不同氮肥與糖蜜配施對煙田土壤酶活性、溫度和微生物群落的影響

李佳 李云捷 陳振國 喻雪婧 云月利 朱蓉 李亞東

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.036

摘要：為探究不同種類氮肥與糖蜜配施對煙草根際土壤環境的影響，以湖北省利川市海拔1 200 m處的植煙土壤為研究對象，以煙草專用肥為對照，探究了不同施肥組合對土壤微生物群落結構的變化以及對土壤酶活性和土壤溫度的影響。結果表明：（1）土壤微生物測序結果表明，多肽能夠提高硝化螺旋菌門的相對豐度，糖蜜的添加顯著提高了微生物種群的數量和多樣性；（2）氨基酸母液粉能顯著提高脲酶活性（P<0.05），其中氨基酸母液粉與 150 kg/hm2 糖蜜（M2）處理的脲酶活性最高，與對照組相比增加了68.5%；糖蜜的施加能顯著提高蔗糖酶活性（P<0.05），多肽與450 kg/hm2糖蜜（T4）處理的蔗糖酶活性最高，與對照組相比增加了63.1%；（3）糖蜜的施加能快速提高苗期土壤溫度，煙苗移栽7 d后多肽與450 kg/hm2糖蜜（T4）處理土壤溫度最高，與煙草專用肥處理組相比提高了 2.07? ℃；（4）相關性分析結果表明，土壤溫度與微生物數量之間存在極顯著的正相關關系（P<0.01），土壤中脲酶活性與土壤溫度顯著相關（P<0.05），蔗糖酶活性與土壤溫度極顯著相關（P<0.01）。研究表明，多肽與450 kg/hm2糖蜜配施能夠通過改良煙田土壤微生物群落結構，提高硝化螺旋菌門的物種豐度和化能異養型細菌功能的占比，增強土壤脲酶與蔗糖酶的活性，在煙草種植苗期提高煙田土壤溫度，在解決高海拔地區低溫導致的煙草苗期生長緩慢方面具有實際生產意義。

關鍵詞：土壤；微生物；溫度；酶活性；氮源；糖蜜

中圖分類號：S572.606? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0260-08

收稿日期：2023-11-07

基金項目：湖北省重點研發計劃（編號：2023BCB077）。

作者簡介：李? 佳（1999—），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向為煙草栽培與土壤改良。E-mail：1154772796@qq.com。

通信作者：李亞東，博士，教授，博士研究生導師，研究方向為微生物工程、環境生態學、蛋白廢棄物資源化利用。E-mail：lyd55555@sina.com。

煙草是我國重要的經濟作物，是卷煙工業的基礎，煙葉的產量和質量直接影響著煙草的種植收益［1］。近年來，由于煙田長期連作、化肥的不科學使用導致煙田土壤板結酸化，嚴重影響作物的生長發育與品質，具體表現為土壤有機質含量下降、pH值降低、土壤微生態失去平衡等［2］。其原因主要是高山地區煙草苗期溫度過低，煙農通常使用覆膜的方法保證煙苗生長的溫度，地膜的殘留部分在土壤中逐年堆積、難以分解，導致土壤板結、通透性變差、土壤微生物活性降低，影響煙株對養分的吸收，造成煙葉產量品質下降，煙田土壤肥力降低［3］。因此，如何增強高海拔地區土壤溫度、降低連作障礙、提高煙葉質量成了煙草生產中一個亟待解決的問題。

