重癥支原體肺炎患兒鐵死亡水平與炎癥反應、氧化應激的相關性及意義

［摘 要］目的 研究重癥支原體肺炎（MPP）患兒鐵死亡水平與炎癥反應、氧化應激的相關性及意義。方法 選擇2019年6月至2022年6月我院兒科收治的74例輕癥MPP患兒和136重癥MPP患兒，分別作為輕癥MPP組和重癥MPP組，另選擇80例健康兒童作為對照組。采集血清并檢測鐵死亡標志物轉鐵蛋白受體1（TfR1）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、炎癥反應標志物C反應蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6），氧化應激標志物丙二醛（MDA）、過氧化脂質（LPO）的水平，比較三組間各個指標的差異，并分析鐵死亡標志物與炎癥反應標志物、氧化應激標志物的相關性。評估血清鐵死亡標志物診斷重癥MPP、預測重癥MPP預后的價值。結果 重癥MPP組的血清TfR1、ACSL4、CRP、IL-6、MDA、LPO含量高于輕癥MPP組和對照組，GPX4含量低于輕癥MPP組和對照組（F值為321.061、233.544、839.887、761.429、897.668、585.581和196.558，P＜0.05）；重癥MPP組的血清TfR1、ACSL4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈正相關（r值介于0.311至0.441之間，P＜0.05），GPX4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈負相關（r值介于-0.413至-0.309之間，P＜0.05）；重癥MPP組中預后不良患兒的血清TfR1、ACSL4含量顯著高于預后良好患兒，GPX4含量低于存活患兒（t值為5.025、4.535和5.440，P＜0.05）；血清TfR1、ACSL4、GPX4三項指標聯合對重癥MPP診斷及預后預測價值最大（AUC=0.973，靈敏度為95.59%，特異度為100%；AUC=0.952，靈敏度為86.96%，特異度為88.46%）。結論 重癥MPP患兒鐵死亡激活與炎癥反應、氧化應激加重相關，血清鐵死亡標志物是診斷重癥MPP、預測預后的標志物。

［關鍵詞］肺炎支原體肺炎；鐵死亡；炎癥反應；氧化應激；相關性；診斷

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.07.005

［中圖分類號］R179［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）07-0032-06

Correlations of serum ferroptosis level with inflammatory response and oxidative stress

in children with severe Mycoplasma pneumonia and their significance

［Abstract］ Objective To study correlations of serum level of ferroptosis with inflammatory response and oxidative stress in children with severe Mycoplasma pneumonia （MPP） and their significance. Methods 74 children with mild MPP and 136 children with severe MPP who admitted to our Department of Pediatrics from June 2019 to June 2022 were selected as the mild MPP group and the severe MPP group respectively，and 80 healthy children were selected as the control group.Serum samples were taken and the serum levels of ferroptosis markers as transferrin receptor 1 （TfR1），Acyl-CoA synthase long chain family member 4 （ACSL4） and glutathione peroxidase 4 （GPX4），inflammatory response markers as C-reactive protein （CRP） and interleukin-6 （IL-6），oxidative stress markers as malondialdehyde （MDA），and lipid peroxide （LPO） were detected，and the differences in serum levels of these indexes among the three groups were compared.The correlations of ferroptosis markers with inflammatory response markers and oxidative stress markers were analyzed.The short-term prognosis of the children with severe MPP was evaluated，and the values of serum ferroptosis markers in diagnosing and predicting prognosis of severe MPP were analyzed. Results The serum levels of TfR1，ACSL4，CRP，IL-6，MDA，and LPO of the children in the severe MPP group were higher than those in the mild MPP group and the control group，while the serum level of GPX4 was lower than that in the mild MPP group and the control group （F=321.061，233.544，839.887，761.429，897.668，585.581 and 196.558 respectively，all Plt;0.05）.In the severe MPP group，the serum levels of TfR1 and ACSL4 were positively correlated with the serum levels of CRP，IL-6，MDA and LPO （r=0.311-0.441，all Plt;0.05），while the serum level of GPX4 was negatively correlated with the serum levels of CRP，IL-6，MDA and LPO （r=-0.413--0.309，all Plt;0.05）.In the severe MPP group，the serum levels of TfR1 and ACSL4 of the children with poor prognoses were higher than those of the children with good prognoses，while the serum level of GPX4 was lower than that of the children with good prognoses （t=5.025，4.535 and 5.440 respectively，all Plt;0.05）.The combination of serum levels of TfR1，ACSL4 and GPX4 had the highest diagnostic value and predictive value for prognosis of severe MPP （for diagnostic value：AUC=0.973，the sensitivity was 95.59% and the speciality was 100%;for predictive value：AUC=0.952，the sensitivity was 86.96% and the speciality was 88.46%）. Conclusion Activation of ferroptosis in children with severe MPP relates with increased inflammation and oxidative stress.Serum ferroptosis markers are indicators for diagnosing severe MPP and predicting the prognosis.

