TET2對非小細胞肺癌細胞活性及運動能力的影響

[摘要]目的觀察甲基雙加氧酶（ten-eleventranslocation，TET2）表達量對非小細胞肺癌細胞增殖能力、凋亡率、細胞周期、遷移和侵襲的影響。方法通過RT-PCR和Westernblot法檢測不同非小細胞肺癌細胞TET2基因和蛋白的表達情況，對高表達TET2的細胞敲低其基因表達（shRNA1），對低表達TET2的細胞過表達其基因（OE-TET2）。通過CCK-8檢測TET2表達量對細胞增殖的影響，通過流式細胞術觀察TET2表達量對細胞凋亡和細胞周期的影響，通過遷移實驗和侵襲實驗觀察TET2表達量對細胞遷移和侵襲能力的影響。結果H1299細胞的TET2基因和蛋白表達量最高，A549的最低（P<0.05）。OE-TET2組細胞增殖能力顯著低于正常A549，shRNA1組細胞增殖能力顯著高于正常H1299細胞（P<0.05）。OE-TET2組細胞凋亡率顯著高于正常A549，shRNA1組細胞凋亡率顯著低于正常H1299細胞，差異有統計學意義（P<0.05）。OE-TET2組細胞遷移和侵襲細胞數量顯著低于正常A549，shRNA1組細胞遷移和侵襲細胞顯著高于正常H1299細胞，差異有統計學意義（P<0.05）。結論TET2可降低非小細胞肺癌增殖能力，提高其凋亡率，減弱其遷移和侵襲能力。

[關鍵詞]甲基雙加氧酶；非小細胞肺癌；增殖；凋亡；遷移

[中圖分類號]R7.342[文獻標識碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.20.006

EffectofTET2ontheactivityandmotilityofnon-smallcelllungcancercells

YANGBilan1，ZHANGZixian2，OUYangxi1，LIUZhihua1，ZHONGJun1

1.DepartmentofChestTumorRadiotherapy，JiangxiCancerHospital，Nanchang330029，Jiangxi，China;2.DepartmentofBreastOncology，NanchangPeople’sHospital，Nanchang330000，Jiangxi，China

[Abstract]ObjectiveToobservetheeffectsofmethylenedioxygenase（TET2）expressionontheproliferationability，apoptosisrate，cellcycle，migration，andinvasionofnon-smallcelllungcancercells.MethodsDetecttheexpressionofTET2geneandproteinindifferentnon-smallcelllungcancercellsthroughRT-PCRandWesternblot.KnockdownthegeneexpressionofthehighestTET2expressingcells（shRNA1）andoverexpressthegeneinthemostlowTET2expr8q+uG0xaWbea7FnorpHPyw==essingcells（OE-TET2）.DetecttheeffectofTET2expressiononcellproliferationthroughCCK-8，observetheeffectofTET2expressiononcellapoptosisandcellcyclethroughflowcytometry，andobservetheeffectofTET2expressiononcellmigrationandinvasionabilitythroughmigrationandinvasionexperiments.ResultsTheexpressionlevelsofTET2geneandproteininH1299cellswerethehighest，whileA549cellshadthelowestexpressionlevels（P<0.05）.TheproliferationabilityofOE-TET2groupcellswassignificantlylowerthanthatofnormalA549，whiletheproliferationabilityofshRNA1groupcellswassignificantlyhigherthanthatofnormalH1299cells（P<0.05）.TheapoptosisrateofOE-TET2groupwassignificantlyhigherthanthatofnormalA549cells，whiletheapoptosisrateofshRNA1groupwassignificantlylowerthanthatofnormalH1299cells（P<0.05）.ThenumberofmigrationandinvasioncellsintheOE-TET2groupwassignificantlylowerthanthatofnormalA549cells，whilethemigrationandinvasioncellsintheshRNA1groupweresignificantlyhigherthanthoseinnormalH1299cells（P<0.05）.ConclusionTET2canreducetheproliferationability，increaseitsapoptosisrate，andslowdownitsmigrationandinvasionabilityofnon-smallcelllungcancercells.

[Keywords]Methyldioxygenase;Non-smallcelllungcancer;Proliferation;Apoptosis;Migration

非小細胞肺癌（non?smallcelllungcancer，NSCLC）是肺癌常見的類型，當前NSCLC的早期治療主要是手術切除，但NSCLC的早期癥狀不明顯，經常在中晚期才被發現，錯過最佳手術時機，需采用化療等其他方式治療，不僅療效無法保證且會引起嚴重不良反應，嚴重影響患者生活質量及生命安全[1-4]。因此研發更為有效安全的NSCLC治療手段至關重要。研究顯示，DNA異常甲基化參與多種惡性腫瘤的發生和發展，而甲基雙加氧酶（ten-eleventranslocation，TET2）主要參與DNA甲基化[5-7]。研究顯示，TET2的異常表達與多種腫瘤的發生發展相關[8]。TET2在NSCLC發生發展中的作用研究較少。本研究通過敲低或過表達NSCLC細胞的TET2基因，觀察其對腫瘤細胞的增殖、凋亡、運動能力的影響，以期為NSCLC的治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實驗材料

