高效液相色譜法測(cè)定烘焙食品中肉桂醛的含量

摘 要：本文建立高效液相色譜法測(cè)定烘焙食品中肉桂醛含量的方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取30 min，中性氧化鋁固相吸附劑凈化后，以甲醇-水（45∶55，V/V）為流動(dòng)相，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為291 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，肉桂醛濃度在0～5.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，方法檢出限為0.1 mg·kg-1，加標(biāo)回收率為82.5%～91.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.1%。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于烘焙食品中肉桂醛含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：烘焙食品；肉桂醛；高效液相色譜法

Determination of Cinnamaldehyde Content in Baked Foods by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Xiangmei1， CHEN Rimeng1*， HUANG He2

（1.Zhanjiang Institute for Food Inspection and Drug Control， Zhanjiang 524000， China;

2.Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524000， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for the determination of cinnamaldehyde in baked goods was developed. The samples were extracted by acetonitrile ultrasonic for 30 min， purified by neutral alumina solid phase adsorbent， separated by methanol-water （45∶55， V/V） as mobile phase， and determined by ZORBAX Eclipse Plus C18 column at a column temperature of 35 ℃ and detection wavelength of 291 nm. The results showed that the concentration of cinnamaldehyde was in the range of 0 μg·mL-1 to 5.0 μg·mL-1， and the correlation coefficient was 0.999 5. The detection limit was 0.1 mg·kg-1， the recovery rate was 82.5% to 91.8%， and the relative standard deviation was 3.0% to 8.1%. The method is simple， accurate and reliable， and is suitable for the determination of cinnamaldehyde in baked goods.

Keywords： baked foods; cinnamaldehyde; high performance liquid chromatography

肉桂醛又稱桂醛，是一種醛類有機(jī)化合物，為淡黃色黏稠狀液體，氣味較為特殊，存在于肉桂等植物體內(nèi)[1]。肉桂醛具有增香及防腐保鮮效果，我國(guó)等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已將其作為防腐劑、增香調(diào)味料運(yùn)用于方便面、面包、蛋糕及糕點(diǎn)等食品領(lǐng)域[2-3]。美國(guó)香料生產(chǎn)者協(xié)會(huì)（Flavor and Extract Manufacturers Association of the United States，F(xiàn)EMA）對(duì)肉桂醛的安全性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，認(rèn)為其作為食品添加劑沒(méi)有安全風(fēng)險(xiǎn)[4]。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760—2014）中規(guī)定，肉桂醛作為防腐劑可在經(jīng)表面處理的鮮水果中按生產(chǎn)需要適當(dāng)使用，但殘留量應(yīng)小于0.3 mg·kg-1[5]。

目前，已有較多研究報(bào)道分別采用紫外分光光度計(jì)法、氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法、高效液相色譜法測(cè)定肉桂、飼料香味劑、百草油、桂油生物催化反應(yīng)中肉桂醛的含量[6-10]。然而，對(duì)于烘焙食品中肉桂醛的檢測(cè)方法還未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，隨著食品安全及質(zhì)量問(wèn)題的關(guān)注度不斷提升，食品添加劑的安全性監(jiān)控工作也在不斷加強(qiáng)，因此建立一種烘焙食品中肉桂醛含量的測(cè)定方法具有重要意義。

本文以烘焙食品為基質(zhì)，對(duì)樣品前處理及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種高效液相色譜法測(cè)定烘焙食品中肉桂醛含量的方法，以促進(jìn)對(duì)烘焙食品中肉桂醛殘留量的監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月餅，廣東金九餅業(yè)有限公司；薯片，百事食品（中國(guó)）有限公司；威化餅干，廣州市麗芝士食品有限公司；蛋糕，豪士（福建）食品有限公司。

肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈及乙酸乙酯（色譜純），美國(guó)Honeywell公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，粒徑為40～63 μm）、C18（粒徑為40～63 μm）、中性氧化鋁（Al-N，120～400目），上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030C 3D高效液相色譜儀，日本島津公司；Auto EVA-60全自動(dòng)平行濃縮儀，?？苾x器（廈門(mén)）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取0.051 0 g肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g）至50 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容，得到濃度為1 000 μg·mL-1的肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。于冰箱4 ℃避光保存，備用。