對于不同海拔的植煙土壤而言，由于土壤的理化性質、養分供應狀況、酶活性與微生物群落動態不盡相同，對煙株生長發育進程造成的影響也不同［4］。煙草是一種喜溫作物，最適溫度為25～28 ℃，而煙苗種植時期在5月上旬，氣溫通常達不到煙苗生長所需的標準［5］。土壤溫度對煙草前期生長發育和煙葉品質具有重要影響，高海拔煙區土壤溫度過低會導致同化物質的轉化和積累受到抑制，肥料利用速率下降，煙草生長緩慢，妨礙煙葉正常成熟，而生產出劣質煙葉［6-8］。在農業生產中，通常使用覆膜、深耕等方式來提高土壤溫度。目前關于烤煙地膜覆蓋栽培與深耕栽培等方面已有大量研究，初步探明了提高溫度能夠促進植株對肥料的利用效率、加快煙株生長，提高煙葉的產量和品質［9-11］。土壤溫度作為影響土壤微生物群落結構的重要因素，與土壤的理化性質以及養分利用效率密切相關［12-13］。現有的研究主要集中在通過改變栽培方式來增強土壤的保溫保墑能力，但通過改良施肥組合來提高土壤溫度并系統探究溫度與酶活性和土壤微生物群落結構三者之間相互關系的研究還相對較少。

Morley等研究發現，土壤中的有機質能為大多數異養微生物提供碳源，并為土壤呼吸作用提供基質，添加碳源能夠增強土壤呼吸強度并顯著增加土壤微生物量，通過微生物生長代謝活動產生的生物熱能有效提高煙田土壤溫度［14-16］。為此，本研究以高海拔地區植煙土壤為切入點，以煙草種植的專用肥（硝態氮）、多肽（蛋白氮）、氨基酸母液粉（氨基酸氮）作為土壤微生物的氮源，配施微生物生長的碳源——糖蜜（糖廠下腳料，含糖量50%），通過研究不同氮源與不同用量的糖蜜結合配施的方式，探討微生物群落結構與土壤酶活性和土壤溫度三者的相互作用關系，旨在探究一種新型肥料對煙田土壤環境的改良作用，為保證高海拔地區煙苗發育溫度和促進煙苗前期生長提供理論依據和科學指導。

1? 材料與方法

1.1? 土壤背景概況

本試驗于2023年5月對位于湖北省利川市柏楊壩鎮海拔1 200 m處的大田植煙土壤進行分析，植煙品種為云煙87，供試土壤類型為黃棕壤，土壤基本理化性質見表1。

1.2? 肥料的理化性質

本研究所用的氨基酸母液粉與多肽肥是筆者所在實驗室自主研發的新型有機肥料，是將動物羽毛等蛋白廢棄物，在高溫條件下水解轉化成全水溶性的多肽和氨基酸等小分子物質；所用的液體氨基酸肥是將蛋白廢棄物用強酸水解為小分子物質，使用氫氧化鉀中和；煙草專用肥購自史丹利農業集團股份有限公司；糖蜜購自山東長惠化工有限公司，為制糖工業下腳料，主要成分為蔗糖。肥料的理化性質詳見表2。

1.3? 試驗設計

本試驗共設4種氮肥處理：煙草專用肥（硝態氮）、氨基酸母液粉（氨基酸氮）、液體氨基酸肥（液體氨基酸氮）、多肽（蛋白氮），以煙草專用肥作對照，按照施氮肥90 kg/hm2，氮磷鉀比例為1 ∶1 ∶1.5配施磷肥與鉀肥，磷肥為過磷酸鈣，鉀肥為硫酸鉀。同時對多肽組合設4種不同用量的糖蜜作底肥處理，具體試驗設計組合見表3。每個處理設置30個生物學重復。

1.4? 土壤酶活性測定

過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法，蔗糖酶活性的測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法［17］。

1.5? 土壤溫度測定

使用 HC-D40 型號土壤熵情檢測器，測量移栽后 28 d 內的煙苗根部土壤溫度。為減少太陽光照對土壤溫度的影響，選擇每日20：00進行測量，嚴格控制每日測量時間，時間誤差不超過10 min［18］。

