PCR技術在食品微生物檢測中的應用研究進展

2024-10-17 00:00:00銀菊香

食品安全導刊·中旬刊 2024年9期

摘要：食品中的微生物污染是影響食品安全的重要因素之一。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術具有靈敏、快速等特點，屬于一種特異檢測方法，被廣泛應用于食品微生物檢測。本文闡述PCR技術的特點及其在食品微生物檢測中的應用，探討當前PCR技術在食品微生物檢測中存在的主要問題，以期為PCR技術在食品微生物檢測領域中的應用提供借鑒。

關鍵詞：PCR技術；食品微生物檢測；應用

Research Progress on the Application of PCR Technology in Food Microbial Detection

YIN Juxiang

（Wuwei City Center for Disease Control and Prevention， Wuwei 733000， China）

Abstract： Microbial contamination in food is one of the important factors affecting food safety. The polymerase chain reaction （PCR） is a specific detection method with the characteristics of sensitivity and speed， and is widely used in the detection of food microorganisms. This paper describes the characteristics of PCR technology， the application of PCR technology in food microbial detection， and discusses the main problems existing in the current PCR technology in food microbial detection， in order to provide reference for the application of PCR technology in the field of food microbial detection.

Keywords： PCR technology; food microbial detection; application

食品作為人們生存和發展的重要物質基礎，事關人們的身體健康及生命安全，而微生物污染是食源性疾病的重要原因之一。因此，對食品開展快速、準確的微生物檢測至關重要。傳統的微生物檢測方法如培養法、生化鑒定法等，雖然具有一定的準確性，但存在檢測周期長、操作煩瑣、靈敏度低等缺點[1]。PCR是一種分子生物學技術，具有靈敏、快速等特點，被廣泛應用于食品微生物檢測。

1 PCR技術的特點

1.1 高靈敏度

PCR技術能對極微量的微生物DNA進行檢測和分析，可將皮克量級擴增到微克水平，能夠從大量的食品樣本中檢測出痕量的特定微生物，這對于檢測那些含量極低但可能對食品安全構成威脅的微生物極其重要[2]。

1.2 高特異性

PCR技術遵循堿基配對原則，以引物與模板DNA特異性結合、Taq聚合酶合成反應及靶基因的保守性與特異性為基準，特異性強，堿基錯配率低。PCR技術通過選擇特異性的引物，能精準地擴增目標微生物的特定DNA片段，從而準確識別出目標微生物，有效避免對其他非目標微生物的誤檢[3]。

1.3 快速且簡便

PCR技術操作相對簡便，只需要一次性將反應液加好后，就可以進行擴增，一般在數小時（通常2～4 h）內完成擴增反應，與傳統的微生物培養檢測方法相比，大大縮短了檢測時間，能夠及時為食品生產、加工、流通等環節提供檢測結果，有助于快速采取相應的措施。

1.4 對樣品要求較低且重現性較好

PCR技術不需要對微生物進行分離培養等復雜的前處理步驟，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板，能夠適應各種不同類型的食品樣本。同時，只要嚴格控制實驗條件，如溫度、反應時間、試劑濃度等，PCR反應具有較好的重現性，能夠保證實驗結果的穩定性和可靠性，這對于大規模的食品微生物檢測以及不同實驗室之間結果的比較和驗證非常重要。

1.5 可實現定量檢測

實時熒光定量PCR技術等可以對微生物的DNA進行定量分析，能夠確定食品中微生物的數量，為評估食品微生物污染的程度提供更精確的數據，對于判斷食品的安全性和質量具有重要意義[4]。

1.6 適用范圍較廣，可同時檢測多種微生物

PCR技術可檢測多種食品中的微生物，如細菌、病毒、真菌等，并且針對不同的微生物可以設計相應的引物進行特異性檢測。此外，借助多重PCR技術，將多對引物加入同一反應體系，可以擴增出多條微生物核酸片段，實現多種目標微生物的同時檢測，節省了時間，降低了成本，提高了檢測效率。

