2%甲維鹽乳油對松材線蟲病的防效測定

摘要：[目的]為測試2%甲維鹽乳油（商品名：松高飛）對松材線蟲病的防治效果。[方法]首先通過室內浸漬法比較了2%甲維鹽乳油和2%甲維鹽微乳劑（商品名：林源松韻）的殺線活性，然后在溫室和林間通過樹干注射測試了2%甲維鹽乳油對松材線蟲病的防治效果，最后通過高效液相色譜法測定了不同時間、不同松樹體內甲維鹽的含量變化。[結果]室內浸漬法結果顯示，2%甲維鹽乳油具有更強的殺線活性，LC50為41.808mg·L-1，顯著低于2%甲維鹽微乳劑的75.959 mg·L-1 （p＜ 0.05）。溫室預防組結果顯示，2%甲維鹽乳油的預防效果顯著，2a后松樹無死亡。溫室治療組結果顯示，2%甲維鹽乳油治療時間越早，治療效果越好；2a后，接種線蟲后7d注藥治療組，松樹無死亡；而30 d后注藥治療組，白皮松、無死亡，油松死亡率為20%，華山松死亡率為40%。林間的試驗顯示2%甲維鹽乳油在兩塊林地的防治效果顯著，其試驗組馬尾松林2a累計死亡率分別為2%和5%，遠低于對照組馬尾松死亡率20%和25%。隨著時間變化，不同松樹體內甲維鹽變化有所差異，華山松體內平均甲維鹽含量最高（36.59 mg·kg-1），油松最低（27.11 mg·kg-1）。注射后15 d內，所有松樹體內甲維鹽含量均上升；15 d后，華山松樹干中部甲維鹽含量逐漸升高，60 d的含量最高；而油松、白皮松樹干內甲維鹽含量逐漸降低并趨平。[結論] 2%甲維鹽乳油對松材線蟲具有顯著的殺線活性，溫室和林間防治效果顯著，在不同松樹體內傳輸和存留效果良好，無明顯藥害，可以進一步推廣使用。

關鍵詞：松材線蟲病；甲維鹽；殺線活性；防治效果；藥物殘留

中圖分類號：S763.1 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0116-08

松材線蟲病（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer） Nickle）是世界性檢疫病害，主要危害松屬（Pinus）植物，可造成松樹水分輸導系統受損而快速枯萎。松材線蟲最早發現于北美地區，其后逐漸擴散到東亞和歐洲地區，對當地的松林造成了嚴重的危害，我國是目前遭受松材線蟲危害最嚴重的國家。近年來，松材線蟲的適應能力越來越強，在我國不斷向北向西擴展，寄主種類也不斷增加，危害對象從馬尾松（P.massoniana Lamb.）、擴大到樟子松（P．sylvestrisvar. mongolica Litv.）、長白落葉松（Larix olgensisHenry）等曾經認為具有抗性的樹種。目前我國大部分鄉土松樹樹種均為松材線蟲的自然感病寄主，因此，松材線蟲病的防控迫在眉睫。

樹干注射可以主動防治松材線蟲，通過人工或者機械的手段將活性物質注入樹干特定部位，nGkFth7rLZ6cEp2iS28E3g==依靠樹木蒸騰作用使有效成份在樹體內傳導分布而發揮藥效。甲維鹽（全稱：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽；英文縮寫：EB）屬于阿維菌素家族的成員之一，屬于半合成高效生物殺蟲劑，是目前有效防治松材線蟲病的主要活性物質。甲維鹽是氯離子通道激活劑，作用于γ-氨基丁酸和谷氨酸受體，導致氯離子通道異常打開，造成神經活動混亂，線蟲過度興奮和抽搐而死亡。Takai等人較早發現甲維鹽對松材線蟲具有高效的殺線活性，其后，圍繞甲維鹽分子結構的改性及劑型創制，新的甲維鹽產品不斷問世。Lee等人研發一種9.7%甲維鹽水溶劑，可以減少使用過程中的注藥量和注藥孔數目；張欣偉等人：研發了一種10%甲維鹽可溶粒劑，工藝簡單，防效顯著，對環境友好；李長強等人測試了2%甲維鹽微乳劑對黑松的防治效果，藥效突出；溶劑和粒劑減少了甲維鹽對樹體的藥害，但在樹體中輸導效率低，容易產生沉淀，而2%甲維鹽微乳劑提高了甲維鹽在樹體中的輸導效率，但有效成份B1a含量低，防治效果不穩定。目前，市面上的甲維鹽劑型多樣，有效成分含量不一、防治效果差別明顯。先正達（中國）集團研發的2%甲維鹽乳油（松高飛）添加了特殊的助劑，含水量≤2%，有效成份B1a含量為2.3%，是較晚進入我國市場的一種劑型。為比較該款產品與國內普通甲維鹽對松材線蟲病的防效差異、樹體中輸導效率和藥害等問題，本研究分析了“松高飛”與國內常用甲維鹽產品的藥效差異，開展了松高飛的田間防效測試。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2%甲維鹽乳油（先正達集團，商品名：松高飛）、2%甲維鹽微乳劑（浙江錢江生物化學股份有限公司，商品名：林源松韻）。