非小細胞肺癌細胞株A549，H1299，H1975和HCC827均從中國上海中科院細胞庫/干細胞庫購買。RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。Lip2000轉染試劑盒購自美國Thermo公司。DMEM培養基購自美國Corning公司。CCK-8試劑盒購自北京索萊寶公司。TET2抗體購自美國Millipore公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Matrigel購自美國BD公司。

1.2培養與檢測方法

1.2.1細胞培養所有細胞分別于DMEM培養基中培養，培養基中加10%雙抗和10%胎牛血清。細胞置于37℃，5%CO2培養箱中培養。細胞轉染：待細胞在培養皿中融合至80%～90%時制備單細胞懸液，調整細胞密度為1×106/ml并接種于6孔板中。嚴格按照轉染試劑盒說明書進行轉染。將全長人TET2cDNA（NM_001127208）插入pLVX-Ires-Puro載體（Clontech）中，構建TET2過表達質粒。siRNA合成序列分別為正向：3’-GUGGUGGUAUUUAGA-5’；反向：3’-UUUAUCUAAAUACCACCAC-5’。對于過表達TET2細胞，A549為正常未處理細胞（A549組），OE-NC為轉染對照（OE-TET2組），OE-TET2為轉染過表達細胞。對于敲低TET2細胞（OENC組），H1299為正常未處理細胞，shRNA-NC為轉染對照，shRNA1、shRNA2、shRNA3為不同程度轉染敲低細胞。

1.2.2RT-PCR法檢測使用Trizol對細胞進行RNA提取，隨后通過反轉錄獲取cDNA。使用熒光定量PCR儀96lightcycler進行RT-PCR法檢測。在96孔光學反應板中進行40個循環進行擴增，1個循環中94℃變性5s，63℃退火30s，72℃延伸60s。Bactin作為內參基因。引物序列見表1。

1.2.3Westernblot法檢測使用RIPA緩沖液裂解所有細胞。將具有等量蛋白質（20μg/孔）的樣品裝載在10%SDS-PAGE凝膠上，并按照說明書進行免疫印跡。抗TET2抗體和β-肌動蛋白的一級抗體購自細胞信號技術公司。用增強化學發光（enhancedchemiluminescence，ECL）觀察免疫反應帶，并使用ImageJ軟件進行分析。

1.2.4流式細胞術取各組對數期生長細胞消化后制備單細胞懸液，使得細胞懸液密度為1×106/ml，隨后在tube管中，分別根據細胞凋亡試劑盒加入RNase5μl（10mg/ml），37℃溫浴1h，加入PI（10mg/ml）染液5μl，室溫避光染色30min，用流式細胞儀測定周期；根據細胞凋亡試劑盒使用AnnexinV-FITC在流式細胞儀上檢測細胞凋亡。

1.2.5細胞遷移與侵襲實驗將各組細胞分別置于Transwell小室中，下室加入600μl含20%血清培養基，上室加入150μl不含血清培養基，培養24h后觀察小室地面細胞數量。使用培養基將Matrigel稀釋至1mg/ml，在Transwell小室的小室上室底部加入100μl稀釋好的Matrigel，待其干成膠狀后加入細胞，方法同細胞遷移實驗。24h后觀察Matrigel中細胞數量。

1.3統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間的比較采用單因素方差分析方法（one-wayANOVA），進一步的多重比較則采用LSD方法。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1TET2在非小細胞肺癌細胞株中的表達

使用RT-PCR和Westernblot法分別檢測4種人非小細胞肺癌細胞株A549、H1299、H1975和HCC827中TET2的基因和蛋白表達情況。H1299的TET2基因表達量最高，其次為HCC827，H1975略高于A549（P<0.05）。H1299的TET2蛋白表達水平顯著高于其他3種細胞，而A549的TET2蛋白表達水平最低（圖1）。

2.2TET2基因干擾及過表達非小細胞肺癌細胞系的建立

H1299的TET2水平表達最高，A549的表達最低，因此分別構建穩定干擾的H1299非小細胞肺癌細胞株和穩定過表達的A549非小細胞肺癌細胞株用于后續研究。穩定過表達的A549（OE-TET2）細胞中TET2的基因（P<0.05）和蛋白水平均出現顯著升高，穩定干擾的H1299（shRNA1、shRNA2、shRNA3）細胞中TET2的基因（P<0.05）和蛋白水平均出現顯著降低（圖2）。干擾的H1299非小細胞肺癌細胞株和穩定過表達的A549非小細胞肺癌細胞株已成功構建。

2.3TET2對細胞增殖的影響

三組A549和H1299細胞的起始濃度相同，隨著培養時間的延長細胞的濃度均出現顯著增加。正常A549細胞以及OE-NC細胞的濃度始終保持一致，然后在培養24h后，OE-TET2組細胞濃度低于A549和OE-NC組，差異有統計學意義（P<0.05），且這種