1.6? 土壤樣品采集

采樣時間為移栽后28 d，采用五點取樣法從煙株根部取混合樣作為1個處理的代表樣品，每個處理設置3次重復，將采集的土樣保存于-80 ℃冰箱中用于微生物測序。

1.7? 土壤微生物測序

本研究基于Illumina NovaSeq測序平臺對文庫進行雙末端測序，使用CTAB法從樣品中提取總DNA，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品DNA的濃度和純度，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量。文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。對測序得到的有效數據進行物種注釋以及豐度分析，揭示樣本的物種構成，探究不同施肥處理間微生物種群結構差異。

1.8? 數據分析

使用Qiime軟件（version 1.9.1）計算微生物多樣性指數；使用R軟件（version 2.15.3）繪制稀釋曲線、豐度等級曲線和物種累積曲線；使用R軟件進行α多樣性指數組間差異分析；使用Origin 2022、SPSS 22.0等軟件進行數據處理和多因素方差分析；使用Spearman分析土壤微生物多樣性指數與土壤溫度和土壤酶活性之間的相關性。

2? 結果與分析

2.1? 不同施肥處理后土壤酶活性差異比較

由圖1可以看出，不同施肥處理后，土壤酶活性有顯著差異。由圖1-a可以看出，不同處理之間，氨基酸母液粉與150 kg/hm2糖蜜處理的脲酶活性最高，與對照組相比顯著增加486 μg/（g·d）。對比不同種類氮肥對脲酶活性的影響，與煙草專用肥相比，施加氨基酸母液粉的組合脲酶活性顯著增加了253 μg/（g·d），施加多肽組合脲酶活性顯著增加了176 μg/（g·d），施加液體氨基酸對脲酶活性沒有顯著影響。比較不同用量糖蜜對脲酶活性的影響，施加150、300、450 kg/hm2糖蜜土壤脲酶活性均有顯著增加，其中施加150 kg/hm2糖蜜脲酶活性最高，增加糖蜜用量后，脲酶活性略有下降，但降幅不顯著。

由圖1-b可以看出，不同處理之間，多肽與450 kg/hm2糖蜜處理的蔗糖酶活性最高，與對照組相比顯著增加9.97 mg/（g·d）。對比不同種類氮肥對蔗糖酶活性的影響，與煙草專用肥相比，施加氨基酸母液粉的組合蔗糖酶活性顯著增加了 3.46 mg/（g·d），施加多肽的組合蔗糖酶活性增加了2.33 mg/（g·d），施加液體氨基酸對蔗糖酶活性沒有顯著影響。比較不同用量糖蜜對蔗糖酶活性的影響可以看出，隨糖蜜施加量增加，土壤蔗糖酶活性呈增加趨勢，其中施加450 kg/hm2糖蜜蔗糖酶活性最高。

由圖1-c可以看出，不同處理之間，多肽與300 kg/hm2糖蜜處理的過氧化氫酶活性最高，其次為氨基酸母液粉不施加糖蜜處理。對比不同種類氮肥對過氧化氫酶活性的影響，氨基酸母液粉處理顯著高于其他氮肥處理。比較不同用量糖蜜對過氧化氫酶活性酶活性的影響發現，隨施加糖蜜量增加，過氧化氫酶活性呈增加趨勢，施加300 kg/hm2糖蜜時過氧化氫酶活性顯著最高，繼續增加糖蜜用量后，酶活性降低。

2.2? 不同施肥處理后土壤溫度差異比較

分析不同施肥處理后土壤溫度的變化規律，結果如圖2所示，移栽后28 d內不同種類氮肥處理及不同用量糖蜜處理后的土壤溫度均存在一定差異，但不同日期的溫度差異有所不同。由圖 2-a 可以看出，不同種類氮肥處理對土壤溫度具有一定影響，移栽后7 d各處理間溫度差異達到最大。在煙苗移栽1周后使用氨基酸母液粉施肥處理的土壤溫度最高，顯著高于煙草專用肥處理1.47 ℃；在煙苗移栽2周后，使用多肽施肥處理的土壤溫度最高，顯著高于煙草專用肥處理0.93 ℃；隨著移栽時間的增加，各處理間土壤溫度差異逐漸降低，當煙苗移栽28 d后，不同氮肥處理后的土壤溫度無顯著差異。由圖2-b可以看出，不同用量的糖蜜對土壤溫度的