用無(wú)水乙醇將1 000 μg·mL-1肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為0 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1及5.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，取1 mL經(jīng)0.2 μm有機(jī)膜過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶上機(jī)測(cè)定，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

將樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎均勻。稱取2.5 g粉碎后的樣品（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入25 mL乙腈，渦旋混勻，水浴超聲提取30 min后旋渦振蕩10 min，在11 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上層乙腈提取液轉(zhuǎn)移至離心管中并用乙腈定容至25 mL。

準(zhǔn)確稱取0.625 g中性氧化鋁加入上述乙腈提取液中，振蕩10 min，在11 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心5 min，取10 mL乙腈提取液置于全自動(dòng)平行濃縮儀中，在40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈復(fù)溶，渦旋混勻，經(jīng)0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=45∶55（V/V）；洗脫方式：等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：291 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選擇二極管陣列檢測(cè)器對(duì)20 μg·mL-1肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～800 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較對(duì)應(yīng)的紫外光譜，尋找合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果表明，流動(dòng)相為甲醇與水時(shí)，肉桂醛在波長(zhǎng)為291 nm處有最大吸收峰，且干擾少，故選擇波長(zhǎng)為291 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 色譜柱的選擇

為獲得最佳色譜分離效果及分析時(shí)間，分別以甲醇、乙醇為標(biāo)液溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以乙腈-水為流動(dòng)相，對(duì)比Inertsil ODS-SP柱和ZORBAX Eclipse Plus C18柱的檢測(cè)效果。結(jié)果表明，Inertsil ODS-SP柱保留時(shí)間明顯長(zhǎng)于ZORBAX Eclipse Plus C18柱。以甲醇溶解肉桂醛配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，采用Inertsil ODS-SP柱出現(xiàn)拖尾峰現(xiàn)象，且拖尾程度較大，而采用ZORBAX Eclipse Plus C18柱峰形良好。以乙醇溶解肉桂醛配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，兩者的色譜圖的峰形都良好，但使用ZORBAX Eclipse Plus C18柱峰面積比更大。因此，選用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇

為確保肉桂醛與樣品其他添加劑的有效分離，向流動(dòng)相中加入0.2%的冰醋酸。分別以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%冰醋酸以及甲醇-0.2%冰醋酸為流動(dòng)相，采用等度洗脫，進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖峰形較好，未出現(xiàn)分解產(chǎn)物的色譜峰，且兩側(cè)無(wú)雜峰，但峰面積較??；以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖峰形良好，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分解產(chǎn)物的色譜峰，出峰時(shí)間短，峰面積較大；以乙腈-0.2%冰醋酸以及甲醇-0.2%冰醋酸為流動(dòng)相時(shí)，均出現(xiàn)拖尾峰和雜峰現(xiàn)象，效果較差。因此，選用甲醇-水作為流動(dòng)相。

2.1.4 柱溫的選擇

柱溫能夠影響分離效能和分析速度。適當(dāng)提高柱溫，可使溶劑黏度降低，提高溶劑在固定相中的滲透性，從而縮短保留時(shí)間，增加柱效[11]。分別設(shè)置柱溫為25 ℃、30 ℃、35 ℃進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)峰形均良好，但在柱溫為35 ℃時(shí)，肉桂醛保留時(shí)間有所提前，且分離效果較好，峰面積較大。因此，選擇柱溫為35 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.5 流動(dòng)相比例的優(yōu)化

