高效液相色譜法測定乳飲料中紐甜含量

摘 要：在《食品安全國家標準 食品中紐甜的測定》（GB 5009.247—2016）的基礎上優(yōu)化樣品前處理條件和色譜參數(shù)，建立高效液相色譜法測定乳飲料中紐甜的方法。結果顯示，在0～20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)方法線性關系良好，相關系數(shù)R2=0.999 9，加標回收率為99.0%～105.5%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）≤1.46%。可見方法精密度及準確度高，適用于乳飲料中紐甜的測定。

關鍵詞：紐甜；方法優(yōu)化；高效液相色譜法

Determination of Neotame Content in Milk Beverages by HPLC

LI Lei， XIE Meng， FANG Juan， ZHANG Hao， MA Houyang， WU Jianxun

（Mengniu Dairy Products Wuhan Co.， Ltd.， Wuhan 430040， China）

Abstract： By optimizing sample pretreatment conditions and chromatographic parameters based on GB 5009.247—2016， a method for the determination of neotame in milk beverages by high performance liquid chromatography was established. The results showed that the method had a good linear relationship in the concentration range of 0～20 μg·mL-1， with a correlation coefficient of R2=0.999 9， a spike recovery rate of 99.0%～105.5%， and the relative standard deviation （RSD）≤1.46%. It can be seen that the method has high precision and accuracy and is suitable for the determination of neotame in milk beverages.

Keywords： neotame; method optimization; high performance liquid chromatography

近年來，隨著全球肥胖率的顯著上升，人們對人工甜味劑（Artificial Sweeteners，AS）等糖替代品的需求大幅上升。紐甜作為AS中一種幾乎不含熱量的甜味劑，憑借其在人體內(nèi)快速代謝的特點，被廣泛應用于飲料、乳制品、甜點、烘焙糕點等食品加工領域。然而，人工甜味劑的安全性卻始終存在爭議，國際食品法典委員會以及中國、美國、日本也均對紐甜有嚴格的限量要求[1]。因此，在生產(chǎn)過程中對紐甜添加量進行控制是必不可少的，紐甜含量檢測也成為各大食品相關實驗室需要具備的能力[2-4]。《食品安全國家標準 食品中紐甜的測定》（GB 5009.247—2016）[5]為食品中紐甜檢測的通用方法，但針對不同領域、不同基質(zhì)，該方法還有進一步優(yōu)化的空間。本文針對乳飲料領域進一步優(yōu)化該方法，旨在減小干擾，提高紐甜含量檢測的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜儀（VWD檢測器，配Chromeleon軟件），Thermo；XP205DR分析天平（精度為0.000 1 g），METTLER；SB-4200DT超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge"23R離心機，Heal Force；MS3 DS25旋渦振蕩器，IKA；N-EVAP 112氮吹儀，Organomation；Millipore Synergy超純水機。Agela Venusil XPB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；0.45 μm濾膜（有機系）；乙腈（色譜純），Cleman；辛烷磺酸鈉（色譜純），F(xiàn)isher；磷酸（優(yōu)級純），甲酸、甲醇、三乙胺（色譜純），天津福晨化學試劑有限公司；紐甜標準物質(zhì)（純度99.2%），壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑配制

混合提取液：吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，用超純水定容至1 000 mL。

離子對緩沖液：稱取2.00 g辛烷磺酸鈉，用約500 mL超純水溶解后，加入1.0 mL磷酸，用超純水定容至1 000 mL。

1.2.2 標準品配制

標準儲備液：準確稱取0.100 0 g紐甜標準品，加混合提取液溶解并定容至100 mL，此溶液紐甜含量為1 000 μg·mL-1。

標準中間液：準確吸取1.00 mL紐甜標準儲備液，加混合提取液定容至10 mL，此溶液紐甜含量為100 μg·mL-1。

標準系列工作液：分別吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和2.0 mL紐甜標準中間液，用混合提取液定容至10 mL，此系列溶液紐甜含量分別為0 μg·mL-1、2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1。

1.2.3 樣品前處理

準確稱取10.0 g試樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL混合提取液，旋渦混勻。超聲15 min，用混合提取液定容至刻度，混勻后移至離心管，8 500 r·min-1離心10 min，濾紙過濾；吸取10.0 mL的濾液加入用5 mL甲醇、10 mL水活化后的C18固相萃取柱，待濾液完全流出后，用5 mL的混合提取液淋洗萃取柱，棄去全部流出液，加入5 mL甲醇洗脫至試管中；洗脫液40 ℃氮氣吹干，加入2.0 mL混合提取液定容，漩渦振蕩60 s，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機分析。

