加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異性分析

孫正光 席高磊 王澤寧 楊鵬飛 王秋領 楊靖 陳芝飛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.027

摘要：為揭示加拿大和云南優質煙葉中性香味成分的差異，使用同時蒸餾萃取（SDE）和液-液萃取法（LLE）獲得2種煙葉的中性香味成分，利用氣相色譜-質譜（GC-MS）分析中性香氣成分的種類和含量，通過正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）明確2種煙葉中性香味成分的差異性。結果表明，加拿大煙葉共鑒定出59種中性香味成分，總含量為92.02 μg/g，云南煙葉共鑒定出63種中性香味成分，總含量為113.91 μg/g；云南煙葉中類胡蘿卜素降解產物含量高于加拿大煙葉，加拿大煙葉中棕色化反應產物類和其他類成分含量高于云南煙葉；基于OPLS-DA法中重要性投影值（VIP>1）共篩選出18種差異中性香味成分，其中云南煙葉香氣貢獻率較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇；加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。得出OPLS-DA方法能較好地區分加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異，可以為煙葉產地的溯源提供方法支撐。

關鍵詞：煙葉；萃取；中性香味成分；正交偏最小二乘法判別分析；差異性分析

中圖分類號：S572.01? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0197-06

收稿日期：2023-06-20

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：81903507）；河南中煙工業有限責任公司科技項目（編號：2021410001300094）。

作者簡介：孫正光（1998—），男，云南大理人，碩士研究生，主要從事煙草香精香料研究。E-mail：zgsun914@163.com。

通信作者：王秋領，高級工程師，主要從事香精香料和煙草化學研究，E-mail：jrwql395139@sina.com；陳芝飛，碩士，研究員，主要從事香精香料和煙草化學研究，E-mail：chenzhifei@126.com。

加拿大煙葉具有特征性強、香氣優雅、勁頭適宜等特點，在卷煙葉組配方中作為主料煙使用時，具有提升卷煙香氣格調、收斂煙氣和柔和吸味的作用。目前，加拿大煙葉僅在我國一二類卷煙品牌（如利群等）的葉組配方中使用，占比為5%左右，對鞏固和彰顯卷煙醇和淡雅、柔綿細膩的風格特征貢獻較大［1］。因此，明確加拿大與國內優質煙葉的香味成分差異，詮釋其不同風格特征的物質基礎，能為加拿大煙葉的替代工作提供有效支撐，促進國家煙草行業的高質量發展。

卷煙抽吸品質是多種致香物質協同作用的結果［2-3］。李炎強等對云南煙葉香味成分進行深入的分離鑒定研究，以了解云南煙葉感官特征與物質組成的關系［4］；陳晨等利用國內卷煙中性和堿性香味成分的差異性有效區分了不同風格類型的卷煙［5-6］。傳統可視化分析為無監督的多元變量統計，且無法獲得特征差異性物質［7］，而正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）將正交信號矯正（OSC）與偏最小二乘判別分析（PLS-DA）相結合，為有監督的判別分析，能有效去除不相關的差異因素來篩選組間的差異變量［8］。貊志杰等運用 OPLS-DA判別分析方法探究了不同烤煙品種石油醚提取物的差異性，有效區分了其香韻風格形成的物質基礎［9］；Esteves等利用OPLS-DA法快速高效準確地對不同蘑菇樣本進行了鑒定區分［10］；Huang等通過OPLS-DA法分析了品種、栽培方法和產地對紅江柑橘揮發性成分的影響及其差異性［11］。因此，本研究利用OPLS-DA法對比分析加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異性，以期為進口優質煙葉的替代和開發提供數據支撐和方法途徑。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器與試劑

（1）儀器：高速多功能粉碎機（2500Y，永康市鉑歐五金制品有限公司）、氣相色譜-質譜聯用儀（8890-5977B，美國安捷倫科技有限公司）、同時蒸餾萃取裝置（鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司）、低溫冷卻液循環泵（DLSB-5-20，鄭州長城科工貿有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（HH-S2，江蘇金怡儀器科技有限公司）、調溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業儀器有限公司）。