影響更為明顯，在煙苗移栽前期，土壤溫度與施加糖蜜的總量呈顯著正相關，煙苗移栽1周后，施加450 kg/hm2糖蜜處理土壤溫度比不施加糖蜜高1.14 ℃，比煙草專用肥處理提高2.07 ℃；煙苗移栽2周后，施加450 kg/hm2糖蜜處理土壤溫度顯著高于不施加糖蜜處理 0.84 ℃；煙苗移栽3周后，各處理間土壤溫度差異逐漸降低，當煙苗移栽28 d后，不同用量糖蜜處理后的土壤溫度無顯著差異。這表明在煙苗移栽前期，氨基酸母液粉與多肽能有效提高土壤溫度，施加糖蜜對短期內提高煙田土壤溫度具有明顯效果。

2.3? 煙田土壤微生物多樣性

2.3.1? 土壤微生物OTU分析

為研究不同施肥處理后煙田土壤的微生物物種組成，對所有處理樣本的有效序列以97%的一致性進行稀釋性曲線分析，結果如圖3-a所示，隨著樣品數量的增加，各個樣本曲線均趨于平穩，這說明根際微生物群的細菌種類達到飽和階段；稀釋性曲線可以表明本研究測序數據量的合理性，可以看出，T4 處理樣本物種數量最多，這說明多肽與450 kg/hm2糖蜜配施提高了土壤微生物種群的數量。豐度等級曲線可用來解釋物種豐度和物種均勻度，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平緩程度）反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，則表明物種分布越均勻。如圖3-b所示，T4處理物種豐度最高且微生物種群分布更均勻。

2.3.2? 土壤微生物物種組成

不同處理中優勢細菌相對豐度如圖4所示。從門水平（圖4-a）上看，不同處理間共同的優勢菌門主要有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes），占全部序列的69.63%～82.87%，對比M1和M2、A1和A2、T1和T2處理可以看出，添加糖蜜有效增加了土壤微生物的物種豐富度。其中，變形菌門作為細菌中最大的門，廣泛存在于自然界中的土壤、水體和動物體內等環境中，其具有一系列重要的生物功能，例如在氮循環、有機物分解、土壤修復等生態過程中起到重要作用［19］，變形菌門作為相對豐度最高（47.25%～65.82%）的優勢菌門，在純液體氨基酸處理中相對豐度高于其他組合。從屬水平（圖4-b）上看， 對相對豐度前 20 名的細菌組成進行分析，

可以看出，多肽處理的組合中硝化螺旋菌屬（Nitrospira）的相對豐度明顯高于對照組。硝化螺旋菌屬于亞硝酸鹽氧化細菌，在陸地環境中普遍存在，并且在農業土壤的生物氮循環和硝化作用中發揮重要作用，硝化螺旋菌屬在多肽處理中豐度較高，表明多肽的施加使煙田土壤中氮循環發生了改變。

2.3.3? 土壤微生物α多樣性分析

對不同樣本在97%一致性閾值下的α多樣性分析指數進行統計，由表4可知，各處理土壤樣品覆蓋度均達到0.99，說明測序結果的真實情況良好；Chao1指數是菌種豐富度指數，添加糖蜜處理的Chao1指數高于CK，其中T4處理細菌 Chao1 指數高于T1、T2和T3處理，這說明增加糖蜜用量能夠提升細菌豐富度；M2處理Shannon指數高于M1處理，A2處理 Shannon指數高于A1處理，T4處理Shannon指數高于T1、T2和T3處理， 這說明施加糖蜜有助于提高群落多樣性以及物種分布均勻程度。α多樣性分析指數表明，施加糖蜜有助于提高煙草苗期煙田土壤微生物豐富度與多樣性。