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）由西北農林科技大學郭云忠教授饋贈；松材線蟲（B．xylophilus）來自西北農林科技大學森林病理實驗室，分離自病死的馬尾松主干（陜西省漢中市佛坪縣大河壩鎮采集）。5年生白皮松、油松和華山松購自西安佳木秀苗木有限公司，置于溫室大棚（楊凌秦嶺山現代農業股份有限公司）培養，每周澆水1-2次。

1.2 林間樣地

試驗地位于陜西省佛坪縣大河壩鎮三河口村（樣地1；108°2＇50＂～108°2＇58＂E，33°18＇44＂～33°18＇48＂N）、高橋村（樣地2；108°2＇55＂～108°3＇2＂E，33°18＇43＂～33°18＇47＂N），亞熱帶氣候，年均降雨1 000 mm左右；試驗點海拔520 m，屬于中山區東坡和北坡。兩試驗地均為馬尾松林分，郁閉度在0.65左右，林下植被主要有短柄袍櫟（Quercus glandulifera Bl.）、懸鉤子（Rubuscorchorifolius L.f.）、木香（Rosa banksiae Ait.）、菝葜（Smilax china L．）等。樣地1馬尾松樹齡40年生，胸徑30～50 cm；2020年，該樣地爆發過松材線蟲病，間伐了大量的感病馬尾松，試驗前，個別松樹出現了輕微的松材線蟲病癥狀，發病率13.6%。樣地2馬尾松林30～40年生，邊緣有個別20年生濕地松（P．palustris Engelm），樹木胸徑10～50 cm．生長良好，發病率11 .8%。

1.3 浸漬法測定殺線蟲活性

參照李恩杰等方法，將松材線蟲接種到長滿灰葡萄孢菌絲的PDA培養基上，置于25℃下培養1周左右，用布袋將其培養基包裹，通過貝爾曼漏斗法分離線蟲。靜止24 h后，取底部水樣，6 000 r·min-1離心3 min，保留底部1 mL液體。將過濾出的線蟲懸浮液轉移至滅菌的10 mL離心管中，分別加入1μL·mL-1氯霉素和硫酸鏈霉素進行表面消毒，無菌水漂洗2-3次得到無菌線蟲懸浮液，置于4℃冰箱保存備用。

使用96孔板測定殺線蟲活性，每次供試線蟲200條。用無菌水再將2%甲維鹽乳油和2%甲維鹽微乳劑稀釋成質量濃度為20，40，60，80，100 mg·L-1的供試藥液。實驗時，加入藥劑和2 000條每毫升的線蟲懸液各100μL，每個濃度為1個處理，每處理重復3次，以蒸餾水作為對照。處理后將96孔板置于25℃恒溫箱中，24 h后用顯微鏡檢查松材線蟲的存活數和死亡數，計算死亡率和校正死亡率（式1和式2）。凡運動者或蟲體呈“S”形、卷曲形、波浪形、螺旋形者均判為活蟲；凡不運動且蟲體呈“J”形或“C”形、或者蟲體僵直、體壁無折光性者均判為死蟲。為減少實驗誤差，在顯微鏡下用昆蟲針刺探蟲體，避免假死情況出現。

DRCK= （NDCK÷NCK）×100%（1）

DRc=（DRT- DRCK）÷（1-DRCK）×100% （2）

式中，DR表示死亡率，ND表示死亡數，～表示接種數；DRCK表示對照死亡率，NDCK表示對照死亡數，NCK表示對照供試蟲數，DRc表示校正死亡率，DRT表示處理組平均死亡率。