（2）試劑材料：二氯甲烷（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司）、鹽酸、無水硫酸鈉、氫氧化鈉（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）、2，6-二氯甲苯（98.6%，北京百靈威科技有限公司）；A1～A5為加拿大煙葉，B1～B5為云南煙葉，均為C3F等級（河南煙草工業有限責任公司提供）。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 同時蒸餾萃取（SDE）和液-液萃取法（LLE）獲得煙葉中性成分

將加拿大和云南煙片分別用多功能粉碎機打碎成煙末，稱取30.0 g煙末于1 000 mL圓底燒瓶中并加入400 mL純凈水，250 mL 茄型瓶中放入100 mL二氯甲烷，同時蒸餾萃取2.5 h得到二氯甲烷萃取液。二氯甲烷經5%NaOH堿洗5次，5%HCl酸洗5次后獲得中性成分萃取液（20 mL/次）。中性成分萃取液經無水Na2SO4干燥后常壓濃縮至1 mL，加入100 L 2，6-二氯甲苯（0.556 7 mg/mL）內標溶液后通過GC-MS進行化學成分分析。

1.2.2? 中性成分的GC-MS檢測條件

色譜條件：Agilent DB-5 MS毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進行口溫度：280 ℃；載氣：99.999%高純度氦氣，流速：1.0 mL/min；進樣量為1.0 μL；分流模式為分流進樣，分流比為2 ∶1。升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持10 min；2.5 ℃/min升至190 ℃，保持25 min；1.5 ℃/min升至270 ℃，保持0 min。

質譜條件：采用SCAN模式，傳輸線溫度為 280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為 150 ℃；離子源為XTR-EI源，電子能量為70 eV；溶劑延遲時間為8 min；掃描范圍：35～550 amu。

1.2.3? 數據分析

NIST 20譜庫檢索結合保留指數對比分析進行化合物定性分析；采用內標-半定量法進行定量分析；Origin 2018繪制雷達圖，結合中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統繪制中性成分指紋圖譜；SIMCA 14.1進行OPLS-DA分析并計算重要性投影值（VIP）；用SPSS 27.0 進行獨立樣本t檢驗計算P值；用TBtools繪制聚類熱圖。

2? 結果與分析

2.1? 煙葉中性香味成分指紋圖譜

根據色譜組分保留時間及豐度繪制煙葉中性成分指紋圖譜，具體如圖1所示，不同地區煙葉中性成分種類基本相似，但含量存在明顯差異性。

2.2? 煙葉中性香味成分總體情況

經譜庫檢索和保留指數定性分析，加拿大煙葉共鑒定出83種化合物，而云南煙葉共鑒定出89種。其中，中性香味物質共69種，加拿大煙葉59種（總含量92.02 μg/g），云南煙葉63種（總含量 113.91 μg/g）（表1）。加拿大煙葉中類胡蘿卜素降解形成的香味成分共18種，西柏烷類降解形成的香味成分1種，棕色化反應形成的香味成分10種，苯丙氨酸轉化產物4種，其他類26種；與之對應，云南煙葉中不同種類的香味成分分別為19、1、11、4、28種。由圖2可知，加拿大煙葉各成分占比表現為類胡蘿卜素類降解產物＞其他類＞西柏烯類降解產物＞棕色化反應產物類＞苯丙氨酸類降解產物，云南煙葉表現為中類胡蘿卜素類降解產物＞西柏烯類降解產物＞苯丙氨酸類降解產物＞其他類＞棕色化反應產物類。

云南煙葉風格特征主要表現為清甜香韻，香氣飄逸；加拿大煙葉則表現為焦甜香韻，香氣濃郁豐滿，透發性強。云南煙葉中類胡蘿卜降解產物含量占比最高且遠高于加拿大煙葉，這類成分是云南煙葉清香風格的主要內在因素［12］。加拿大煙葉的棕色化反應產物類含量明顯高于云南煙葉，這是加拿大煙葉呈現焦甜感，形成濃香風格的成因之一。