［Key words］ Mycoplasma pneumoniae pneumonia;ferroptosis;inflammatory reactions;oxidative stress;correlation;diagnosis

肺炎支原體肺炎（Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP）是常見的兒童社區獲得性肺炎。雖然多數MMP患兒為輕癥，但近些年關于重癥MMP的報道逐漸增多，重癥MMP病情重、嚴重者可引起死亡［1-2］。肺炎支原體的致病機制包括上皮黏附、毒素釋放、免疫炎癥紊亂等，但具體機制仍不明確，這極大限制了重癥MMP的早期診斷及治療。鐵死亡是一種新發現的細胞程序性死亡方式，以鐵依賴和脂質過氧化為特征，轉鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（Acyl-CoA synthase long chain family member 4，ACSL4）是激活鐵死亡的關鍵分子，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是抑制鐵死亡的關鍵分子［3］。鐵死亡的激活以及TfR1、ASCL4、GPX4表達的異常在肺炎、膿毒癥等感染性疾病中與炎癥反應、氧化應激反應等生物學環節密切相關，這可能是導致炎癥反應加劇、氧化應激損傷的重要因素［4-5］。動物實驗表明，抑制鐵死亡能顯著改善MMP大鼠的肺損傷及炎癥反應、氧化應激反應［6］。為深入認識鐵死亡在MMP發病及病情向重癥MMP發展中的作用，本研究以重癥MMP患兒為對象，檢測血清鐵死亡標志物TfR1、ASCL4、GPX4水平，分析其與重癥MMP患兒炎癥反應、氧化應激的相關性及臨床意義。

1對象與方法

1.1研究對象

選擇2019年6月至2022年6月期間我院兒科收治的210例MPP患兒作為研究對象，納入標準：①符合專家共識中MMP診斷標準［7］，即有肺炎的表現和/或影像學改變，肺炎支原體抗體滴度≥1∶160；②臨床資料完整；③治療前留取血清樣本；④取得患兒家長知情同意。排除標準：①其他病原菌感染所致肺炎；②合并器質性疾病、遺傳性疾病；③正在使用激素、免疫制劑治療；④入院前接受過抗生素治療。參照指南評估MPP的病情嚴重重度，符合重癥MPP標準的患兒納入重癥MPP組、符合輕癥MPP標準的患兒納入輕癥MPP組。另選取同期門診體檢的健康兒童作為對照組，納入標準：①年齡3～12歲；②近1月無咳嗽咳痰、鼻塞流涕、發熱、腹瀉等癥狀；③無基礎疾病、免疫缺陷、遺傳性疾病。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過。重癥MPP組74例，平均年齡（6.51±0.94）歲，男性42例、女性32例；輕癥MPP組136例，平均年齡（6.68±0.89）歲，男性66例、女性70例；對照組80例，平均年齡（6.77±0.97）歲，男性40例、女性40例。3組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2主要試劑及方法

1.2.1檢測試劑

TfR1、ASCL4、GPX4、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、過氧化脂質（Lipid peroxidase，LPO）檢測的酶聯免疫吸附法試劑盒購買于武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2.2檢測方法

MPP患兒于治療前抽取肘靜脈非抗凝血1.5mL，對照組兒童于體檢時抽取肘靜脈非抗凝血1.5mL，靜置15～30min、等待自然凝血，分離上層血清后放入-40℃冰箱保存。統一取出血清樣本在4℃解凍，采用酶聯免疫吸附法試劑盒檢測TfR1、ASCL4、GPX4、CRP、IL-6、MDA、LPO的水平，按照試劑盒說明書進行檢測操作，每份血清樣本設置3個復孔，取3個復孔的平均值作為檢測結果。