在反相色譜二元流動(dòng)相體系中，溶質(zhì)的保留因子隨流動(dòng)相中有機(jī)相比例的增加而減少，而保留時(shí)間主要取決于溶質(zhì)與色譜柱固定相、流動(dòng)相之間的相互作用[12]。分別設(shè)置甲醇與水的比例（V/V）為45∶55、46∶54、48∶52、50∶50及55∶45進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著甲醇比例的提高，柱壓升高，保留時(shí)間提前，分離度逐漸縮小，雜峰與肉桂醛色譜的間隔縮小。5種比例流動(dòng)相下肉桂醛峰形皆良好，峰形均勻?qū)ΨQ，峰面積差別不大。當(dāng)甲醇與水的比例為45∶55（V/V）時(shí)，保留時(shí)間適宜，峰形良好，分離效果較好，也可避免柱壓過(guò)高加大對(duì)色譜柱的損耗，故選擇甲醇∶水=45∶55（V/V）作為流動(dòng)相。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

目前，肉桂醛提取方法主要有超聲波提取法、均質(zhì)提取法、微波提取法等[13]。其中，超聲波提取法具有提取簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、適用性廣的優(yōu)勢(shì)，因此本研究選用超聲波提取法提取烘焙食品中的肉桂醛。常用肉桂醛提取劑有甲醇、乙醇、乙酸乙酯及乙腈等[10，14-16]。通過(guò)對(duì)比不同提取溶劑對(duì)肉桂醛的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇、無(wú)水乙醇提取效果較差；乙酸乙酯提取峰形前傾，響應(yīng)值過(guò)低；乙腈提取峰形良好，能夠較好地分離雜峰，且可減少雜質(zhì)干擾。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間的確定

于空白月餅樣品中加入肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，乙腈為提取溶劑，超聲波分別提取10 min、20 min、30 min、35 min及40 min后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，在提取時(shí)間為10～30 min時(shí)，回收率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；當(dāng)超聲波提取30 min時(shí)，回收率達(dá)到最大值（100.1%）；在提取時(shí)間為35 min和40 min時(shí)，回收率急劇下降，提取40 min未檢測(cè)到目標(biāo)峰，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，肉桂醛由于溶質(zhì)分子劇烈碰撞而發(fā)生氧化反應(yīng)或聚合反應(yīng)造成損耗[17]。因此，確定超聲波適宜提取時(shí)間為30 min。

2.2.3 凈化方式的選擇

分散固相萃取法較固相萃取法，凈化過(guò)程無(wú)須預(yù)淋洗、淋洗、洗脫等繁雜過(guò)程，極大地縮短了分析時(shí)間。常用的分散固相吸附劑有N-丙基乙二胺（PSA）、C18、中性氧化鋁（Al-N）等[18]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同固相萃取劑[25 mg （PSA∶C18=1∶1）、25 mg C18、50 mg C18、25 mg中性氧化鋁]對(duì)肉桂醛回收率的影響。結(jié)果顯示，使用4種不同固相萃取劑提取烘焙食品中肉桂醛的回收率分別為3.7%、90.3%、91.2%及98.3%。其中，中性氧化鋁固相吸附劑凈化肉桂醛回收率最高，為98.3%。凈化后目標(biāo)化合物附近無(wú)干擾雜峰，基質(zhì)效應(yīng)得到明顯抑制，且出峰前基線較平穩(wěn)。因此，選擇中性氧化鋁固相吸附劑（每1 mL提取液加入25 mg）進(jìn)行凈化。

2.3 方法線性范圍及檢出限

按1.3.1項(xiàng)方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為y=105 532x-2 732.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5，表明肉桂醛濃度在0～5.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

取空白樣品按測(cè)定方法上機(jī)分析，將色譜圖中肉桂醛保留時(shí)間得出的基線噪音與標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行比較，以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行計(jì)算[19]，得出方法檢出限為0.1 mg·kg-1。

2.4 回收率及精密度

以月餅、薯片、威化餅干、蛋糕為基質(zhì)，按照0.1 mg·kg-1、0.3 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1這4個(gè)水平加入相應(yīng)的肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次，按照優(yōu)化所得的色譜條件及樣品前處理?xiàng)l件對(duì)樣品進(jìn)行處理，上機(jī)測(cè)定并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，4個(gè)樣品的平均加標(biāo)回收率為82.5%～91.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.1%，結(jié)果滿足預(yù)期。

