溴氰菊酯酶聯免疫吸附分析和膠體金免疫層析分析方法的建立

摘要 制備了9 株分泌溴氰菊酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，選取靈敏度最高的單克隆抗體4D4E11 建立了間接競爭酶聯免疫吸附分析方法（ic-ELISA）和膠體金免疫層析分析方法（LFIA）用于檢測溴氰菊酯。ic-ELISA 的最優工作溶液為0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（PB， NaH2PO4/Na2HPO4， pH 7.4），含20%甲醇和0.2 mol/L NaCl；LFIA 的最優工作溶液為0.01 mol/L PB 緩沖溶液（pH 7.4），含5‰ Tween-20、10%甲醇和1 mol/L NaCl。在最優條件下， ic-ELISA 對溴氰菊酯的半數抑制濃度（IC50）為10.60 ng/mL，檢出限（IC10）為1.43 ng/mL；LFIA 對溴氰菊酯的可視檢出限為0.5 μg/mL。特異性評價實驗結果表明， ic-ELISA 和LFIA 對溴氰菊酯的8 種結構類似物無明顯交叉反應，特異性強。采用Ic-ELISA 檢測番茄、結球甘藍和油麥菜添加樣品的平均回收率為79.8%～92.6%，相對標準偏差為0.8%～5.5%；采用LFIA 檢測番茄、油麥菜和結球甘藍添加樣品的結果與添加濃度相符。此外， ic-ELISA 和LFIA 對油麥菜盲樣中溴氰菊酯的檢測結果與高效液相色譜的檢測結果一致。實驗結果表明，建立的ic-ELISA 和LFIA 靈敏度高、準確性好，為農產品中溴氰菊酯殘留的快速檢測提供了新方法。

關鍵詞 溴氰菊酯；單克隆抗體；間接競爭酶聯免疫吸附法；膠體金免疫層析法

溴氰菊酯（Deltamethrin）屬于Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，被廣泛用于防治蔬菜、棉花和果樹上的甜菜夜蛾、棉鈴蟲和食心蟲等。由于有機磷等高毒農藥逐漸被禁用或限用，溴氰菊酯在農業生產上的用量逐年增長[1]，在農產品中常被檢出[2-4]，膳食暴露風險大。研究表明，溴氰菊酯對鵪鶉、哥倫比亞搖蚊和斑馬魚等非靶標生物具有發育毒性[5]、免疫毒性[6]、神經毒性[7]、氧化毒性[8]和臟器毒性[9]。我國國標《食品中農藥最大殘留限量標準》（GB 2763—2021）規定了溴氰菊酯在不同食品中的最大殘留限量（Maximum residue limit， MRL）為0.01～10 mg/kg[10]。因此，需加強對溴氰菊酯殘留的檢測，保障食品安全。

目前，檢測溴氰菊酯殘留的常用儀器分析方法包括氣相色譜-質譜法[11-12]、高效液相色譜（HPLC）-紫外檢測法[13-14]和HPLC-質譜法[15]等。雖然這些方法具有靈敏度高、重復性好的優勢，但設備昂貴、樣品前處理時間長且需要專業操作人員，不能用于高通量的現場檢測，無法滿足農殘現場快速檢測的實際需求。

基于抗原抗體識別的免疫檢測，如酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）和側流免疫層析法（Lateral flow immunoassay， LFIA）等，具有快速、簡便和經濟等特點，已被廣泛應用于小分子農藥殘留的檢測。抗體作為免疫檢測的核心試劑，其性能影響分析方法的特異性和靈敏度。基于溴氰菊酯多克隆抗體的免疫檢測方法已有報道[16]，如Lee 等[17]制備了溴氰菊酯的多克隆抗體，并建立了ELISA 方法，其半數抑制濃度（IC50）為17.5 ng/mL， 但該方法與氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯和苯醚菊酯有較高的交叉反應率（Cross-reactivity， CR），分別為37.3%、9.5%、8.5%和6.8%。與多克隆抗體相比，可針對特定表位進行設計且來源于單個B 細胞的單克隆抗體通常具有較高的特異性[18-19]，同時具有可持續制備的優勢。Queffelec 等[20]在溴氰菊酯芳香環上引入含有羧基的連接臂，合成了半抗原，制備出溴氰菊酯單克隆抗體，建立的間接競爭ELISA（ic-ELISA）方法的IC50 為500 ng/mL，與擬除蟲菊酯類農藥的CRlt;1%。ELISA 可同時定量檢測多個樣品，并能提供定量檢測結果。相比于ELISA， LFIA 通常只能提供半定量或定性的檢測結果，但其操作更簡單（一步法）、檢測時間更短（5～10 min），適合現場快速篩查[21]。目前，基于溴氰菊酯單克隆抗體的LFIA 尚未見報道。

本研究制備了溴氰菊酯的單克隆抗體，并建立了ic-ELISA 和LFIA 方法，優化了兩種方法的檢測條件，并對其靈敏度、特異性和準確性進行了評價。此外，使用HPLC 對ic-ELISA 和LFIA 的可靠性進行了驗證。