2 PCR技術在食品微生物檢測中的應用

2.1 細菌檢測

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因之一，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，而PCR技術可以快速、準確地檢測這些致病菌，為食品安全監管提供了有力的技術支持。艾鵬飛等[5]針對傳統食源性細菌檢測方法實驗步驟復雜、實驗周期較長、靈敏度較低等問題，以單增李斯特菌、大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌為研究對象，通過實驗成功建立了同時檢測以上3種細菌的TaqMan多重實時定量PCR方法。該方法通過對單增李斯特菌mpl基因、大腸桿菌O157：H7 tir基因、蠟樣芽孢桿菌entFM基因的保守序列分別設計特異性引物和TaqMan探針，并在建立的多重qPCR反應體系下，實現對3種細菌的特異性檢測，最低檢出限可低至12 CFU·mL-1，陽性檢出率為100%，檢測周期為6 h，可實現大批量樣品快速檢測。劉艷等[6]針對包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢測周期長、準確性較低等問題，建立了針對包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速定量檢測的ddPCR方法。該方法的檢出限為10 CFU·mL-1，靈敏度較好，能夠滿足包裝飲用水中銅綠假單胞菌的實際檢測需求。

2.2 病毒檢測

一些病毒如諾如病毒、甲型肝炎病毒等，具有高度傳染性、快速傳播性等特點，能夠通過食品、水等媒介對人們的健康造成嚴重危害。利用PCR技術可快速、準確檢測這些致病性病毒，為食品安全監管、疾病防控提供重要的技術支持。陳波等[7]成功建立了檢測諾如病毒的TaqMan熒光定量PCR方法。研究結果顯示，40 min內即可得到檢測結果，方法的靈敏度較高，最低檢測限為1.2 copies·μL-1，可實現對于低濃度樣品的準確檢測，避免了假陰性樣品的出現。經數字PCR實驗驗證后進一步表明該方法的可行性和科學性，為準確檢測諾如病毒及流行病學監測提供了有效的技術支持。嚴禮等[8]為準確、快速地檢測豬肉及其制品中非洲豬瘟病毒，針對非洲豬瘟病毒核酸的VP72和K205基因設計并合成3對引物及探針，通過優化反應條件，最終建立了非洲豬瘟病毒微滴數字PCR的檢測方法。該方法可有效減少與豬肉中其他病毒發生交叉反應，具有較高的特異性，有助于在豬肉及其肉制品加工生產過程中及時發現非洲豬瘟病毒，防范食品安全風險。

2.3 真菌檢測

食品中存在的產毒真菌，一旦被人體攝入，可能會引起急性中毒反應。同時，長期低劑量攝入產毒真菌污染的食物，可導致慢性中毒，會對人體多個器官系統造成損害，尤其是肝臟和腎臟。因此，加強食品中真菌檢測，對于有效預防急性和慢性中毒事件發生十分必要。馮優妍等[9]為了實現快速檢測糧食中的主要霉菌（寄生曲霉、黃曲霉），通過設計TaqMan?實時熒光PCR反應引物及探針，對RT-PCR反應體系進行優化，建立了糧食中黃曲霉、寄生曲霉的RT-PCR檢測方法。此方法具有較強的特異性，且通過10種霉菌模擬污染糧食模型驗證，無假陽性現象出現；最低檢測濃度可低至0.01 ng·μL-1，靈敏度高于普通PCR方法，可應用于早期糧食霉變篩查，有效防止霉變糧食大面積污染，為保障我國糧食質量安全提供了技術支撐。張慶等[10]使用多重實時熒光PCR方法，建立了4種產毒真菌檢測體系，可在2 h內進行快速檢測，對青霉的最低檢出限為1.53×104 拷貝/反應，對產黃曲霉毒素的最低檢出限為3.37×104 拷貝/反應，對鐮刀菌的最低檢出限為3.95×104 拷貝/反應，對赭曲霉的最低檢出限為1.91×104 拷貝/反應。該方法具有高靈敏度和強特異性的特點，可滿足大批量檢測需求，為及時發現食品中此類產毒真菌的存在提供了鑒別方法。