1.4 2%甲維鹽乳油的大棚溫室試驗

5年生白皮松、油松和華山松在溫室中培養3個月后，選取健康的個體進行試驗。試驗分為兩個處理：預防組和治療組。預防組分別提前1 5、30和60 d，在松樹干基部斜向下45°鉆1個2 mm左右的小孔，在小孔外加1團滅菌的脫脂棉，將藥劑按樹干胸徑1 mL·cm-1注射藥劑；注射后，用保鮮膜密封。每個時間點、每種松樹選取5棵進行試驗。注藥后，在注藥口上方1 cm左右采用人工打孔法接種松材線蟲，接種量為3 000條·株-1。治療組先接種線蟲，7、15和30 d后注射藥劑，處理方式如預防組。每個處理5棵松樹，以只注射藥劑為陽性處理，只接種松材線蟲為陰性處理。1年和2年后觀察并統計處理松樹的死亡率（式3）。

DR=（ND÷N） ×100％（3）

1.5 2%甲維鹽乳油林間防治試驗

每個林地按五點法設5個樣方，每個樣方抽取20棵馬尾松做試驗，再選取樣地周邊的同樣數量的馬尾松作為對照。用電動樹干打孔注藥機在樹干基部斜向下45°打孔，每株樹打孔3-5個，按1 mL·cm-1胸徑注射2%甲維鹽乳油，胸徑不足20 cm的按20 cm的劑量注射。分別在1a和2a后觀察并統計處理植株的存活情況，計算出每個樣方的死亡率（式3），再計算兩片林地的平均死亡率。

1.6 甲維鹽在樹體內的輸導和殘留含量測定

在注藥7、15、30和60 d后，從5年生的白皮松、油松和華山松上采集枝條，每種松樹3—5棵，在樹干上、中、下部（均在注藥孔以上）各取樣1份。陰干后，將采集到的樣品枝條剪成小段，放在50℃的烘箱中烘干，直至1 h前后質量不變。用粉碎機將烘干好的枝條粉碎，過30目篩后用密封袋置于干燥皿中保存。參照張欣偉等方法，進行樣品處理、甲維鹽標準品配置和高效液相色譜法（HPLC）進行檢測。HPLC檢測的流動相為甲醇（V）：乙腈（V）：0.1%三乙胺水溶液（V） =40：45：15，進樣量為20 μL；流速為1 mL·min-1，紫外檢測波長245 nm。按上述條件先測試標準品峰面積，觀察出峰時間，以質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。再按上述條件測試各樣品，每個樣品測試3次。

1.7 數據處理

（1）用Excel 2019計算2%甲維鹽不同劑型的毒力回歸方程和相關系數，通過Origin 2021做點線圖，再通過SPSS Statistics 19.0計算LC50值和LC90值。

（2）用Excel 2019整理色譜數據，做出標準曲線圖，再通過SPSS Statistics 19.0進行單因素方差分析，在同種松樹同一時間的條件下，對松樹枝條中的甲維鹽含量進行不同部位的單因素分析。同時，對不同松樹同一時間的平均甲維鹽含量進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同劑型甲維鹽對松材線蟲的殺線活性

材線蟲經甲維鹽藥劑處理24 h后，微乳劑和乳油對松材線蟲均表現出良好的殺線活性，見圖1。兩種劑型甲維鹽隨濃度的增加，松材線蟲的校正死亡率上升，50 mg·L-1處理24 h后，2%甲維鹽乳油和微乳劑的校正死亡率分別為98.33%和65.33%，表明兩種劑型甲維鹽對松材線蟲均有良好的殺線活性。兩種劑型甲維鹽在各質量濃度下的校正死亡率均存在差異，2%甲維鹽乳油在不同濃度下校正死亡率更高，表明其殺線活性更強。2%甲維鹽乳油的毒力回歸方程為y=1.454 1+0.988 0x，相關系數R2為0.983 4，LC50和LC90為41.808 mg·L-1和99.925 mg·L-1。2%甲維鹽微乳劑的毒力回歸方程為y=-4.917 4+0.701 84x，相關系數R2為0.997 6，LC50和LC90為75.959 mg·L-1和239.364 mg·L-1（表1）。2%甲維鹽乳油和微乳劑的LC50的50%置信區間無交叉重合，說明2%甲維鹽乳油的LC50顯著低于微乳劑，而LC90的95%置信區間存在部分交叉重合，這說明2%甲維鹽乳油和微乳劑的LC90差異不顯著。2%甲維鹽乳油對松材線蟲表現出更強的殺線活性，選用其進行下一步試驗。