1.2.3治療及預后評價

MPP患兒均按照指南給予抗感染、退熱、止咳、平喘等治療措施。輕癥MPP患兒抗感染方案為阿奇霉素10mg/kg、靜滴、1次/日，連續3d；重癥MPP患兒抗感染方案為阿奇霉素10mg/kg、靜滴、1次/日，連續5～7d。參照指南評價療效，療效達到治愈、顯效、好轉的重癥MPP患兒判斷為預后良好（n=51），療效為無效或病情加重的重癥MPP患兒判斷為預后不良（n=23）。

1.3統計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理，計量資料進行正態性檢驗、均符合正態分布，以均數±標準差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析、有統計學差異的資料進一步采用LSD-t法進行兩兩比較；相關性分析采用Pearson檢驗；血清鐵死亡標志物診斷重癥MPP、預測重癥MPP預后采用ROC曲線及曲線下面積（AUC）進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1三組間血清鐵死亡標志物的比較

輕癥MPP組和重癥MPP組患兒的血清TfR1、ASCL4含量高于對照組，GPX4含量低于對照組（P＜0.05）；重癥MPP組患兒的血清TfR1、ASCL4含量高于輕癥MPP組，GPX4含量低于輕癥MPP組（P＜0.05），見表1。

2.2三組間血清炎癥指標、氧化應激指標的比較

輕癥MPP組和重癥MPP組患兒的血清CRP、IL-6、MDA、LPO含量高于對照組（P＜0.05）；重癥MPP組患兒的血清CRP、IL-6、MDA、LPO含量高于輕癥MPP組（P＜0.05），見表2。

2.3血清鐵死亡標志物與炎癥指標、氧化應激指標的相關性

重癥MPP組患兒的血清TfR1、ACSL4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈正相關，GPX4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈負相關，見表3。

2.4血清鐵死亡標志物診斷重癥MPP的效能

血清TfR1、ASCL4、GPX4單獨及三者聯合診斷重癥MPP的ROC曲線見圖1，分析結果顯示：血清TfR1、ASCL4、GPX4單獨診斷重癥MPP的AUC分別為0.791、0.807及0.789，三者聯合診斷重癥MPP的AUC為0.973，見表4。

2.5重癥MPP組血清鐵死亡標志物與預后的關系

重癥MPP組中死亡患兒的血清TfR1、ACSL4含量高于存活患兒，GPX4含量低于存活患兒（P＜0.05），見表5。

2.6血清鐵死亡標志物對重癥MPP預后的預測效能

血清TfR1、ASCL4、GPX4單獨及三者聯合預測重癥MPP預后的ROC曲線見圖2，分析結果顯示：血清TfR1、ASCL4、GPX4單獨預測重癥MPP預后的AUC分別為0.811、0.772及0.838，三者聯合預測重癥MPP預后的AUC為0.952，見表6。

3討論

重癥MPP病情重、預后差、死亡風險高［8-9］。目前臨床上缺乏早期診斷重癥MPP以及評價重癥MPP預后的標志物，不利于重癥MPP的盡早識別、盡早干預。

3.1鐵死亡的生物學特征

鐵死亡是一種在不同肺疾病、感染性疾病中均發揮生物學作用的新型細胞死亡方式，不僅通過介導細胞死亡的途徑導致臟器和組織損傷，還與炎癥反應、氧化應激等存在密切關系并能加重組織的炎癥性損傷和氧化性損傷［10-12］。鐵死亡以鐵依賴性脂質過氧化為特征，分子生物學上表現為TfR1、ACSL4、GPX4等基因表達異常。TfR1介導鐵的轉運和內吞進入細胞，能夠啟動細胞的鐵死亡過程；ACSL4是細胞膜中多不飽和脂肪酸延長的關鍵酶，ACSL4將多不飽和脂肪酸轉化為多不飽和脂肪酸-磷脂酰乙醇胺的過程是產生鐵死亡信號的必要條件；GPX4能夠減輕脂質過氧化，對細胞鐵死亡具有抑制作用［13-15］。