3 結(jié)論

本文通過(guò)優(yōu)化樣品前處理及色譜條件，建立了一種高效液相色譜法測(cè)定烘焙食品中肉桂醛含量的方法。結(jié)果表明，肉桂醛濃度在0～5.0 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，檢出限為0.1 mg·kg-1，平均回收率為82.5%～91.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～8.1%。該方法前處理操作簡(jiǎn)單、分離凈化效果好、回收率高、重現(xiàn)性好，適用于烘焙食品中肉桂醛含量的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]孫寶國(guó)，何堅(jiān).香料化學(xué)與工藝學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[2]周明，陳征義，申書(shū)婷.肉桂醛的研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2015，19（1）：1-5.

[3]曾少甫，胡長(zhǎng)鷹，匡衡峰，等.肉桂醛在殼聚糖復(fù)合活性包裝膜中的釋放及在鮮豬肉冷藏中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2018，39（9）：182-189.

[4]SMITH R L，ADAMS T B，DOULL J，et al.Safety assessment of allylalkoxybenzene derivatives used as flavouring substances-methyl eugenol and estragole[J].Food and Chemical Toxicology，2002，40（7）：851-870.

[5]國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 2760—2014[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[6]暴瑋，劉雄民，馬麗，等.紫外分光光度法測(cè)定肉桂醛、苯甲醛和苯甲酸[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)），2009，45（6）：687-689.

[7]李會(huì)榮，宮玲玲，盛清凱.利用氣相色譜法同步測(cè)定飼料香味劑中肉桂醛、香芹酚的研究[J].飼料與畜牧，2013（9）：36-38.

[8]曾惠芳，黃耀海，李湘力，等.百草油中薄荷腦、肉桂醛、丁香酚的含量測(cè)定[J].中成藥，2007，29（4）：558-560.

[9]楊希國(guó)，李永才.高效液相色譜法測(cè)定飼料香味劑中肉桂醛的研究[J].飼料工業(yè)，2010，31（11）：46-47.

[10]韋一萍，張戈.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桂油生物催化反應(yīng)中肉桂醇、苯甲醛、苯乙酮、肉桂酸和肉桂醛[J].應(yīng)用化工，2011，40（11）：2034-2037.

[11]成洪達(dá)，邢占芬，李彤，等.溫度對(duì)高效液相色譜分離選擇性的影響[J].福建分析測(cè)試，2009，18（1）：16-19.

[12]蔡瑋紅，冼燕萍，羅海英，等.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定焙烤食品中的丙烯酰胺、4-甲基咪唑與5-羥甲基糠醛[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（2）：249-254.

[13]孫鳳蕊.肉桂油提取工藝的研究及優(yōu)化[D].青島：青島科技大學(xué)，2019.

[14]曹愛(ài)青.肉桂醛在肉牛生產(chǎn)上的應(yīng)用研究[J].飼料廣角，2012（16）：37-38.

[15]FRIEDMAN M，KOZUKUE N，HARDEN L A.Cinnamaldehyde content in foods determined by gas chromatography mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（11）：5702-5709.

[16]羅輝泰，謝夢(mèng)婷，黃曉蘭，等.分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定畜禽肉中63種獸藥殘留[J].色譜，2015，33（4）：354-362.

[17]張?jiān)魄?，孟祥龍，唐秀，?進(jìn)口植物油脂中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38（24）：165-169.

[18]鄭文慧，葉江雷，王秀彬，等.分散固相萃取法在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中應(yīng)用的進(jìn)展[J].分析儀器，2011（4）：23-27.

[19]張力揚(yáng)，李楊玲，彭曉龍，等.注射液用溴化丁基膠塞中肉桂醛的含量測(cè)定及遷移研究[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息，2018，24（9）：53-55.

作者簡(jiǎn)介：黃湘湄（1995—），女，廣東湛江人，碩士，助理工程師。研究方向：食品分析與檢驗(yàn)。

通信作者：陳日檬（1979—），男，廣東湛江人，碩士，副主任藥師。研究方向：藥品化妝品質(zhì)量安全控制。E-mail： ZJSYS2014@126.com。