2.3.4? 煙田土壤細菌群落功能

本研究使用FAPROTAX數據庫，能較好地預測環境樣本中原核生物的生物化學循環過程［20］，揭示煙田土壤在不同施肥處理后細菌群落的生態功能，進一步探究不同氮肥與糖蜜的結合對煙田土壤細菌群落生化過程的改變。基于FAPROTAX數據庫功能注釋，本研究選取豐度排名前20的功能繪制聚類熱圖，如圖5所示，與對照組相比，施加糖蜜有助于提高化能異養型和好氧化能異養型細菌功能的占比，這些功能可以消化分解土壤中的有機物釋放能量［21］。其中T4處理明顯提高了與氮循環相關功能的豐度，如亞硝酸鹽反硝化、氮呼吸、硝酸鹽反硝化、硝酸鹽呼吸、硝酸鹽還原等功能，這些微生物的生命代謝活動給土壤提供大量熱量。

2.4? 土壤溫度與微生物多樣性指數和土壤酶活性的相關性分析

對土壤溫度與土壤微生物多樣性指數和土壤酶活性進行相關性分析，由表5中結果可知，土壤溫度與細菌 Chao1 指數存在顯著正相關關系（P<0.05），與ACE指數存在極顯著的正相關關系（P<0.01），相關系數達0.829；土壤溫度與脲酶活性存在顯著正相關關系，相關系數達0.785（P<0.05），與蔗糖酶活性存在極顯著正相關關系（P<0.01），相關系數達0.938。脲酶活性與細菌ACE指數存在顯著的正相關關系（P＜0.05）；蔗糖酶活性與細菌Chao1指數和ACE指數存在極顯著的正相關關系（P＜0.01），相關系數分別達0.826、0.828；而過氧化氫酶活性與土壤微生物多樣性指數相關性不顯著。這說明多肽和氨基酸母液粉與糖蜜配施，能夠有效通過提高土壤微生物種群多樣性與酶活性來實現土壤溫度的提高。

3? 討論

本試驗以1 200 m高海拔地區植煙土壤為研究對象，利用 Illumina 高通量測序檢驗不同施肥處理后煙田土壤的微生物群落結構，結合不同處理土壤酶活性與土壤溫度的差異做相關性分析，探究糖蜜與不同種類氮肥結合配施對提高高海拔地區煙田土壤溫度的作用。結果表明，使用多肽代替煙草專用肥，并適量添加糖蜜配施能夠提高土壤微生物種群的數量和多樣性，并提高土壤酶活性與溫度。土壤微生物是衡量土壤有效養分的重要指標，是植物吸收養分的重要驅動者，在養分的轉化和供應方面起重要作用［22］。相關研究表明，糖蜜的添加能夠增強微生物對碳源的利用能力和代謝能力，本試驗使用糖蜜作為土壤的外加碳源，能有效改良煙田土壤的微生物群落結構，其原理是不同的微生物對不同的碳源利用效率不同，這與楊泳等的研究結果［23］一致。糖蜜和多肽的施入為土壤微生物的生命活動提供充足的碳源和氮源，土壤細菌的數量明顯增多［24］。對比不同處理后微生物群落結構差異，多肽與糖蜜配施明顯提高了氮循環功能微生物的相對豐度，根際土壤細菌的優勢屬為硝化螺旋菌，其屬于亞硝酸鹽氧化細菌，在農業土壤的生物氮循環和硝化作用中發揮重要作用［25］。

