFR 抗原之間的特異性相互作用，表明IgG-BP-DNA-MS2-Eu 能夠與A549 細胞特異性結合，并且這種結合能力來源于西妥昔單抗的靶向特異性。

以低表達EGFR 的MDA-MB-231 細胞作為陰性對照，測試結果見圖7D～7F。如圖7D 所示，未標記的MDA-MB-231 細胞沒有Eu 元素的脈沖信號，說明MDA-MB-231 細胞中Eu 元素背景很低。如圖7E 所示，MS2-DOTA-Eu 孵育后的MDA-MB-231 細胞僅存在少量脈沖信號，說明元素標簽對MDA-MB-231 細胞的非特異性吸附也很少。利用相同濃度的元素標簽IgG-BP-DNA-MS2-Eu 進行標記實驗后， MDA-MB-231的信號強度遠低于A549 細胞。此結果再次說明標記作用是來自標簽與A549 細胞表面EGFR 抗原之間的特異性相互作用。以上結果表明，親和標記技術制備得到的IgG-BP-DNA-MS2-Eu 元素標簽能夠與目標細胞表面的EGFR 特異性結合，并具有低的非特異性吸附和高靈敏度的優(yōu)勢。

2.3 基于隨機偶聯(lián)技術制備的元素標簽的SC-ICP-MS分析

為比較親和標記技術和通過隨機偶聯(lián)技術制備的元素標簽的差異，利用NHS-PEG-MAL 將IgG 抗體的氨基與MS2-SH 的巰基通過隨機偶聯(lián)，合成了IgG-PEG-MS2-Eu 標簽（圖8A）。采用相同濃度的元素標簽對A549 細胞進行標記和SC-ICP-MS 分析，結果如圖8B 和圖8C 所示，在A549 單細胞檢測分析中，使用基于隨機偶聯(lián)方法得到的IgG-PEG-MS2-Eu 元素標簽，其細胞上幾乎沒有Eu 的信號；而基于親和標記制備的元素標簽Eu 信號良好，說明采用隨機偶聯(lián)得到的元素標簽幾乎未靶向定位到細胞表面EGFR 受體。這可能是因為NHS-PEG-MAL 與抗體的隨機偶聯(lián)發(fā)生在抗體輕鏈的抗原識別區(qū)，導致標簽無法特異性識別細胞表面抗原，進而無法實現(xiàn)對細胞的標記和定量分析；也可能是在反應的過程中，多個抗體和多個巰基化MS2 之間發(fā)生交聯(lián)，阻礙了抗體與抗原的特異性識別與結合，最終導致標簽無法正常標記細胞。

3 結論

建立了一種通過多肽介導的親和標記策略，實現(xiàn)了抗體的定點偶聯(lián)與噬菌體MS2 衣殼蛋白納米顆粒元素標簽的組裝。此親和標記策略避免了隨機偶聯(lián)造成的元素標簽的異質性和無法正常標記的問題，制備得到的抗體納米元素標簽具有偶聯(lián)位點精確、化學計量比可控、專一性好以及靈敏度高等優(yōu)勢，已成功用于癌細胞表面生物標志物的高靈敏度、高特異性單細胞分析。此外，該策略無需對抗體進行基因工程改造，可用于天然抗體的偶聯(lián)，具有很好的普適性；可用于快速精準地合成不同類型天然抗體元素標簽，通過對不同細胞生物標志物的靶向標記檢測，實現(xiàn)對低豐度蛋白的定性和定量分析，以及對疾病的診斷和不同類型癌癥的診斷、分型和預后分析。然而，該策略僅在IgG1 抗體上驗證了其可行性，存在偶聯(lián)步驟較復雜的問題。在此基礎上，未來可研究蛋白納米顆粒與不同類型的抗體偶聯(lián)，簡化偶聯(lián)步驟，實現(xiàn)模塊化組裝，形成標準的純化工藝，發(fā)展成為質譜流式細胞儀的配套試劑盒。此外，基于此偶聯(lián)策略，可在MS2 蛋白納米顆粒上偶聯(lián)/組裝藥物，構建抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugate， ADC），用于藥物的靶向遞送。