2.2 2%甲維鹽乳油大棚溫室防治效果

在大棚溫室內，甲維鹽對不同松樹的預防和治療效果如表2所示。只注射藥劑的陽性對照組均無不良生長現象，表明2%甲維鹽乳油對松樹無藥害。陰性對照中，不同松樹的死亡率不同，2a后，華山松全部死亡，油松80%死亡，白皮松20%死亡。預防組結果表明，注藥15、30和60 d以后接種松材線蟲，白皮松、油松和華山松雖然出現了松材線蟲病的癥狀，但連續2a均未死亡，這表明2%甲維鹽乳油可以有效預防油松材線蟲病的發生。治療組結果表明，接種線蟲后注藥時間越早，松樹死亡率越低。先接種線蟲后注射藥劑，白皮松無死亡，油松接種線蟲30d后注藥，2a后出現了1棵死亡松樹，華山松接種線蟲15 d和30 d后注藥，2a后死亡率分別為20%和40%。2%甲維鹽乳油對不同松樹的治療效果不同，與松樹種類有關。

2.3 2%甲維鹽乳油林間防治效果

2%甲維鹽乳油對松材線蟲病的林間防治效果顯著。林地1連續2a馬尾松的累計死亡率為5%±3.16%，而對照區的馬尾松死亡率為25%±8.94%（見表3）。林地2連續2a馬尾松的死亡率為2%±2.45%，對照區馬尾松的死亡率為20%±10.49%。林地2馬尾松死亡率比林地1低，這可能跟林地1曾爆發過松材線蟲病、清理不徹底有關。兩片樣地隨著時間的推移，松樹的死亡率增加，而注射了2%甲維鹽乳油的馬尾松死亡率相比對照組大幅下降，這表明2%甲維鹽乳油可以有效防治松材線蟲。

2.4 甲維鹽在松樹體內的動態分布

白皮松樹干不同部位枝條的甲維鹽含量變化為先升后降（圖2B），樹干上部枝條30 d時甲維鹽含量最高，根據標準曲線（圖2A）計算為46.40±1.08 mg·kg-1;中部枝條15 d時甲維鹽含量最高，為43.31±0.47 mg·kg-1；下部枝條15 d時甲維鹽含量最高，38.91±1.51 mg·kg-1。油松樹干不同部位枝條的甲維鹽含量也呈現出先升后降的趨勢（圖2C），但樹干上部枝條15 d時甲維鹽含量最高，為33.51±2.10 mg·kg-1；中部枝條30 d時甲維鹽含量最高，為28.94±1.92 mg·kg-1；下部枝條15d時甲維鹽含量最高，為22.06+2.08 mg·kg-1。華山松樹干上部枝條甲維鹽含量先升后降（圖2D），15 d時最高，為49.72±2.10 mg·kg-1；中部枝條甲維鹽含量一直上升，60 d時甲維鹽含量最高，為43.24±1.34 mg·kg-1；下部枝條甲維鹽含量先升后降，30d時最高，為38.84±1.08 mg·kg-1。

不同松樹體內的平均甲維鹽含量在同一時間段內存在差異，其中，油松體內的平均甲維鹽含量低于白皮松和華山松，注藥后15 d內表現為輕微藥害現象，其7、15和30 d的平均含量與其他松樹相應時間段的含量差異顯著（p＜0.05）。白皮松體內平均甲維鹽含量隨時間變化先增后減，15 d時甲維鹽含量最高，為39.45±8.50 mg·kg-1。油松體內平均甲維鹽含量一直在上升，15 d前快速上升，15d后逐漸趨平，60d時為27.11±11 .23 mg·kg-1。華山松體內平均甲維鹽含量總體呈上升趨勢，15 d的含量最高，為38.81±10.07 mg·kg-1。甲維鹽在油松、華山松體內向頂傳輸速度均較白皮松快，上部枝條15 d甲維鹽含量即達到最大，圖2；油松體內甲維鹽平均含量較白皮松、華山松低，但濃度相對穩定；華山松體內甲維鹽15 d后主要分布在樹干中、下部，且單位含量最高，表4。