土壤酶與微生物一起參與土壤的生物化學過程和物質循環，與土壤的代謝過程密切相關，是土壤養分轉化的重要標志［26-27］。本研究結果表明，微生物種群數量與脲酶活性呈現顯著正相關關系，與蔗糖酶活性呈現極顯著正相關關系，微生物多樣性與蔗糖酶活性呈現顯著正相關關系；而過氧化氫酶與土壤微生物多樣性指數無明顯相關。土壤脲酶在土壤有機物氮鍵的水解作用中起重要作用，其活性增強能夠有效促進土壤中的有機氮轉化為有效的無機氮被植株吸收利用，通常用來表征土壤氮素的供應狀況，因此脲酶活性的增強對于提高煙田土壤肥力、生態系統生產力以及促進土壤生態系統中的物質循環極為關鍵［28］；而土壤蔗糖酶活性與土壤中營養元素含量、微生物數量及土壤呼吸強度密切相關，可以作為評價土壤肥力的重要指標［29］。本研究結果表明，土壤脲酶活性與多肽以及糖蜜的添加具有顯著相關性。究其原因是土壤脲酶活性隨土壤養分含量的增加而變大，土壤全氮和有機質含量通過直接和間接效應成為土壤脲酶活性的主要影響因素［30-31］。這與董齊琪等的研究結果［32］相一致。

本研究通過改良施肥組合來達到提高煙田土壤溫度促進植物生長的目的，分析土壤微生物多樣性指數與土壤溫度的關系發現，土壤溫度與微生物種群和數量顯著相關。研究結果表明多肽與糖蜜的配施能改變土壤微生物種群結構，大幅提高微生物數量以及土壤中脲酶和蔗糖酶活性，這說明施肥組合的改良能夠影響土壤性質［33］。此外，土壤微生物在生長活動過程中產生的代謝物質能夠促進土壤有機質的分解，這使得土壤的理化性質發生改變，土壤酶活性增加，又對微生物的呼吸代謝活動產生影響［34-36］，這些影響可能是提高煙田土壤溫度、改善土壤品質的重要原因。

4? 結論

（1）比較不同施肥組合下土壤脲酶活性差異，不同種類氮肥對脲酶活性的影響顯著，氨基酸母液粉與150 kg/hm2糖蜜處理的脲酶活性最高，與對照組相比增加了68.5%；比較不同施肥組合下土壤蔗糖酶活性差異，糖蜜用量對蔗糖酶活性影響顯著，隨糖蜜施加量增加，土壤蔗糖酶活性呈增加趨勢，其中多肽與450 kg/hm2糖蜜處理蔗糖酶活性最高，與對照組相比增加了 63.1%；比較不同施肥組合下土壤過氧化氫酶活性差異，多肽與300 kg/hm2糖蜜處理的過氧化氫酶活性最高，與對照組相比增加了30.0%。

（2）分析不同施肥處理后土壤溫度的變化規律，結果表明，施加不同用量的糖蜜對土壤溫度的影響較大，在煙苗移栽前期，土壤溫度與施加糖蜜的用量呈正相關，在煙苗移栽7 d后，各處理間土壤溫度差異達到最大，多肽與450 kg/hm2 糖蜜處理土壤溫度最高，與煙草專用肥處理組相比提高了2.07 ℃。

（3）不同施肥組合下煙田土壤微生物群落結構存在差異，糖蜜的添加顯著提高了微生物種群的數量和多樣性，其中多肽與450 kg/hm2糖蜜配施處理的微生物數量與多樣性指數最高。使用 FAPROTAX 數據庫對土壤微生物測序結果進行預測，結果表明，與煙草專用肥對比，施加氨基酸母液粉與多肽可以提高與氮循環相關的功能豐度，施加糖蜜有助于提高化能異養型和好氧化能異養型細菌功能的相對豐度。

（4）對不同土壤溫度與土壤微生物多樣性指數和酶活性進行相關性分析，結果表明，土壤溫度與微生物數量存在極顯著的正相關關系，微生物種群數量增加對土壤溫度具有顯著影響；微生物種群數量對脲酶活性也具有顯著影響；微生物數量和多樣性均對蔗糖酶活性具有顯著影響；而過氧化氫酶與土壤微生物多樣性指數無明顯相關性。

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