3.2鐵死亡與MPP

MPP相關的基礎研究證實肺炎支原體感染的肺炎大鼠體內鐵死亡顯著激活，抑制鐵死亡減輕肺炎支原體感染引起的肺損傷［6］。基于此，本研究將鐵死亡標志物作為MPP標志物展開分析，重癥及輕癥MPP患兒的血清TfR1、ACSL4含量增加，GPX4含量降低，表明在MPP發病過程中存在鐵死亡的激活，與動物實驗中肺炎支原體感染激活鐵死亡的結果吻合。本研究中，重癥MPP組的血清CRP、IL-6、MDA、LPO均高于輕癥MPP組和對照組，提示重癥MPP發病過程中存在炎癥反應和氧化應激反應的激活。進一步進行相關性分析顯示：激活鐵死亡的TfR1、ACSL4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈正相關，抑制鐵死亡的GPX4與CRP、IL-6、MDA、LPO呈負相關，表明重癥MPP的發生發展過程中鐵死亡的激活與炎癥反應、氧化應激反應均密切相關，激活炎癥反應、氧化應激反應可能是鐵死亡導致MPP病情加重、輕癥MPP發展至重癥MPP的相關機制。

綜上所述，重癥MPP患兒的鐵死亡顯著激活，血清鐵死亡標志物TfR1、ACSL4增多，GPX4降低；鐵死亡激活與炎癥反應、氧化應激加重相關。血清鐵死亡標志物TfR1、ACSL4、GPX4聯合使用對重癥MPP具有較好的診斷效能、對重癥MPP預后具有較好的預測效能。

［參考文獻］

［1］Biagi C，Cavallo A，Rocca A，et al.Pulmonary and Extrapulmonary Manifestations in Hospitalized Children with Mycoplasma Pneumoniae Infection［J］.Microorga-nisms，2021，9（12）：2553.

［2］Desai S，Hall M，Lipsett S C，et al.Mycoplasma Pneumoni-ae Testing and Treatment Among Children With Community-Acquired Pneumonia［J］.Hospital Pediatrics，2021，11（7）：760-763.

［3］Tang D，Chen X，Kang R，et al.Ferroptosis：molecular mechanisms and health implications［J］.Cell Res，2021，31（2）：107-125.

［4］Li Z，Yu Y，Liu C，et al.Identification of the key ferroptosis-related genes involved in sepsis progression and experimental validation in vivo［J］.Frontiers in Pharmaco-logy，2022，13：940261.

［5］Xu B，Wang H，Chen Z.Puerarin Inhibits Ferroptosis and Inflammation of Lung Injury Caused by Sepsis in LPS Induced Lung Epithelial Cells［J］.Frontiers in Pediatrics，2021，9：706327.

［6］趙麗娜，葛國嵐，李靖，等.蛇床子素通過Nrf2-Gpx4鐵死亡途徑對肺炎支原體肺炎大鼠肺損傷的改善作用［J］.中成藥，2023，45（1）：48-54.

［7］中華醫學會兒科學分會呼吸學組，《中華實用兒科臨床雜志》編輯委員會.兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）［J］.中華實用兒科臨床雜志，2015，30（17）：1304-1308.

［8］Chen L，Yin J，Liu X，et al.Thromboembolic complications of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children［J］.The clinical respiratory journal，2023，17（3）：187-196.

［9］黎念.兒童重癥肺炎支原體肺炎的臨床特點及預后［J］.中國全科醫學，2019，22（S2）：61-64.

［10］Xiao L，Huang H，Fan S，et al.Ferroptosis：A mixed blessing for infectious diseases［J］.Frontiers in Pharmacology，2022，13：992734.

［11］Li Y，Yang Y，Yang Y.Multifaceted Roles of Ferroptosis in Lung Diseases［J］.Frontiers in Molecular Biosciences，2022，9：919187.

［12］Bagayoko S，Meunier E.Emerging roles of ferroptosis in infectious diseases.［J］.The FEBS journal，2021，289（24）：7869-7890.

［13］Ding H，Chen S，Pan X，et al.Transferrin receptor 1 ablation in satellite cells impedes skeletal muscle regeneration through activation of ferroptosis［J］.Journal of cachexia，sarcopenia and muscle，2021，12（3）：746-768.

［14］Yu S，Li Z，Zhang Q，et al.GPX4 degradation via chaperone-mediated autophagy contributes to antimony-triggered neuronal ferroptosis.［J］.Ecotoxicology and environmental safety，2022，234：113413.

［15］Liu L，Kang X.ACSL4 is overexpressed in psoriasis and enhances inflammatory responses by activating ferroptosis［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2022，623：1-8.