2.3? 煙葉中性香味成分差異性

為明確加拿大和云南煙葉中性香味成分的差異性，以69種中性香味成分和不同地區作為因自變量，通過OPLS-DA法區分2種不同地區煙葉中性香味成分的差異，如圖3-a所示。該模型判別分析中R2x為0.787，R2y為0.994，Q2為0.959，因自變量R2和預測指數Q2均大于0.5，表明模型穩定可接受［13］。經過200次置換響應檢驗，模型的預測指數Q2與Y軸相交于負半軸（圖3-b），說明該模型擬合有效，不存在模型過擬合［14］，因此該模型結果可鑒別加拿大煙葉與云南煙葉的中性香味成分差異性。

通常認為VIP大于1可作為解釋區分2個不同樣本物質的差異性成分，因此以顯著性差異且重要性投影值大于1的中性香味成分（P<0.05且 VIP>1）為篩選標椎［13］（表1、圖3-c），進一步篩選加拿大與云南煙葉中關鍵差異性中性香味成分。由圖4可知，共篩選出18種關鍵差異性中性香味成分，其中類胡蘿卜素降解產物9種，西柏烯類降解產物1種，棕色化反應產物類2種，苯丙氨酸類降解產物2種，其他類4種。聚類熱圖分析表明，區域A為加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮；區域B為云南煙葉中含量較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇。

類胡蘿卜素類降解形成的香味成分閾值低、刺激性小、香氣質好、對煙葉香氣貢獻率大，是影響煙葉香氣質和香氣量的重要組分［15］。巨豆三烯酮具

有煙草香和辛香底韻，具有增強煙香、調和煙氣的作用［16］，巨豆三烯酮的4個同分異構體在云南煙葉中顯著存在，但相關研究表明，含量最高的巨豆三烯酮b對煙葉香氣質有負向作用［17］，也側面凸顯卷煙抽吸品質是多種致香物質及其含量協同作用的結果［18］。李章海等提出并建立了9種中性香氣成分與煙葉香型指數之間的回歸模型，其中茄酮對濃香風格貢獻較大，大馬酮及棕櫚酸甲酯對清香風格貢獻較大［19］，本研究結果與之相一致。茄酮作為典型的類西柏烷類物質，它可以調和香氣，從而使香氣更加持久。徐秀娟等研究發現，糠醛與卷煙抽吸透發性關系密切［20］，而本研究的加拿大與云南煙葉中糠醛含量呈極顯著性差異（P=0.003<0.01），這或許是加拿大煙葉香氣濃郁，透發性強的原因之一。苯乙醇帶有甜香、堅果香，苯乙醛具有花香、清甜香，苯丙氨酸類降解產物貢獻云南煙葉的果香、清香風格［21-22］。加拿大煙葉其他類差異中性香味成分氧化石竹烯、α-石竹烯、α-香附酮皆為倍半萜類化合物，倍半萜類化合物可以增加香氣的透發持久性。

3? 結論

通過SDE和LLE獲得了加拿大和云南煙葉的中性成分，GC-MS分析測定了不同煙葉中性香氣成分的種類和含量。 2 種煙葉共檢測出69種中性香味物質，加拿大煙葉共鑒定出59種中性香味成分，云南煙葉共鑒定出63種，成分種類基本相似，但各類物質的含量存在差異性；以P<0.05且VIP>1為標準，通過OPLS-DA法鑒別加拿大煙葉與云南煙葉的中性香味成分的差異性，篩選得到18種差異中性香味成分，其中云南煙葉中含量較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇；加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。

本試驗僅對比分析了加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異性，初步明確了2種煙葉不同風格特征的中性香味物質基礎，為加拿大煙葉的替代工作提供了有效的數據支撐。但卷煙品質的優劣是多種致香成分協同作用的結果，后續研究會進一步增加香味成分種類，如酸性、堿性、糖苷、糖酯類化合物等。并結合活性閾值和分子感官科學，以特征化學成分為原料模擬調香，使優質進口煙葉特征風格再現，從而降低國內優質卷煙發展對進口煙葉的依賴性，為凸顯及固化產品風格特征提供技術保障。

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