1.2.4 儀器參數(shù)

色譜柱：Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈∶離子對緩沖液=43∶57；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：218 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1 調(diào)整進樣體積

GB 5009.247—2016中進樣體積為50 μL，在實際檢測中，由于進樣量過大，目標峰會出現(xiàn)較為嚴重的峰展寬和拖尾情況，影響定性及定量的準確性。本實驗室對多個進樣體積進行測試發(fā)現(xiàn)，當進樣體積為20 μL時，大部分曲線點具有較好的峰形；進樣量繼續(xù)下調(diào)后，目標峰會出現(xiàn)前延，且響應值過小，不滿足檢測需求。因此，將進樣體積調(diào)整為20 μL，調(diào)整后各曲線點不對稱因子得到明顯改善（不對稱因子=1時，峰形最佳），具體結果如表1所示。

2.1.2 調(diào)整曲線范圍

GB 5009.247—2016中曲線范圍為0～100 μg·mL-1，但由于50 μg·mL-1、100 μg·mL-1含量較大，在調(diào)整進樣體積后，仍無法達到理想的峰形，故將曲線范圍調(diào)整為0～20 μg·mL-1。調(diào)整后各曲線點峰形良好，且具有更好的定性穩(wěn)定性和曲線線性（表2）。對于高值樣品，可以稀釋至0～20 μg·mL-1后檢測。

2.1.3 調(diào)整流動相比例

GB 5009.247—2016中流動相條件為乙腈和離子對緩沖液梯度洗脫，在實際檢測中，乳飲料樣品在目標峰處存在大量基質(zhì)干擾。經(jīng)本實驗室多次調(diào)節(jié)，當流動相設置為乙腈∶離子對緩沖液=43∶57時，目標峰處基線平穩(wěn)，無雜峰干擾，使定性更為準確。流動相調(diào)整前后對比如圖1所示。

2.2 方法驗證

2.2.1 校準曲線

將紐甜標準系列工作液依次上機檢測，以標準工作液的濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。當紐甜標準工作液濃度在0～20 μg·mL-1時，回歸方程為y=0.214 7x+0.018 2，相關系數(shù)為R2=0.999 9，紐甜線性關系良好。

2.2.2 加標回收率測定

取兩類乳飲料產(chǎn)品，稱取10 g試樣后，分別添加0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL紐甜標準中間液，加標濃度分別為2.00 mg·kg-1、3.00 mg·kg-1、4.00 mg·kg-1、5.00 mg·kg-1。按照1.2.3進行樣品前處理，后上機檢測，結果如表3所示?；厥章试?9.0%～105.5%，平均值為101.53%，結果均符合標準要求（80%～110%），方法準確性良好。

2.2.3 平行精密度測定

取6批試樣進行平行樣檢測，結果如表4所示。相對標準偏差（ Relative Standard Deviation， RSD）最大為1.46%，小于方法10%的要求，方法精密度良好。

3 結論

本文在GB 5009.247—2016基礎上優(yōu)化了乳飲料中紐甜的檢測方法。在0～20 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，方法線性關系良好，R2=0.999 9，加標回收率為99.0%～105.5%。該方法減少了基質(zhì)干擾，精密度及準確度較高，適用于乳飲料中紐甜的測定。

參考文獻

[1]吳鵬，張成云，朱旭麗，等.人工甜味劑對人體的影響及國內(nèi)外標準現(xiàn)狀探討[J].食品科學，2024，45（15）：383-392.

[2]朱世翠，陸思嘉，宋亞麗，等.典型飲水系統(tǒng)中人工甜味劑三氯蔗糖的調(diào)查[J].浙江大學學報（工學版），2019，53（11）：2197-2205.

[3]謝鵬，劉星，楊旭萍.常見人工甜味劑的介紹及其發(fā)展建議[J].現(xiàn)代食品，2021（3）：77-82.

[4]趙麗濤.毛細管電泳電容耦合非接觸電導檢測用于血液離子和人工甜味劑的檢測[D].蘭州：蘭州大學，2020.

[5]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中紐甜的測定：GB 5009.247—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.