3 討論

甲維鹽是防治松材線蟲主要的注干劑之一，市面上的甲維鹽劑型多樣，其中以乳油和微乳劑最常見，不同劑型的甲維鹽的田間防治效果存在差異。乳油中具有大量的有機溶劑，對有效成分具有一定的增效作用，而微乳劑則減少了有機溶劑的使用，用水來代替有機溶劑，因而更加環保，減小了藥害現象。李海等人比較了不同劑型的吡蟲啉對蚜蟲的防治效果，結果表明吡蟲啉乳油和微乳劑對蚜蟲的生物活性相當，但乳油的LC50更小。李長強和葉建仁比較了阿維菌素乳油和微乳劑對松材線蟲的殺線效果，結果表明微乳劑的殺線效果顯著優于乳油，其LC50和LC90的95%的置信區間無交叉重合。本試驗中，2%甲維鹽乳油（松高飛）的LC50顯著低于微乳劑，表現出更強的殺線活性，這可能跟本研究中的2%甲維鹽乳油優良的助劑系統和有效活性成分含量高有關。

甲維鹽對松材線蟲具有良好的防治效果。李長強等人在黑松上，按地徑2 mL·cm-1的比例注干施用2%甲維鹽微乳劑對松材線蟲病的防治效果達91.7%。張欣偉等人發現10%甲維鹽可溶粒劑的林間防治效果顯著，注干施藥1a后兩個松材線蟲病疫區的試驗組馬尾松死亡率為0和1.7%，對照組死亡率為6.1%和10.8%。在本試驗中，2%甲維鹽的林間防治效果同樣顯著，處理組松樹死亡率明顯低于對照組。松材線蟲寄生在樹體內，傳統的葉面噴霧和土壤灌溉等施藥方法效果較差，因此，樹干注射是防治松材線蟲的主要施藥方法。相比于傳統方法，樹干注射的主要優勢包括藥劑有效利用率更高、操作過程安全性更高、對環境危害更低、對非目標生物傷害更少以及在人口密集地區施用的可能性更大等優點。樹干注藥方法可以分為加壓式和自流式，本試驗采用的是加壓式注藥。先使用電動樹干打孔注藥機先在松樹主干上打孔，然后通過加壓方式將藥劑注入松樹主干，保證藥劑能夠快速地注入樹體木質部中。最后，用硅膠T型塞將孔洞密封，減少藥劑的流失和損耗，這也可能是防效較同等濃度甲維鹽微乳劑顯著的原因之一。

注藥后，甲維鹽會逐漸被樹體吸收，而后隨著時間的推移，樹體甲維鹽濃度會逐漸降低。張欣偉等人發現，10%甲維鹽顆粒劑隨著時間不斷被松樹吸收，不斷地向上傳導，松樹各部位甲維鹽含量隨著時間的延長而逐漸增加，這同本試驗中施藥后15 a內，2%甲維鹽乳油在松樹不同部位枝條中的含量均有上升趨勢一致。但后期松樹不同部位間差異比較大，白皮松在注射后15～30 d，上部枝梢中甲維鹽含量均快速增加并達到最高值后快速衰減，而油松和華山松上部枝梢在15 d前快速增加，達到最高值后緩慢衰減；而中部枝干甲維鹽含量，白皮松15 d達到最高值，后快速下降，油松30 d達到最高值后快速下降，華山松中部甲維鹽含量卻是隨時間增加而顯著增加，60 a達到最高值；下部枝干甲維鹽含量，均在注射后15 d內顯著增加，后逐漸減少，其中白皮松、油松甲維鹽衰減較慢，15 d與30 d無顯著差別，而華山松甲維鹽卻快速衰減。本研究的甲維鹽在松樹各部位中殘留含量均有差異，與李長強等人運用2%甲維鹽微乳劑防治黑松線蟲病的研究結果基部一致。2%甲維鹽乳油和微乳劑在不同松樹及松樹不同部位的含量動態，反應了樹種吸收、傳輸和消解甲維鹽的能力存在差異，因而，甲維鹽對不同松樹的松材線蟲病的防治效果可能會有明顯差異，使用時需要做好劑型和劑量選擇。

4 結論

2%甲維鹽乳油（松高飛）較2%甲維鹽微乳劑（林源松韻）具有更強的殺線活性，其LC50為41.808 mg·L-1。2%甲維鹽乳油對溫室松材線蟲病具有顯著的預防和治療作用，且田間防治效果優艮；2%甲維鹽乳油在不同樹體內均可以良好傳輸和存留、無明顯的藥害現象，可以作為松材線蟲病的良好防治藥劑。

致謝：本研究田間試驗得到陜西省佛坪縣林業局的大力幫助和支持，佛坪林業局康積林、西北農林科技大學彭子嘉、駱澤煜、李成龍等參與了野外注射、調查和觀測，在此一并致謝！

（責任編輯：崔貝）

基金項目：2%甲維鹽乳油（松高飛）對松材線蟲病的防效測定（K4040121197）資助