3 當前PCR技術在食品微生物檢測中存在的主要問題

3.1 假陽性問題

3.1.1 污染導致假陽性

在PCR檢測過程中，極微量的污染就可能導致假陽性結果，如實驗室環境中的氣溶膠污染、操作過程中樣本間的交叉污染等。如果實驗室的通風系統不完善，或者操作人員未能嚴格遵守操作規程，則容易使空氣中的污染物進入反應體系，從而產生假陽性現象。同時，試劑污染也是常見的導致假陽性結果的原因之一。PCR試劑中的各種成分，如引物、酶等，如果在生產或儲存過程中受到污染，也可能在檢測中引入外源DNA，進而導致出現假陽性現象。

3.1.2 引物設計不合理導致假陽性

引物的特異性較低也是產生假陽性的重要因素之一。如果引物與非目標微生物的DNA序列有一定相似性，就可能在PCR反應中擴增出非目標產物，造成假陽性。例如，在設計引物時，如果沒有充分考慮到食品中可能存在的其他微生物的基因組序列，易導致出現假陽性現象。

3.2 假陰性問題

3.2.1 樣本中抑制物的存在

食品樣本中可能存在各種抑制PCR反應的物質，如多糖、蛋白質、酚類和重金屬離子等。這些抑制物可能與PCR反應中的酶、引物或模板DNA結合，從而影響PCR反應的進行，導致出現假陰性結果。此外，不同的食品基質對PCR的抑制程度也不同。例如，肉類、奶制品等高蛋白食品中的蛋白質可能會與酶結合，抑制酶的活性；而植物性食品中的多糖可能會干擾DNA的提取和純化過程。

3.2.2 目標微生物數量過少

如果食品中的目標微生物數量極少，可能低于PCR檢測靈敏度的下限，從而導致假陰性結果。在實際檢測中，由于食品加工、儲存等過程中目標微生物在食品中分布不均勻，可能使檢測結果出現假陰性。

3.3 定量問題

PCR技術雖然可以實現對目的DNA片段的擴增，但不能直接對微生物的數量進行定量。目前，常用的定量方法如實時熒光定量PCR技術雖然可實現對微生物的相對定量，但仍然存在一定程度的誤差。

3.4 技術要求高

PCR技術需要專業的設備和技術人員進行操作。操作人員需經過專業培訓，熟悉PCR反應的原理、操作步驟和注意事項，否則容易出現操作失誤，影響檢測結果的準確性。例如，在DNA提取、引物設計、反應條件優化等環節，都需要一定的專業知識和技能。此外，PCR技術對實驗室環境的要求相對較高。PCR實驗室需嚴格分區，避免交叉污染。同時，實驗室的溫度、濕度等環境條件也需嚴格控制，以確保PCR反應的穩定性和重復性[11]。

3.5 成本較高

PCR檢測需要使用昂貴的儀器設備和試劑，如PCR儀、凝膠成像系統、引物、酶等。這些設備和試劑的成本相對較高，因此PCR檢測費用較普通檢測方法也較高，造成該技術未能全面得到應用。

4 結語

隨著分子生物技術的持續發展，PCR技術在食品微生物檢測中的應用前景十分廣泛。未來，研究人員還應加快優化PCR技術，提高食品微生物檢測的科學性、準確性、規范性，降低成本，提高效率，為食品安全監管提供技術保障。

參考文獻

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[2]鞏莉，劉秀紅.食品微生物檢測中PCR技術的應用[J].中國食品工業，2024（5）：83-85.

[3]石思文.淺析PCR技術在食品微生物檢測中的應用[J].中國食品工業，2023（22）：72-74.

[4]薛磊.PCR技術及其在食品微生物檢測中的運用策略[J].現代食品，2023，29（2）：136-138.

[5]艾鵬飛，王珊，高輝明，等.TaqMan多重實時定量PCR快速檢測3種常見食源性病原菌[J].中國食品學報，2024，24（5）：373-380.

[6]劉艷，李詩瑤，張伊動，等.微滴式數字PCR定量檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌[J].中南農業科技，2024，45（8）：55-58.

[7]陳波，李家奇，付立申，等.諾如病毒TaqMan熒光定量PCR檢測方法的設計與優化[J].五邑大學學報（自然科學版），2024，38（3）：1-6.