差異隨著培養時間的延長愈加明顯。正常H1299細胞以及shRNA-NC細胞的濃度始終保持一致，但是在培養24h后，shRNA1組細胞濃度顯著高于H1299和shRNA-NC組，差異有統計學意義（P<0.05），且這種差異隨著培養時間的延長愈加明顯（圖3）。

2.4TET2對細胞凋亡及周期的影響

過表達TET2的細胞凋亡率明顯上升（P<0.05），而敲低TET2表達后，細胞的凋亡率出現明顯下降（P<0.05）。TET2的表達對細胞S期的含量影響較小，過表達TET2后細胞G2期含量顯著上升（P<0.05），G1期含量顯著下降（P<0.05），而敲低TET2的表達則在G2期和G1期表現出相反的趨勢（P<0.05）。

2.5TET2對細胞遷移和侵襲的影響

過表達TET2后，Transwell小室上A549遷移的細胞數量明顯減少（P<0.05），同時侵襲的細胞數量也出現顯著降低（P<0.05）。對于TET2基因敲低的H1299細胞，遷移和侵襲的細胞數量均顯著上升（P<0.05），見圖4。

3討論

肺癌是一種發病率和病死率較高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌發病率最高，約占肺癌80%～85%，深入研究非小細胞肺癌發生、發展的分子機制可為其治療提供新的思路[9-10]。TET2作為一種去甲基化蛋白，已被證實其表達異常與多種腫瘤發生發展有關，如乳腺癌、白血病、黑色素瘤等[11-13]。同時，已有研究證實，TET2的表達與非小細胞肺癌的發生發展及預后存在一定關系[14]。因此，深入探討TET2在非小細胞肺癌發生發展中的作用或許可成為其有效的治療手段。

A.A549細胞及過表達TET2的A549細胞遷移和侵襲（結晶紫染色，×20）；B.H1299細胞及敲弱表達TET2的H1299細胞遷移和侵襲（結晶紫染色，×20）；C.過表達組遷移實驗統計結果；D.過表達組遷侵襲實驗統計結果；E.敲弱表達組遷移實驗統計結果；F.敲弱表達組遷侵襲實驗統計結果

TET2是雙加氧酶蛋白家族成員之一，主要參與DNA甲基化。研究發現5-mC能夠在TET蛋白的催化下生成5-羥甲基胞哺唆（5-hydroxvmethylcvtosine，5-hmC），從而導致DNA序列去甲基化。而TET2蛋白可催化氧轉移到5-mC的甲基，產生5-hmC[15-16]。DNA的異常甲基化會抑制抑癌基因的表達，激活原癌基因的表達，促進腫瘤的發生發展[17]。同時，還有研究發現TET2缺失導致5mC的積累，從而促進B細胞發育[18]。TET2缺失還促進CD4+T細胞分化和M1巨噬細胞反應，這可以調節癌癥細胞的活性。相反，攜帶TET2突變的癌癥細胞抵消了包括T細胞和巨噬細胞在內的陽性免疫細胞反應[19]。

本研究體外細胞學實驗，觀察非小細胞肺癌細胞株A549、H1299、H1975和HCC827中TET2的基因和蛋白表達情況。結果顯示A549細胞中TET2的基因和蛋白表達最低，而H1299的基因和蛋白表達最高。因此，分別上調A549細胞中TET2基因表達量和下調H1299細胞中TET2基因表達量，觀察其對腫瘤細胞的影響。

本研究過表達TET2基因的細胞，增殖能力降低，凋亡率增加，遷移和侵襲能力降低，而敲低TET2基因表達后表現出相反的趨勢。通過對細胞周期進行觀察發現，過表達的肺癌細胞G1期細胞數量減少，G2期升高，S期無明顯變化。G1期是DNA合成前期，G2期是DNA合成后期，過表達的肺癌細胞更多的停留在DNA合成后期，這進一步說明TET2具有減弱腫瘤細胞增殖能力、增加細胞凋亡的作用。腫瘤細胞遷移和侵襲是腫瘤發展過程中重要的一環，遷移和侵襲能力越強，腫瘤越有可能長大且轉移。研究顯示，細胞遷移和侵襲能力受多種細胞因子影響[20-21]。如果TET2基因缺失，可能引起腫瘤周圍環境炎性因子表達升高，且部分DNA序列甲基化本身也會引起細胞運動能力增強。這可能是本研究中低表達TET2基因的肺癌細胞出現遷移和侵襲能力增加，高表達TET2基因的肺癌細胞出現遷移和侵襲能力降低的原因。

綜上所述，本研究通過篩選不同非小細胞肺癌細胞株中TET2的表達情況構建TET2的高表達和低表達細胞系，并觀察其對腫瘤細胞的影響。研究結果顯示TET2表達上升后，非小細胞肺癌細胞的增殖能力下降、凋亡率上升，同時其遷移和侵襲能力下降，起到減緩腫瘤發生、發展的作用。本研究并未對TET2與非小細胞肺癌發生發展的更深的機制進行探討，下一步應針對DNA甲基化對其機制進行深入討論。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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